新生小鼠皮肤发育与毛囊发生的组织形态学变化及分期

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.36.013

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
角质细胞(Keratinocyte)：所形成的天然高分子纤苎是头发的主要成分，角质细胞存在于人的头部表皮，可以产生多种角质细胞，角质层细胞起到非常重要的保护作用。角质层的细胞含有8-10 nm的角蛋白丝，形成一种天然屏障，可以防止大自然中的各种物理、化学、微生物和水的入侵，也能防止紫外线摄入皮肤深层。
毛囊：在真皮乳头层里，毛根被内、外毛鞘包围，外毛鞘又被结缔组织细胞包围，形成口袋状，称毛囊。毛囊是包围在毛发根部的囊状组织，内层是上皮组织性毛囊，外层是结缔组织性毛囊，内层与表皮相连，外层则与真皮相连。毛囊由毛杆，毛凸，毛球，毛乳头，毛基质等部分组成。神经纤维末梢使毛囊具有感觉的功能，动脉和静脉毛细血管丛给毛囊提供血液。毛囊的最深处是位于角质层3-7 mm的毛乳头，它含有神经和血管，向毛杆提供养分。毛囊的发育经过表皮和真皮之间一系列复杂的相互作用而形成，而具有周期性。

摘要
背景：虽然小鼠皮肤在胚胎期的形态学形成和生长发育的规律已有较多报道，但对出生后小鼠皮肤发育与毛囊发生的组织形态学演变过程的差异性尚未被完全揭示。
目的：分析新生小鼠皮肤发育与毛囊发生的组织形态学变化过程及其规律。
方法：采用常规石蜡包埋切片和苏木精-伊红染色技术，应用Image J软件测量分析小鼠出生后第1-12天背部皮肤厚度；在光学显微镜下观察毛囊的组织形态结构，统计毛囊及“囊泡样”结构的数量；根据毛囊发生特点分为4期，并与Ralf Paus分期对比分析。
结果与结论：①第1-4天为毛囊形成早期，小鼠出生后当天皮肤最薄为(405.36±26.60) μm，皮下无脂肪组织，表皮层可见少许基板毛球；②第2天皮肤明显增厚为(927.11±27.25) μm，真皮成纤维细胞增多，基板角质细胞从表皮基底膜下移，形成毛乳头；③第3，4天皮肤变薄(738.60±82.07)μm，毛囊增多，毛球膨大，真皮根鞘覆盖真皮层；④第5-7天毛囊形成中期，第5天皮肤再次增厚，第7天达峰值(2 369.57±34.06) μm，毛囊及“囊泡样”结构数量增多，毛球增多，其近端部分突出，真皮内根鞘伸入表皮层形成毛根，真皮根鞘分化形成外根鞘，内根鞘延伸到深层，形成完全封闭的毛发矩阵；⑤第8，9天毛囊形成后期，皮肤厚度分别下降至(1 743.37±75.05) μm和(1 987.07±18.65) μm，毛乳头被毛母质所包围，毛管、毛干逐渐形成，毛干顶端通过毛管长出内根鞘，内根鞘进入毛发深层，形成更多毛根；⑥第10-12天毛囊成熟期，皮肤厚度增加至(2 399.33±27.00) μm，毛囊及“囊泡样”结构数量均达到近30个，毛干长度加大，达到皮下肌肉层，毛干通过毛管向上生长并穿过表皮层形成肉眼可见的完整毛发；⑦结果表明，新生小鼠背部皮肤发育与毛囊发生存在同步性和非同步性，呈向上的曲线形。毛囊发生分化过程存在非均衡性和差异性，毛囊分期对观察毛囊发生分化过程有实用价值。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-5888-9146(施恩)

关键词: 组织构建, 组织工程, 新生小鼠皮肤, 毛囊, 组织形态学, 分期

Abstract:

