米诺环素缓释剂对炎症根尖周渗出液中白细胞介素17表达的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.10.006

摘要/Abstract

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文题释义：
米诺环素在口腔疾病中的应用：研究表明有效浓度的米诺环素可减少骨有机质的降解，影响破骨细胞的形态功能，抑制骨吸收，利于骨形成。米诺环素能显著抑制胶原酶的活性，阻止牙周组织的破坏，抑制胶原酶代谢，促进牙周组织再生，能显著缓解临床症状。近来有研究表明，米诺环素对慢性牙周炎疼痛症状的缓解及在牙周牙髓联合病变中辅助根管治疗都具有良好的疗效。目前国内外研究主要着眼于米诺环素应用在牙周疾病、牙周牙髓联合病变、干槽症、智齿冠周炎、种植体周围炎、义齿性口炎等疾患治疗，少见其在根管治疗中作为根管消毒药物的实验研究。

背景：米诺环素作为根管消毒药物，其疗效、安全性及免疫学评估尚需相应实验证明。
目的：观察米诺环素对根管渗出液体积及白细胞介素17水平的影响。
方法：试验组纳入根尖周病急性期需进行根管治疗的患者16例，随机分为2组，氢氧化钙组以氢氧化钙糊剂消毒根管，米诺环素组以米诺环素缓释剂软膏消毒根管，1周后复诊，检测根尖周指数、根尖周渗出液体积及白细胞介素17水平，完成根管充填；对照组纳入牙髓正常但需要进行根管治疗的患者16例，行一次性根管充填，检测根尖周指数、根尖周渗出液体积及白细胞介素17水平。
结果与结论：①试验组根尖周渗出液体积及白细胞介素17水平均高于对照组(P < 0.05)；②米诺环素组、氢氧化钙组治疗1周后的根尖周指数、白细胞介素17水平均低于治疗前(P < 0.05)；③米诺环素组与氢氧化钙组治疗1周后的根尖周指数、根尖周渗出液体积及白细胞介素17水平比较差异均无显著性意义；④结果表明，米诺环素通过抑制白细胞介素17的表达降低根尖周病根尖区炎症的渗出，有效治疗根尖周病。

ORCID: 0000-0001-6378-3493(贾智)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 口腔生物材料, 米诺环素, 氢氧化钙, 急性根尖周炎, 白细胞介素17, 根管治疗, 根管消毒

Abstract:

BACKGROUND: Experimental proof for the efficacy, safety, and immunological assessment is needed when minocycline is used for root canal disinfection.
OBJECTIVE: To investigate the effect of minocycline for root canal disinfection on levels of interleukin-17 in apical exudates of periapical periodontitis and periapical exudate volume.
METHODS: Sixteen patients with acute periapical periodontitis (16 teeth) scheduled for root canal therapy were enrolled and randomly divided into calcium hydroxide and minocycline groups, respectively, followed by root canal disinfection. One week after disinfection, periapical index, periapical exudate volume and interleukin-17 level were detected prior to the root canal filling. Another 16 patients with normal pulp vitality (16 teeth) scheduled for single root canal filling were enrolled as control group, in which periapical index, periapical exudate volume and interleukin-17 level were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: The periapical exudate volume and interleukin-17 level in the calcium hydroxide and minocycline groups were significantly higher than those in the control group (P < 0.05). The periapical index and interleukin-17 level in the calcium hydroxide and minocycline groups were decreased significantly at 1 week after root canal disinfection (P < 0.05), while there was no difference between these two experimental groups in the periapical index, periapical exudate volume and interleukin-17 level. To conclude, the use of minocycline significantly reduces interleukin-17 level and periapical exudate volume, and thus achieves effective outcomes in periapical disease.

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Key words: Root Canal Therapy, Root Canal Obturation, Minocycline, Interleukin-17, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

贾智，杜雨，杜媛，姜晨. 米诺环素缓释剂对炎症根尖周渗出液中白细胞介素17表达的影响[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.10.006.

