高效Pdx1/insulin双报告基因载体的构建及其初步应用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.12.017

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (12): 1903-1908.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.12.017

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高效Pdx1/insulin双报告基因载体的构建及其初步应用

叶玲玲1，李世崇1，孙海燕2，蓝三春3，陈昭烈1，王启伟1

1军事医学科学院生物工程研究所，北京市 100071；解放军307医院，2口腔科，3造血干细胞移植科，北京市 100071

收稿日期:2017-03-05 出版日期:2017-04-28 发布日期:2017-05-16
通讯作者: 陈昭烈，博士，研究员，军事医学科学院生物工程研究所，北京市 100071 并列通讯作者：王启伟，博士，副研究员，军事医学科学院生物工程研究所，北京市 100071
作者简介:叶玲玲，女，1979年生，辽宁省沈阳市人，汉族，2011年军事医学科学院毕业，博士，助理研究员，主要从事细胞生物学和分子生物学方面的研究。
基金资助:
国家自然科学青年基金项目(81302689)

Construction of a high efficient pancreatic duodenal homeobox 1/insulin dual-reporter vector and its preliminary application

Ye Ling-ling1, Li Shi-chong1, Sun Hai-yan2, Lan San-chun3, Chen Zhao-lie1, Wang Qi-wei1

1Institute of Biotechnology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China; 2Department of Stomatology, 3Hematopoietic Stem Cells Transplantation Center, the 307th Hospital of Chinese PLA, Beijing 100071, China

Received:2017-03-05 Online:2017-04-28 Published:2017-05-16
Contact: Chen Zhao-lie, M.D., Researcher, Institute of Biotechnology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China Corresponding author: Wang Qi-wei, M.D., Associate researcher, Institute of Biotechnology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China
About author:Ye Ling-ling, M.D., Assistant researcher, Institute of Biotechnology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation for the Youth of China, No. 81302689

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
Pdx1(pancreatic and duodenal homeobox1)：即胰十二指肠同源盒1，又称胰岛素启动因子1(IPF-1)。Pdx1在胰腺的发育(包括胰岛β细胞的成熟)以及十二指肠的分化中具有重要作用。胚胎发育过程中Pdx1 首先表达在前肠后部的内胚层，随后表达Pdx1的内皮细胞发育成胰芽，进而发育成胰腺包括外分泌部、内分泌部以及导管细胞。研究表明Pdx1纯合缺失小鼠可以出现早期胰芽发育受阻，导致胰腺发育不全，出生后不久即死于高血糖血症。
诱导多能干细胞：是由日本学者Takahashi和Yamanaka首先建立的。体外采用4个关键性因子将小鼠成纤维细胞重编程为胚胎干细胞样细胞。诱导多能干细胞避免了胚胎干细胞所遇到的伦理道德问题，而且由于来源自体细胞，因此不存在自身移植免疫排斥反应。诱导多能干细胞具有自我更新和多向分化的潜能，在再生医学、疾病模型和药物筛选中具有重要作用。

摘要
背景：胰岛细胞移植是治疗1型糖尿病最有效的方法之一，然而移植细胞来源短缺限制了其临床应用。多能干细胞有望成为胰岛细胞移植的理想种子细胞，但其向胰岛β细胞分化是一个复杂的过程。
目的：构建高效Pdx1/insulin双报告基因载体，探讨其实时监测诱导多能干细胞向胰岛β细胞分化中关键性基因表达的可行性。
方法：首先在pTiger载体上引入嘌呤霉素抗性，然后以646 bp的小鼠Ins1启动子替换了原来载体上410 bp的小鼠Ins1启动子，获得高效Pdx1/insulin双报告基因载体。最后，将载体导入INS-1细胞和诱导多能干细胞，验证其功能。
结果与结论：①实验成功构建了高效Pdx1/insulin双报告基因载体；②在INS-1细胞中验证了载体获得嘌呤霉素抗性，提高了insulin表达效率，并在INS-1细胞中检测到Pdx1和insulin的表达；③实验初步证明了Pdx1/insulin双报告基因能够有效监测细胞分化过程中Pdx1和insulin基因的表达。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-0430-3802(王启伟)