BACKGROUND: There are many researches on the mouse skin morphology and development in embryonic period, but we have a poor understanding of the histomorphological evolution process of the skin and hair follicle after birth.
OBJECTIVE: To explore the morphological changes and rules of the newborn mouse skin and hair follicle development.
METHODS: The thickness of the back skin from the 1-12-day-old mice was analyzed using Image J software through conventional paraffin-embedded section and hematoxylin-eosin staining methods. The morphology of the hair follicle was observed under an optical microscope, and the number of hair follicles and vesicle-shaped structures were recorded. The development of hair follicles according to the developmental characteristics was divided into four periods, in comparison with Ralf Paus staging.
RESULTS AND CONCLUSION: On the early stage of hair follicle formation (1-4 days), the newborn mice appeared with thinnest skin [(405.36±26.60) μm in thickness] on the day of birth, and there was no adipose tissue in hypodermis and few hair bulbs in epidermis. On day 2, the skin was thickened to (927.11±27.25) μm, with more dermal fibroblasts, and the horny cells from the stratum basale migrated to forming hair papilla. On days 3-4, the skin was thinned to (738.60±82.07) μm, increasing hair follicles and expanded hair bulbs were observed, with the dermis covered by dermal sheath. On the middle stage of hair follicle formation (5-7 days), the skin was thickened again on day 5, and became thickest [(2 369.57±34.06) μm in thickness] on day 7, there were increased number of hair follicles, hair bulbs and vesicle-shaped structures, the internal dermal sheath was extended into the epidermis to form hair roots, the dermal sheath was differentiated into external root sheath, and the internal root sheath extended deeply to form a closed germinal matrix. On the later stage of hair follicle formation (8-9 days), the skin thickness was decreased to (1 743.37±75.05) μm on day 8 and (1 987.07 ±18.65) μm on day 9; the hair papilla was surrounded by hair matrix; hair canal and hair shaft gradually formed, and the growing internal root sheath extended into the deep layer, forming more hair roots. On the maturation sage of hair follicle (10-12 days), the skin was thickened to (2 399.33±27.00) μm; the number of both hair follicles and vesicle-shaped structures was about 30; the hair shaft lengthened, reaching the muscle layer, which grew upward through the hair canal and further crossed the epidermis to form the hair that could be observed by the naked eye. These findings suggest that there is synchronical or non-synchronical correlation between the skin development and hair follicle formation at the neonatal mouse back, presenting with the ascendant curve. The development process of hair follicle is imbalanced and different, and staging of hair follicle formation is available for observing the differentiation progress of hair follicle.

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Key words: Mice, Skin, Hair Follicle, Histology, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

施恩，刘英芹. 新生小鼠皮肤发育与毛囊发生的组织形态学变化及分期[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(36): 5812-5817.

Shi En1, Liu Ying-qin2. Histomorphological changes and stage development of the skin and hair follicle in neonatal mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(36): 5812-5817.

图/表（结果） 3

2.1 新生小鼠不同天数背部皮肤厚度变化采用Image J软件测量出生后第1-12天36只新生小鼠背部皮肤厚度，并计算出其均值及标准差，结果见表1。

小鼠出生后当天背部皮肤最薄，仅(405.37±26.60) μm，颜色呈肉红色，有细纹皱褶，松弛，菲薄，透明度较高。第2-4天皮肤明显增厚，并出现厚薄交替现象；第2天皮肤透明度明显下降，皮肤增厚，皱褶变浅；第3天皮肤颜色变浅，松弛度下降，透明度继续下降；第4天皮肤颜色、松弛度及透明度均无明显变化。随着新生小鼠日龄的增长，第5-7天皮肤厚度生长速度明显加快，皮肤颜色开始变浅，皱褶数量逐渐减少、凹陷变浅，并趋于平坦；第7天皮肤厚度达峰值(2369.57±34.06) μm(图1)，第8，9天皮肤厚度再次变薄，皮肤呈粉红色。第10-12天皮肤厚度开始逐渐增厚，并趋向稳定状态，皮肤表面可见白色毛发生长。表明：皮肤组织发育厚度随新生小鼠日龄增长而逐渐增厚，其演变过程为相互依存的正相关性，所有散点均呈直线性上升趋势(r= 0.922，P < 0.001)(图2)。

2.2 毛囊发生的组织形态学及其分期实验根据光学显微镜下所观察的新生小鼠不同天数背部皮肤毛囊发生的组织形态学变化特点，即从基板毛球(hair bulb，HB)形成到毛干(hair shaft，HS)长出表皮层形成完整毛发过程(图3，4)，并参考Ralf Paus分期标准^[4]，将其分化演变过程分为4期(图5)。