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图/表（结果） 5

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引言

根尖周炎是指由于细菌等感染因素造成正常的组织结构被破坏^[1]。不同地区的流行病学研究表明根尖周炎的发生率为1.4%-8%^[2]。破骨细胞可影响骨的形成^[3]，同时对于牙周组织有重要的影响作用^[4-5]，如白细胞介素17、白细胞介素1、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α等，均可影响成骨细胞的分化，为骨吸收炎性因子^[6]。Th17是新近研究发现一种Th细胞亚类，可通过释放炎症因子而加强RANKL的信号传导。此外，活化Th17的RANKL表达水平比Th1、Th2高，可直接作用于破骨细胞前体细胞诱导破骨细胞的分化^[7]。在破骨细胞中，白细胞介素17通过调节Wnt信号通路影响骨的形成。有研究表明在慢性炎症性皮肤中，炎性因子白细胞介素17A抑制Wnt信号通路，导致骨组织的丧失，因此白细胞介素17A抑制剂的应用能抑制骨吸收^[8-9]。

完善的根管机械与化学预备可去除大部分根管内的细菌，根管治疗预备根管时，通过常规的根管机械预备仅可去除侵入到牙本质浅层的细菌，经调整冲洗液的浓度、温度和冲洗时间后最大可达到300 μm^[10]，小于细菌侵入牙本质小管的深度。多种细菌存在于副根管、主根管的凹陷或膨出部等器械难以到达的部位^[11] 。Law等^[11]发现半数以上的感染根管在预备后内仍能检出少量细菌。根管的彻底消毒十分重要。

氢氧化钙具有广泛的抗菌谱^[12]，常温下氢氧化钙糊剂中大部分是不溶解的。氢氧化钙能分解有机组织，是很常用的根管消毒药物。Law等^[11]已证明氢氧化钙对根管消毒效果十分有效。但部分实验表明常用的各种根管消毒药物均有耐药性，其中氢氧化钙对粪肠球菌基本没有效果^[13]。此外白色念珠菌和其他一些念珠菌种也表现出对氢氧化钙的强抵抗力^[14]。而有时未清理干净的氢氧化钙导致根管充填封闭效果不良，同时氢氧化钙短期消毒效果差。因此，有学者对广泛使用氢氧化钙作为根管治疗的通用药物，尤其在根管再治疗时使用氢氧化钙提出质疑。

研究表明有效浓度的米诺环素可减少骨有机质的降解，影响破骨细胞的形态功能，抑制骨吸收，利于骨形成^[15]。米诺环素能显著抑制胶原酶的活性，阻止牙周组织的破坏，抑制胶原酶代谢，促进牙周组织再生，能显著缓解临床症状。近来有研究表明，米诺环素对慢性牙周炎疼痛症状的缓解及在牙周牙髓联合病变中辅助根管治疗都具有良好的疗效^[16-18]。

派丽奥软膏为口腔科常用米诺环素类缓释剂型用药，发挥其杀菌、抑菌的作用，可持续释放1周^[19]，维持局部有效药物浓度，有研究表明，牙周局部使用派丽奥软膏时测的二甲胺四环素龈沟液浓度比血浆高5倍^[20]。目前国内外研究主要着眼于米诺环素应用在牙周疾病、牙周牙髓联合病变、干槽症、智齿冠周炎、种植体周围炎、义齿性口炎等疾患治疗，少见其在根管治疗中作为根管消毒药物的实验研究。米诺环素缓释剂作为根管消毒药物，其疗效、安全性及免疫学评估尚需相应实验证明。

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材料方法

1.1 设计临床随机对照研究。

1.2 时间及地点试验于2011年7月至2012年2月在天津医科大学口腔医院完成。

1.3 对象试验组16例选择诊断为根尖周病急性期的患者，涉及恒牙16颗，其中男4例，年龄24-64岁；女12例，年龄20-66岁，随机分为氢氧化钙组、米诺环素组，每组8例。对照组选择牙髓活力正常，因需(重度敏感、修复前准备、劈裂牙、深龋近髓等)行根管治疗的患者16例，涉及恒牙16颗，其中男5例，年龄32-54岁；女11例，年龄22-51岁。