关键词: 组织构建, 组织工程, 诱导多能干细胞, Pdx1, insulin, 双报告基因, 胰岛β细胞, 诱导分化, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Islet beta cell replacement therapy is one of the most promising approaches for treating type 1 diabetes mellitus. However, its large scale application is hampered by a shortage of islet beta cells for transplantation. Pluripotent stem cells are one of ideal seed cells for islet beta cell replacement therapy, but pancreatic beta-cell differentiation is time-consuming and labor-intensive.
OBJECTIVE: To construct a high efficient pancreatic and duodenal homeobox 1 (Pdx1)/insulin dual-reporter vector and to monitor the key genes expression during pancreatic beta-cell differentiation from pluripotent stem cells.
METHODS: In order to construct a high efficient Pdx1/insulin dual-reporter vector, puromycin resistance gene was firstly introduced into pTiger vector, and then the original 410 bp mouse Ins1 promoter of the vector was replaced by 646 bp mouse Ins1 promoter. Finally, the dual-reporter vector was transduced into INS-1 and human induced pluripotent stem cells to testify its function.
RESULTS AND CONCLUSION: The high efficient Pdx1/insulin dual-reporter vector was constructed successfully. The vector successfully acquired puromycin resistance gene and high gene expression efficacy of insulin in INS-1 cells. The specific gene expression pattern of Pdx1/insulin was first found in INS-1 cells. To conclude, the real-time monitoring function of Pdx1/insulin expression is preliminarily confirmed during pancreatic beta-cell differentiation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Multipotent Stem Cells, Insulin, Genes, Reporter, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

叶玲玲，李世崇，孙海燕，蓝三春，陈昭烈，王启伟. 高效Pdx1/insulin双报告基因载体的构建及其初步应用[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(12): 1903-1908.

Ye Ling-ling1, Li Shi-chong1, Sun Hai-yan2, Lan San-chun3, Chen Zhao-lie1, Wang Qi-wei1. Construction of a high efficient pancreatic duodenal homeobox 1/insulin dual-reporter vector and its preliminary application[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(12): 1903-1908.

图/表（结果） 1

2.1 Pdx1/Insulin双报告基因载体的构建首先，在pTiger-Pdx1::mRFP-Ins1::EGFP载体中引入嘌呤霉素抗性，通过PCR成功地从pLKO.1载体上扩增了1 236 bp的hPGK-Puromycin片断(图1A)。hPGK-Puromycin片断和pTiger载体分别经PmeⅠ/NotⅠ双酶切，胶回收纯化后，用T₄ DNA连接酶将目的片断连入pTiger载体。经质粒转化、涂板后，随机挑取6个克隆进行PCR鉴定，共获得4个阳性克隆(图1B)。4个阳性克隆经PmeⅠ/NotⅠ双酶切进一步鉴定后，获得1个阳性克隆(图1C)。经测序证明此克隆序列完全正确。

为提高pTiger载体的insulin表达效率，首先从p-Ins1::hrGFP载体上通过PCR成功地扩增了1 411 bp的Ins1-hrGFP片断(图2A)，Ins1-hrGFP片断和pTiger载体分别经NheⅠ/PemⅠ双酶切，胶回收纯化后，用T₄ DNA连接酶将目的片断连入pTiger载体。经质粒转化、涂板后，随机挑取4个克隆进行PCR鉴定，共获得3个阳性克隆(图2B)。3个阳性克隆经NheⅠ/PemⅠ双酶切进一步鉴定后，获得2个阳性克隆(图2C)。经测序证明2个克隆的序列完全正确。

至此，成功地在原来pTiger载体上引入嘌呤霉素抗性，并以Ins1-hrGFP替换原来的Ins1-EGFP，构建高效的pTiger-Pdx1::mRFP-Ins1::hrGFP- hPGK::Puromycin载体(图3)。