新生小鼠出生后第1-4天为毛囊形成初期：第1天皮下表皮角质细胞表皮的基底和位于基底层上方的细胞层可观察到少许形态结构不完整，边界清晰的“核样”聚集结构，即基板毛球。第2天真皮成纤维细胞数量增多，并接近表皮厚度，密集上皮细胞与间叶细胞交互，基板角质细胞从表皮基底膜下移，形成毛乳头(dermal papilla，DP)，并观察到少许“囊泡样”结构。第3天毛胚芽发育成更加突出和扩大，上皮细胞增殖，在真皮基底层表皮角质细胞形成膨大的毛球，并出现真皮根鞘，真皮深层及皮下组织为脂肪组织及胶原纤维和弹性纤维交织排列。第4天形成更多膨大的毛球，毛乳头呈球形，真皮根鞘覆盖整个真皮层。

新生小鼠出生后第5-7天为毛囊形成中期：毛囊呈上升线性生长，第5天毛囊生长速度明显加快，毛球增大的近端部分突出，内根鞘(Inner root sheath)在毛乳头周围形成毛发矩阵。第6天毛球增多，真皮内根鞘伸入表皮层形成毛根，真皮根鞘分化形成外根鞘(Outer root sheath)，可见黑色素颗粒形成，椭圆形毛乳头松散一致性，形成完全封闭的毛发矩阵，“囊泡样”结构明显增多。镜下可见个别毛干。第7天毛乳头继续变薄、变细、变长，内根鞘延伸到深层。

新生小鼠出生后第8，9天为毛囊形成后期：毛乳头几乎完全被毛母质所包围，毛管、毛干逐渐形成，毛干顶端通过毛管长出内根鞘，内根鞘进入毛发深层，形成更多毛根。

新生小鼠出生后第10-12天为毛囊成熟期：毛干生长的长度最大，达到皮下肌肉层，毛干通过毛管向上生长并穿过表皮层形成肉眼可见的完整毛发。表明新生小鼠背部皮肤毛囊从第10天进入成熟生长期。小鼠皮肤毛囊的组织形态学是由真皮细胞构成毛乳头和连接组织鞘，上皮细胞则构成外根鞘、内根鞘、毛母质(Hair matrix)和毛干等。毛囊在胚胎时期由表皮细胞与真皮细胞交互而成，并形成独立的毛管，毛囊的毛球直径较大，毛囊长度与直径较长，且存在一定弯曲度。毛囊尖端角质化纤维进入毛管尖端并穿出表皮浅层显露在皮肤表面形成毛发。此外，在毛囊发育分化过程中，还观察到部分“囊泡样”结构逐渐形成毛囊结构，但其毛球的直径较小，位置较为表浅。

2.3 新生小鼠不同天数背部皮肤毛囊的数量变化新生小鼠背部皮肤毛囊发生、发育过程是随时间推移而分化成熟，毛囊及“囊泡样”结构(图6)的均数及总数均呈上升“波浪”状(表2)。小鼠出生后当天仅观察到少许边界清晰的“核样”聚集结构，即基板毛球。第2天观察到毛囊及“囊泡样”结构。第3天“囊泡样”结构数量增多，而毛囊滞后。第4天毛囊及“囊泡样”结构均增加。“囊泡样”结构的数量则在第8天达到峰值，毛囊减少。第9天毛囊数量增加，毛囊发育处于毛囊形成后期。毛囊数

量在第10天达到峰值并处于相对稳定状态，此时毛囊发育已进入成熟生长期。结果表明：新生小鼠背部皮肤同一部位、同一天、同一视野中毛囊及“囊泡样”结构的发生过程存在非均衡性(图7)，其分化程度也存在差异性(图8)。可能与“囊泡样”结构部分转化形成毛囊，部分则发生凋亡或衰退有关。

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引言

材料方法

1.1 设计单一样本观察。

1.2 时间及地点实验于2016年10月在桂林医学院基础医学院完成。

1.3 材料选择6-8周性成熟SPF级昆明属种小鼠36只，体质量25-30 g，来源于桂林医学院动物实验中心(实验动物许可证号：SCXK桂2013-0001)。将雌雄小鼠按2∶1比例合笼喂养，并给予标准动物饲料喂养，待雌性小鼠发情后，喂食瓜子或熟蛋黄，以提高其受孕率。雌雄小鼠交配后，翌日雌性小鼠见阴道有白色栓即判定其为妊娠第1天，妊娠后立即将雌鼠分笼单独饲养19-21 d至分娩。从小鼠出生当天，即开始采集标本至新生小鼠第12天，每天处死3只并分别编号。本实验严格遵循实验动物福利伦理的原则。

1.4 实验方法

1.4.1 取材将已被处死的新生小鼠切取其背部皮肤组织用40 g/L多聚甲醛固定后，将皮肤组织标本进行流水冲洗，采取常规脱水、透明和石蜡包埋切片，厚度4 μm，组织切片脱蜡至水，常规苏木精-伊红染色，中性树胶封固，光学显微镜下观察。