纳入标准：①根尖周病急性期，有自发痛、肿胀、咬合痛等症状，有叩痛及/或X射线片显示根尖周存在骨质破坏区，病损直径<5 mm者；②未曾接受根管治疗史，髓腔没有开放者；③牙周探诊深度<3 mm，无明显的牙周病变者；④无瘘管发生者；⑤牙颈部以下牙根完整者。

排除标准：①牙髓牙周联合病变，同时牙周支持组织过少，牙周袋探诊>3 mm者；②水平或垂直性根折、根管侧穿或内吸收者；③治疗前1个月内服用过抗生素者：④治疗依从性差者；⑤近3个月使用免疫抑制剂者；⑥罹患高血压、糖尿病、心血管疾病及其他系统性疾病者；⑦对四环素类过敏者；⑧妇女在妊娠期及哺乳期。

1.4 材料派丽奥米诺环素软膏(Periocline，Sunstar INC Japan)；氢氧化钙根管糊剂(Pulpdent Multi-Cal，Pulpdent Corp)；口腔科暂封材料(CAVITON，GC Japan)；流式细胞仪(FACSCalibur，Becton Dickinson US)；CBA kit (Human and Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine，BD US)；游标卡尺(UNI/ISO 3599 DIN 862，beta)；无菌吸潮纸尖(蓝色30#，天津加发)；-80 ℃低温冰箱(SANYO Japan)；冷冻离心机(5415R，Eppendorf)。

1.5 方法

根尖渗出液的采集：患牙常规打开髓腔，去髓室顶，去除冠髓，拔除根髓，通畅根管，测量根管长度并预备至30#。预备，冲洗，干燥根管。将无菌30#标准纸尖插入根管中，放置30 s后取出，用消毒剪刀去除纸尖上端干燥部分后将纸尖置于含有200 μL标本稀释液的无菌管中，4 ℃ 4 000 r/min离心30 min，取上清液，-80 ℃低温冰箱冻存。对照组病例行一次性根管预备充填治疗；试验组完成根管预备后，氢氧化钙组根管使用氢氧化钙根管糊剂，米诺环素组根管使用米诺环素软膏，1周后复诊。复诊时取样前记录疗效，消毒患牙，去暂封物，冲洗干燥，标准纸尖取样步骤同前，完成根管充填。

1.6 主要观察指标

1.6.1 根尖周病的检测和记录采用临床根尖周指数的客观评价根尖周炎的程度，分值如下：0为无自觉症状；1为轻微自发痛，2为中至重度自发痛，有咬合痛，叩痛(++-+++)，红肿或有瘘管形成。在有经验的临床医生指导下记录根尖周病治疗前及1周后根尖周指数。

1.6.2 根尖周渗出液样品体积测定通过制作30#标准纸尖吸液体积与湿润长度关系的标准曲线，求出回归方程，Y=0.006 9X²+0.041 7X(R²=0.991)用此方程将纸尖湿润长度换算成样品体积，Y为纸尖吸液体积，X为纸尖湿润长度，R²为决定系数。

1.6.3 白细胞介素17检测 CBA流式操作采用BD试剂公司的 CBA Human and Mouse Th1/Th2/Th17试剂盒。

细胞因子检测试剂盒准备：①用2 mL标准品室温放置15 min，吸管混匀；②将试管标记为以下稀释比例：1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128及1∶256；③在试管中注入300 μL的稀释液；④进行以下一系列的稀释：从“最高浓度”管中取300 μL标准品放入标记为 “1∶2”的试管中，用吸管充分混匀；从“1∶2”的管中取300 μL放入标记为“1∶4”试管中，直至稀释到 “1∶256”的试管；吸管混匀；⑤ 吸取500 μL反应稀释液作为0 ng/L的阴性对照。