2.2 双报告基因载体在INS-1中的表达通过观察细胞内荧光蛋白的表达，验证双报告基因载体在细胞内的功能。INS-1细胞固有表达Pdx1和insulin基因。病毒感染后24 h，细胞内开始有红色荧光蛋白(RFP)和绿色荧光蛋白(GFP)表达，提示细胞表达Pdx1和insulin基因。48-72 h细胞内荧光蛋白表达强度逐渐增强，而后荧光强度无显著变化。病毒感染后4 d，约有15%的细胞无红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白表达，这可能是由于病毒感染效率所致。随后对细胞进行加压筛选，在细胞培养基中添加1 mg/L嘌呤霉素，正常未感染病毒的INS-1细胞作为筛选对照组。三四天后对照组细胞全部死亡，而病毒感染细胞由于表达嘌呤霉素抗性基因，细胞能够正常生长，只是细胞增殖速度有所减缓(图4)。依据细胞内荧光蛋白信号强度表达的差异可将INS-1细胞分为3种类型：Pdx1/insulin高表达(Pdx1^highinsulin^high)、Pdx1/Insulin中等表达(Pdx1^mediuminsulin^medium)和Pdx1低表达/insulin低或无表达(Pdx1^lowinsulin^-)(图4)。

以上这些结果表明Pdx1/insulin双报告基因与细胞内基因表达水平有较好的相关性。

2.3 实时监测胰岛细胞分化中的特异性基因的表达为观察双报告基因能否实时监测胰岛β细胞定向分化中特异性基因的表达，以Pdx1-Ngn3-MafA(PNM)诱导人诱导多能干细胞向胰岛β细胞分化来验证其功能。Pdx1在胚胎发生中对胰芽的形成和随后的胰岛β细胞的发生具有重要作用；Ngn3在胚胎胰腺内分泌前体细胞的形成中发挥重要作用；MafA对胰岛β细胞的成熟具有重要作用^[28^，^35-36]。细胞诱导分化中，首先以表达PNM和双报告基因的病毒感染人诱导多能干细胞。病毒感染后24 h，细胞更换新鲜体积分数为10%胎牛血清的DMEM-HG继续培养。细胞诱导四五天时可见有类似胰岛样集落形成，而后集落逐渐长大。至第9天时可见集落内细胞表达红色荧光蛋白，提示细胞内有Pdx1表达(图5)；至第13天可见集落内细胞同时表达红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白，提示细胞同时表达Pdx1和insulin(图5)。

经RT-PCR检测进一步确认了Pdx1和insulin的表达(图6)。这些结果提示，双报告基因能够有效地实时监测人诱导多能干细胞分化为胰岛β细胞过程中Pdx1和insulin表达。

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引言

糖尿病的发病率正在逐年显著增加，糖尿病已经成为严重的世界性卫生问题。2013年《美国医学会杂志》发表的研究表明，中国糖尿病的发病率高达11.6%，国内糖尿病患者约有1.14亿人，发病率高居世界首位^[1]。大部分1型糖尿病是由于胰岛β细胞受到自身免疫反应攻击所导致。当残存的胰岛β细胞数量少于胰岛细胞总数的10%-20%就会表现出临床症状^[2]。目前，胰岛β细胞移植被认为是治疗1型糖尿病最有效的方法之一。然而，大规模胰岛β细胞移植的应用却受到细胞来源短缺和终生使用免疫抑制剂等限制^[3-5]。为此，寻找和建立胰岛β细胞的替代资源具有重要的经济价值和社会意义。

近年来，多能干细胞定向分化为胰岛β细胞的研究取得了较大的进展^[6-15]，有望成为临床胰岛细胞移植的理想细胞来源。多能干细胞包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞^[16-17]。尤其是诱导多能干细胞可由自身体细胞经重编程而获得，具有分化成3个胚层多种细胞类型的能力^[18-26]，同时避免了胚胎干细胞的伦理道德问题，因此具有更广阔的应用前景。目前多能干细胞分化为胰岛β细胞的方法主要包括两类：一类是采用调控胰岛β细胞发生特异性转录因子法^[27-29]；另一类是细胞因子和小分子化合物组合法^[15^，^30-33]。基因诱导分化的方法具有特异性强、操作相对容易、成本较低等优点，但存在着基因整合的风险；细胞因子和小分子化合物组合法具有安全性较高，能够满足临床细胞治疗的需求，逐渐成为研究的热点领域。然而，在细胞诱导分化过程中涉及到的细胞因子和小分子化合物的种类较多，每种细胞因子和小分子化合物又有不同的最适作用浓度，不同来源及构建方法获得的诱导多能干细胞对细胞因子和小分子化合物会产生不同的反应。这些情况使得细胞诱导分化方法的优化变得低效、费时、费力。因此，建立一种实时活细胞监测系统，有效监测胰岛β细胞分化过程中关键性基因的表达，将有助于细胞诱导分化方案的优化。