1.4.2 主要观察指标与测量大体观察出生后第1-12天新生小鼠皮肤颜色、皱褶、透明度、毛发等变化情况，观察其皮肤。每日取3只新生小鼠背部皮肤组织苏木精-伊红染色切片，分别编为1，2，3号，每只小鼠随机选择3个视野，采用Image J软件依次测量新生小鼠背部皮肤厚度，取其平均值，单位：μm；再根据每只小鼠皮肤均值计算出3只小鼠皮肤厚度的均值及标准差，以x(_)±s表示，连续测量 12 d。新生小鼠日龄与皮肤组织发育厚度采用Pearson法直线回归分析，以P < 0.05为差异有显著性意义。在光学显微镜下放大100倍观察新生小鼠背部皮肤组织苏木精-伊红染色切片，放大200倍观察毛囊组织形态结构并摄像记录；随机选择3个不同视野观察统计毛囊及“囊泡样”结构的数量。

1.5 统计学分析所获数据采用SSPS 18.0 软件进行统计分析。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

3.1 研究新生小鼠皮肤发育与毛囊发生的重要性小鼠是目前公认最常用的系统生物学和基础医学研究的动物模型^[5]。小鼠在胚胎期内皮肤的表皮及毛囊便定位起源于外胚层，而真皮基底层则定位起源于中胚层，表皮与真皮之间的复杂交互，促进了毛球部真皮层的内层上皮组织和外层结缔组织所包裹的一团间充质细胞构成毛乳头^[6]。毛乳头是毛囊最重要的部分，毛乳头细胞与上皮细胞通过Wnt、TGF-β、Notch等多重信号传导通路的精准调控，而促进毛囊的发生、发育、分化、自我更新和周期性生长^[7-8]。但由于毛囊发生的过程极为复杂，除小鼠本身不同部位皮肤的因素外，同时还受取材、造模、染色等研究方法等多种因素影响，从而导致研究结果存在较大差异。因此，对小鼠皮肤发育与毛囊发生的关系以及自我更新和周期性生长机制，迄今尚不十分清楚，也是影响该研究发展的瓶颈。Paus等^[4]在对小鼠皮肤毛囊生长发育的形态结构研究中，发现毛囊周期性变化的传播波可能起源于小鼠背部，对取材小鼠背部皮肤研究提供了参考依据。本研究采用石蜡切片和苏木精-伊红染色技术，观察分析出生后第1-12天小鼠背部皮肤发育与毛囊发生的同步性和非同步性演变规律，探讨毛囊发生的组织形态学特点及其分期，明确新生小鼠皮肤厚度与毛囊数量之间的关系，掌握新生小鼠毛囊发生的分期特点，对识别毛囊的组织形态学结构及其演变过程极为重要，为进一步研究新生小鼠皮肤发育与毛囊发生的分子调控机制和信号传导通路提供有价值的参考。

3.2 新生小鼠背部皮肤发育与毛囊发生数量的关系新生小鼠皮肤发育的厚度与表皮及真皮组织结构的致密度密切相关^[9]。表皮由角质层、透明层、颗粒层、棘层和基底层等复层上皮组成。真皮位于表皮下，由致密的结缔组织构成，分为乳头层和网状层，乳头层与表皮相连形成的圆锥状隆起为真皮毛乳头。毛囊发生分化的进程则依赖表皮上皮细胞与真皮间叶细胞共同组成毛乳头细胞之间相互作用的结果^[10]。因此，皮肤发育的厚度与毛囊发生的数量存在一定相关性。本研究表明：小鼠出生后当天背部皮肤最薄，且仅有少量边界清晰的“核样”聚集结构，即基板毛球。第4天毛囊发育完全，真皮根鞘覆盖整个真皮层。与Weinberg等^[11]研究结果基本一致。张俊霞等^[12]研究表明小鼠出生后第7天其背部皮肤毛囊进入快速发育时期，毛囊数量显著增多，趋于稳定，并逐渐形成毛发，毛发生长变缓。本研究表明：小鼠出生后前4 d背部皮肤发育呈曲线形生长，第5-7天皮肤发育速度明显加快，第7天皮肤厚度达峰值，呈上升线形，毛囊及“囊泡样”结构数量也随之增加。与王博等^[13]研究新生小鼠在第7天皮肤厚度达最高值，毛囊密度也随之增加的结果基本一致。但第8，9天皮肤厚度又变薄，而毛囊及“囊泡样”结构数量并未减少，第10天新生小鼠背部皮肤厚度和毛囊及“囊泡样”结构的数量均达峰值，并在皮肤表面观察到白色毛发生长，并逐渐浓密，第11、12天白色毛发基本长齐。本研究表明1-9天新生小鼠皮肤发育的厚度变化呈上升曲线形，而毛囊发生的数量呈向上“波浪”状。表明毛囊发生的数量与皮肤发育的厚度存在同步性和非同步性的演变规律。此外，在出生后1-12天新生小鼠背部皮肤毛囊发生过程中，观察到同一部位、同一天和同一视野中大部分毛囊发生分化较成熟，而少部分毛囊发育则滞后或不够成熟。而“囊泡样”结构部分转化为毛囊，部分则发生凋亡或衰退。表明毛囊及“囊泡样”结构的发生过程均存在非均衡性，其分化程度也存在一定差异性，可能与毛囊及“囊泡样”结构所接受基因调控程度、信号强度及传导通路不同有关^[14]。