细胞因子试剂盒捕获微球的准备：①根据需测定的标本数判断所需捕获微球体积(10 μL白细胞介素17捕获微球×50检测管=500 μL白细胞介素17捕获微球)；②200×g离心混合捕获微球5 min；弃去上清，加入与弃去上清等体积的血清增强缓冲液，涡旋混匀；避光室温孵育30 min。

样品准备：①样品解冻后，1 000 r/min离心15 min ，取上清；②每份中试管加入50 μL混匀的混合捕获微球，然后加入50 μL待测样品，最后加入50 μL人Th1/Th2/Th17 PE检测试剂。室温避光孵育3 h；③各管中加入1 mL洗液，200×g离心5 min；④弃去上清，每管内加入300 μL此洗液后重悬。

调试流式细胞仪：①准备启动微球(Cytometer Setup Beads)：50 μL启动微球加入A，B，C管，B管内加入50 μL FITC阳性对照，C管内加入50 μL PE阳性对照，室温避光孵育30 min后，A管加入450 μL洗液，B、C管内加入400 μL洗液，上机调试；②上机检测标准品及待测样品；③计算待测样品浓度。

1.7 统计学分析采用SPSS 17.0 for Windows统计软件进行分析，计量资料以x(_)±s表示，多组比较采用方差分析；两组间比较采用LSD-t 检验，治疗前后采用Student's t test检验，根尖周指数采用卡方检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

3.1 根尖周渗出液中细胞因子和根尖周炎的关系根尖周炎以根尖周部位正常的组织结构被破坏，根尖附近的牙槽骨吸收为主要病理表现。根尖周渗出液是根尖周结缔组织内的液体，通过根尖孔、侧枝根管等通路进入根管。通过对根尖周渗出液的采集检测可以获得炎症期间局部组织表达的相应炎性因子信息。

3.2 Th17与根尖周炎的关系研究表明T淋巴细胞也参与了炎症反应，Th17细胞也在炎症反应中发挥作用^[20]，Xiong等^[21]发现炎症模型中白细胞介素17浓度在28 d时达到最高峰。有学者在根尖周炎患者的病损组织中检测到白细胞介素17蛋白。卫书盛等^[22]研究大鼠根尖周炎模型时提示，白细胞介素17与中性粒细胞浸润有关，该结果与 OuYang等^[23]的研究结果一致，在骨组织破环区域存在TCRαβ阳性的 T淋巴细胞，也为Th17的存在提供了进一步的证据。尽管以白细胞介素17为代表的Th17型细胞因子在根尖周炎疾病致病机制中的作用研究还刚刚开始，但已有的证据提示Th17可能在根尖周炎的发生发展过程中起重要作用，是致根尖周骨组织破坏的重要原因之一。 3.3 引起根尖周感染的微生物群目前认为根管感染是以专性、兼性厌氧菌为主的感染。原发性根尖周炎的研究显示，厌氧菌呈明显的时间依赖性。引起根尖周感染的细菌多为混合菌感染^[24]。放线菌与顽固根尖周炎和瘘道经久不愈有关^[24]。细菌在感染根管内既彼此竞争又相互依赖，进行复杂的新陈代谢活动。细菌性的生物膜也是重要的影响因素^[24]。Nair最早提出了根管生物膜的概念并首次确认了根管内生物物膜结构的存在。微生物在根管治疗后持续感染的根管内牙本质面和牙根外牙骨质面以菌斑生物膜的方式定植，并可侵入牙本质小管达500 μm。

3.4 米诺环素的抗菌作用米诺环素属于半合成品种^[25]，其对细菌来源的70 S核糖体有特别作用。米诺环素主要作用革兰阳性菌，优于目前上市的β-内酞胺类药和大环内醋类药^[25]，抗菌作用明显。van Steenberghe等^[26]证明其抑菌作用较强，并可抑制细菌性生物膜的形成。