实验构建高效Pdx1/insulin双报告基因载体，并用大鼠INS-1胰岛素瘤细胞验证其功能，揭示Pdx1和insulin在INS-1细胞中的表达特点。同时，应用Pdx1/insulin双报告基因载体将诱导多能干细胞诱导分化为胰岛β细胞，初步验证其功能的可靠性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计分子生物学及细胞形态学观察实验。

1.2 时间及地点于2014年5月至2016年5月在军事医学科学院生物工程研究所细胞工程研究室完成。

1.3 材料人胚胎肺成纤维细胞MRC5来源的诱导多能干细胞由军事医学科学院生物工程研究所细胞工程研究室构建；INS-1细胞由军事医学科学院野战输血研究所岳文教授惠赠；293FT细胞系来自美国ATCC细胞库；Essential 8培养基、DMEM-high glucose(HG)、RPMI1640和脂质体转染试剂Lipofectamine2000均购于Life Technologies；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒和FastQuant RT kit均购买于天根有限公司；Q5高保真DNA聚合酶、限制性内切酶和T₄连接酶均购买于NEB公司；大肠杆菌Tran10和2X Easy Taq^® PCR SuperMix Kit购买于北京全式金生物公司。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养人诱导多能干细胞培养于Essential 8培养基中，每日换液；INS-1细胞培养于RPMI1640培养基中，添加体积分数为10%胎牛血清、10 mmol/L Hepes、 2 mmol/L谷氨酰胺、2 mmol/L丙酮酸钠和0.1% β巯基乙醇，每3 d换液1次；293FT细胞培养于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM-HG培养基中，每3 d换液1次。

1.4.2 高效Pdx1/Insulin双报告基因载体的构建前期获得的pTiger-Pdx1::mRFP-Ins1::EGFP载体中，Insulin表达效率较低，而且无抗生素筛选标记。因此，实验替换了原来载体上的Ins1-EGFP，并且在Insulin启动子的下游引入嘌呤霉素(Puromycin)抗性，构建了具有抗性的高效Pdx1/Insulin双报告基因载体。首先从pLKO.1载体上PCR扩增1 236 bp的hPGK-Puromycin片断，并在其5’和3’分别引入PmeⅠ/NotⅠ酶切位点。然后，hPGK-Puromycin片断和pTiger载体经PmeⅠ/NotⅠ双酶切后，采用T₄ DNA连接酶将目的片断连入pTiger载体。最后经质粒转化、涂板，挑取阳性克隆，并进行PCR、酶切及测序鉴定。为提高pTiger载体的Insulin表达效率，从p-Ins1::hrGFP载体上PCR扩增了1 411 bp的Ins1-hrGFP片断，并在其5’和3’分别引入NheⅠ/PemⅠ酶切位点。最后以Ins1-hrGFP替换了原来pTiger载体上的Ins1-EGFP。

1.4.3 病毒包装及细胞感染 Pdx1/Insulin双报告基因慢病毒包装过程简述如下：病毒制备的前1 d，按照(4.0-5.0)×10⁶/10 cm培养皿的密度接种293FT细胞。制备病毒当日，将目的基因载体pTiger和包装质粒pCPR?Env和pCI-VSVG用脂质体Lipofectamine2000共转染293FT细胞。转染后48-72 h收集含有病毒颗粒的培养基上清， 1 500 r/min离心去除上清中悬浮的细胞及碎片。然后再以20 000 r/min，4 ℃离心2 h浓缩病毒。离心后弃掉上清，用4 mL培养基重悬病毒颗粒沉淀备用。Pdx1-Ngn3- MafA(PNM)反转录病毒的包装过程参见前期发表的文章^[34]。

细胞感染：INS-1细胞或人诱导多能干细胞接种于12孔板中，细胞达到60%-70%融合后，每孔以1 mL病毒浓缩液+4 mg/L的polybrene感染细胞，24 h后更换新鲜培养基，进行后续实验。