3.3 新生小鼠毛囊的组织形态学变化及其分期虽然不同部位的毛囊，其大小和形态有所不同，但由表皮层紧密包绕毛干的外根鞘、内根鞘和毛母质的基本结构相似，均由表皮层和间质层围绕毛发构成的管状囊样结构^[15]。毛母质由幼稚的上皮细胞组成，不断分裂增殖，向上移动，分化为毛根和上皮根鞘细胞，毛母质细胞间散在分布黑色素细胞。内根鞘由亨勒(Henley)层、赫胥黎(Huxley)层和鞘小皮层组成，每层由各自特有的上皮细胞紧密排列而成，在皮脂腺开口处与凹陷的表皮相连^[16]。外根鞘与抗原细胞和黑色素细胞调节诱导表皮生长，毛根外面包裹毛囊，毛根和毛囊末端膨大形成毛球。外根鞘隆突部细胞聚集，是目前公认的毛囊表皮干细胞汇集区^[17]。随着毛囊生长达真皮深层，皮脂腺、竖毛肌等附属结构也完全形成，外根鞘在

皮脂腺开口处与凹陷的表皮相连，位于皮脂腺开口与立毛肌毛囊附着处之间的内根鞘对刺激真皮毛乳头和真皮鞘细胞诱导毛囊上皮细胞分化，维持毛囊的发生、生长、发育以及感应能力至关重要^[18]。真皮鞘细胞是毛乳头细胞的前体细胞，具有“免疫豁免”特性，毛乳头细胞是维持毛发生长和毛囊再生的功能细胞^[19]。Paus等^[4]对C57BL/6J小鼠毛囊发生分化过程分为9个时期，并认为新生小鼠毛囊的时空定位直接关系到毛发生长周期内的每个细节。为了便于观察、分析常用的实验昆明新生小鼠背部皮肤发育与毛囊发生分化的演变过程，本研究参考Ralf Paus分期标准，并根据毛囊发生过程中不同时段所形成的组织形态结构特点，将其分为毛囊形成早期、中期、后期和毛囊成熟期等4期。新生小鼠从出生后1-4天为毛囊形成早期，与Ralf Paus分期的第0-3期基本一致。新生小鼠出生后第5-7天为毛囊形成中期，是真皮毛乳头的发育矩阵源和循环传播地，相当于Ralf Paus分期的第4-6期。第8，9天为毛囊形成后期，与Ralf Paus分期第7期相对应。第10-12天为毛囊发育成熟期，毛干通过毛管向上生长并穿过表皮层形成肉眼可见完整浓密的毛发，标志着毛囊发育分化进入成熟生长期，即Ralf Paus分期第8期。作者认为：Ralf Paus分期虽然是针对C57BL/6J小鼠的毛囊发生分化过程的描述，且非常详细，对专门研究C57BL/6J小鼠毛囊的组织形态结构非常有价值，但其分期过于复杂，其毛囊发育与皮肤厚度与昆明小鼠存在一定差异性，且不适宜昆明小鼠毛囊发生分期的研究。因此，研究对昆明新生小鼠皮肤毛囊发生的分期，是在参考Ralf Paus分期的基础上建立的，虽然还不够详细和完善，但却囊括了毛囊发生分化的早、中、后和成熟期全过程，且方法简单，便于记忆、较为实用，可作为研究者参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程