3.5 米诺环素的其他作用

3.5.1 米诺环素的免疫抑制作用实验表明米诺环素能抑制淋巴细胞对植物血凝素的反应，抑制淋巴母细胞的转化，临床上米诺环素作为辅助治疗，对大疱性类天疱疮取得一定的效果，提示其除了抗炎作用外也可能有免疫抑制作用^[27]。米诺环素腹腔注射于大鼠体内后，能明显减少白细胞眼内浸润的同时，明显抑制眼内肿瘤坏死因子α的表达^[28]，影响炎症细胞因子的转录^[29]。

3.5.2 抑制蛋白水解酶作用胶原酶主要存在于牙周袋中。Choi等^[30]的研究显示，抑制胶原酶与四环素的抗菌活性无关。Colub等^[31]研究表明四环素药物可控制疾病的发展。Gul等^[32]研究表明四环素药物对胶原水解有抑制作用。有研究发现米诺环素对胶原酶活性并无影响。

弹性蛋白酶可作为牙周炎症的重要评价指标；米诺环素通过改变其活性位点而对其产生抑制作用。邹萍等^[33]研究证明盐酸米诺环素缓释软膏也对其有显著影响。磷脂酶A2也参与了炎症反应的发生。

3.5.3 米诺环素抑制骨吸收及胶原纤维溶解，促进骨再生米诺环素对骨形成有显著作用。Oringer等通过探讨米诺环素对ICTP及白细胞介素1的影响，表明米诺环素能降低二者的表达水平，进而抑制骨组织的继续破坏。此外尚有研究表明，四环素类药物可明显抑制骨的再吸收^[34]。有学者证实米诺环素可抑制骨吸收。四环素类在局部组织中还有缓释和螯合双向作用，可促进干细胞的分化^[35]。有研究结果考虑米诺环素参与骨诱导过程。有学者在成骨分化过程中应用米诺环素，证明其可促进细胞增殖。张文怡等^[36]也发现其对成骨分化的促进作用。

3.5.4 米诺环素对于根管系统内硬组织的作用研究表明将四环素可用于治疗根面龋的发生。由于米诺环素能进入牙本质小管而发挥作用^[37]。有研究表明，米诺环素可改变局部微环境，其pH值低，有助于对根管壁软化作用。有研究亦表明米诺环素可促进创口愈合。

3.6 试验结果讨论试验组渗出液白细胞介素17与对照组相比较高，而复诊时渗出液中白细胞介素17显著降低，以往研究证实在根尖炎症存在中性粒细胞^[38]，表明Th17细胞可能参与了根尖周组织的破坏，此结果与其他学者研究结论相近^[30]。

试验组渗出液多，说明根尖周病变急性期根尖周组织局部主要表现为充血、水肿，渗出液体积增多，经米诺环素缓释剂治疗后，根尖周指数显著下降，根管渗出液体积显著减少，与目前公认有效的根管消毒药物氢氧化钙组数据无差异，提示米诺环素作为根管消毒药物刺激性小，无抗原性。米诺环素组治疗前后白细胞介素17浓度显著降低，结果与体外研究一致^[39]，由于米诺环素抑制抗原呈递细胞的作用，同时可影响T细胞的激活作用，减少白细胞介素23、白细胞介素17等炎症因子；另外米诺环素可通过抑制白细胞介素23的增多而影响白细胞介素17的水平。

综上，根尖周渗出液体积和白细胞介素17的改变可作为推测炎症程度的关键指标。虽然米诺环素对于炎症反应的调节机制尚不十分明确，但试验结果已证明米诺环素抑制根尖周病变区域白细胞介素17的表达，支持米诺环素具有免疫调节作用。应用米诺环素能有效地减轻根尖周病临床症状，至少部分原因是由于米诺环素能有效减少炎症因子白细胞介素17的表达，减轻根尖周炎症所致。综合米诺环素高效、长期、广谱抗菌，抑制蛋白水解酶，促进骨吸收，渗透能力强，理化性质适宜于根管系统内发挥作用等特点，考虑米诺环素可作为有效的根管消毒药物。随着对米诺环素的免疫调节机制的深入探讨，将对其产生更深入的理解，为米诺环素作为根管消毒药物的治疗奠定一定的理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程