1.4.4 总RNA的提取和反转录聚合酶链反应(RT-PCR) 以Trizol试剂提取总RNA。根据Genbank中目的基因序列合成PCR引物。Pdx1上游引物：ATG AAG TCT ACC AAA GCT CAC GC；下游引物：TCT CTC GGT CAA GTT CAA CAT GA(产物长度201 bp)。Insulin上游引物：ACG AGG CTT CTT CTA CAC ACC CA；下游引物：TGT TCC ACA ATG CCA CGC TTC(产物长度147 bp)。GAPDH: 上游引物：CGA GAT CCC TCC AAA ATC AAG T；下游引物：TGA GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT(产物长度 196 bp)。以FastQuant RT kit去除基因组DNA污染并进行反转录获得cDNA，反应条件如下：42 ℃ 15 min，95 ℃ 3 min。以2×EasyTaq^® PCR SuperMix Kit进行PCR反应，反应条件如下：预变性94 ℃ 3 min，变性94 ℃ 30 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，35个循环，终延伸72 ℃ 5 min。

1.5 主要观察指标 ①INS-1细胞内荧光蛋白表达；②人诱导多能干细胞分化为胰岛β细胞过程中Pdx1和insulin的表达；③胰岛细胞相关基因的表达。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

胰岛细胞移植是目前治疗1型糖尿病最有效的方法之一，然而移植细胞来源的短缺限制了其临床应用。近年来干细胞研究的进展可望解决这一临床应用瓶颈。以多能干细胞为起始种子细胞诱导分化为胰岛β细胞将成为体外胰岛细胞移植的一个重要来源。目前在多能干细胞定向分化胰岛β细胞方法中，细胞因子和小分子化合物组合法因其临床安全性较高而备受关注，取得了较大的进展^[15^，^33]。然而，细胞因子和小分子化合物组合诱导方法的建立是一个费时、费力的复杂过程。因此，建立体外实时监测细胞分化的方法将有助于细胞诱导分化方案的优化，提高实验效率，节省人力和物力。

实验在前期工作的基础上建立了高效Pdx1/insulin双报告基因载体。首先，在原来载体上引入嘌呤霉素抗性基因，使载体具有了抗生素筛选标记，这将使后期构建表达Pdx1/insulin双报告基因人诱导多能干细胞系用于胰岛β细胞分化研究成为可能。将具有嘌呤霉素抗性基因载体转入INS-1细胞后，经嘌呤霉素加压筛选细胞能正常存活下来，证明了载体获得了嘌呤霉素抗性。其次，为提高载体上insulin的表达效率，以646 bp的小鼠Ins1启动子替换了原来载体上410 bp的小鼠Ins1启动子。由于延长小鼠Ins1启动子的长度，因此增加了insulin表达的效率和特异性，这可由载体在INS-1细胞内绿色荧光蛋白的高效表达得到证实。在验证Pdx1/Insulin双报告基因载体功能的实验中，作者首次发现了Pdx1和insulin在INS-1细胞中的表达特点。依据这2个基因在细胞中的表达差异，可将INS-1细胞分为3种类型：Pdx1/Insulin高表达(Pdx1^highinsulin^high)、Pdx1/insulin中等表达(Pdx1^mediuminsulin^medium)和Pdx1低表达/insulin低或无表达(Pdx1^lowinsulin^-)，这与小鼠MIN6细胞内Pdx1和insulin基因表达类似^[37]。INS-1细胞内Pdx1和insulin基因的表达差异是否与细胞的功能状态有关仍需进一步的研究。

最后，用PNM诱导人诱导多能干细胞定向分化为胰岛β细胞来验证载体是否能够实时监测胰岛β细胞的分化过程。作者观察到当细胞分化至第9天时可见集落内细胞表达红色荧光蛋白，提示细胞内有Pdx1表达；至第13天可见集落内细胞同时表达红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白，提示细胞同时表达Pdx1和insulin，这些结果初步证明了Pdx1/insulin双报告基因能够有效地监测细胞分化过程中Pdx1和insulin基因的表达。

综上所述，实验成功地构建了高效Pdx1/insulin双报告基因载体，并且初步证明此载体能有效地实时监测细胞分化过程中关键性基因的表达，这将有助于细胞诱导分化方案的优化，节省人力和物力资源。下一步将构建表达Pdx1/insulin双报告基因的人诱导多能干细胞系，系统研究细胞因子和小分子化合物组合法对不同人诱导多能干细胞系诱导分化方案的优化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

高效Pdx1/insulin双报告基因载体的构建及其初步应用

Construction of a high efficient pancreatic duodenal homeobox 1/insulin dual-reporter vector and its preliminary application

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