成骨细胞膜片在不同钛表面骨桥蛋白基因和蛋白的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.10.005

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (10): 1501-1507.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.10.005

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成骨细胞膜片在不同钛表面骨桥蛋白基因和蛋白的表达

吴镭¹，夏茜²，毛久凤³，郭艺¹，曾筱⁴，李治¹，王碧超⁵，董强⁴

¹贵州医科大学，贵州省贵阳市 550004；贵州医科大学附属口腔医院，²口腔内科，⁴口腔修复科，⁵口腔正畸学教研室，贵州省贵阳市 550004；³贵州医科大学附属省人民医院口腔修复科，贵州省贵阳市 550004

收稿日期:2017-02-14 出版日期:2017-04-08 发布日期:2017-05-08
通讯作者: 董强，主任医师，教授，贵州医科大学附属口腔医院口腔修复科，贵州省贵阳市 550004
作者简介:吴镭，男，1990年生，广西壮族自治区桂平市人，汉族，贵州医科大学在读硕士，主要从事骨组织工程研究。
基金资助:
贵州省科技厅省校合作协议项目(黔科合LH字[2014]7115号)；贵阳市科技计划项目(筑科合同[20141001]39号)

Expression of osteopontin mRNA and protein in osteoblast cell sheets cultured on different titanium surfaces

Wu Lei¹, Xia Qian², Mao Jiu-feng³, Guo Yi¹, Zeng Xiao⁴, Li Zhi¹, Wang Bi-chao⁵, Dong Qiang⁴

¹ Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China;² Department of Oral Medicine, ⁴ Department of Prosthodontics, ⁵ Department of Orthodontics, the Affiliated Stomatological Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; ³ Department of Prosthodontics, Guizhou Provincial Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China

Received:2017-02-14 Online:2017-04-08 Published:2017-05-08
Contact: Dong Qiang, Chief physician, Professor, Department of Prosthodontics, the Affiliated Stomatological Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:Wu Lei, Studying for master’s degree, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
Supported by:
the Guizhou Province & University Cooperation Projects of the Guizhou Provincial Science and Technology Department, No. [2014]7115; Guiyang Municipal Science and Technology Project, No. [20141001]39

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
细胞膜片技术：无须支架材料和酶的消化，通过刺激细胞外基质分泌而形成致密膜片组织，能有效修复组织缺损和改善器官功能。
物理刮取法：无需特殊材料或设备，细胞自分泌的外基质形成膜片后，以细胞刮刀由外周向中心沿培养皿底壁仔细刮起，即可获得完整的细胞膜片，是一种更为简单易行的细胞膜片刮取方法。

背景：对钛种植体表面改性是口腔种植骨整合界面研究的重要方法之一，能否通过细胞膜片技术在不同钛表面上实现更好的骨再生效应？
目的：初步研究成骨细胞膜片在不同钛表面上的成骨效应。
方法：取第3代新生SD大鼠成骨细胞，分别接种于光滑钛表面、喷砂酸蚀钛表面、阳极氧化钛表面，体外构建成骨细胞膜片。接种7，14 d，通过物理刮取法获得成骨细胞膜片，倒置显微镜下观察细胞膜片；采用RT-qPCR 检测成骨细胞骨桥蛋白基因的表达，Western blotting检测成骨细胞骨桥蛋白的表达。
结果与结论：①倒置显微镜下观察：接种第7天，细胞密集，钛片边缘与孔壁间细胞生长良好，呈梭形生长，相互有基质连接，近边缘部偶见细胞生长密集区呈云雾状；接种第14天，细胞膜片中部细胞均匀且重叠生长，形态、界限不清，边缘呈均匀重叠的云雾状；②骨桥蛋白表达：接种于喷砂酸蚀钛表面、阳极氧化钛表面的成骨细胞骨桥蛋白表达量均高于接种于光滑钛表面的成骨细胞(P < 0.05)，接种于喷砂酸蚀钛表面与阳极氧化钛表面的成骨细胞骨桥蛋白表达量比较差异无显著性意义；接种于不同材料表面14 d的成骨细胞骨桥蛋白表达均高于对应的7 d表达量(P < 0.05)；③结果表明：相比光滑钛片，喷砂酸蚀及阳极氧化钛片对成骨细胞增殖分化有更显著的促进作用。

ORCID: 0000-0001-8211-7138(董强)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 口腔生物材料, 成骨细胞膜片, 阳极氧化钛表面, 喷砂酸蚀钛表面, 骨桥蛋白

Abstract:

BACKGROUND: Modifying the titanium implant surface is an important method in the bone-implant osseointegration. Can the cell sheet technology realize better bone regeneration on different titanium surfaces?
OBJECTIVE: To primarily study the osteogenetic effect of osteoblast cell sheets on different titanium surfaces.
METHODS: Passage 3 osteoblasts from newborn Sprague-Dawley rats were seeded onto smooth titanium surface, anodic oxidation titanium surface, and sand-blasting/acid-etching titanium surface respectively, to make osteoblast cell sheets in vitro. At 7 and 14 days after inoculation, osteoblast cell sheets were obtained by physical scraping method and observed under inverted microscope. The expression of osteopontin mRNA and protein in osteoblasts was detected through RT-qPCR and western blot, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Observation with the inverted microscope: on day 7, in the gap between the titanium plate edge and the pore wall, the cells grew well in spindle shape, mutual connection matrix was found, but occasional cloud-shape cell growth was detective in dense areas close to the edge; on day 14, the growth of cells in the center area of the osteoblast cell sheets showed uniformity and overlap, the cell morphology and boundary were not clear, and the edge of the osteoblast cell sheets showed overlapping cloud shape. (2) Expression of osteopontin: the expression of osteopontin in osteoblast cells inoculated onto sand-blasting/acid-etching titanium surface and anodic oxidation titanium surface was significantly higher than that on the smooth titanium surface (P < 0.05); however, the expression of osteopontin in osteoblasts inoculated onto anodic oxidation titanium surface and sand-blasting/ acid-etching titanium surface had no statistically significant difference. The expression of osteopontin in osteoblasts on different titanium surfaces inoculated on day 14 was significantly higher than that on day 7 (P < 0.05). To conclude, sand-blasting/acid-etching titanium surface and anodic oxidation titanium surface play more significant role in promoting osteoblasts proliferation and differentiation than the smooth titanium surface.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Titanium, Osteoblasts, Osteopontin, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

吴镭，夏茜，毛久凤，郭艺，曾筱，李治，王碧超，董强. 成骨细胞膜片在不同钛表面骨桥蛋白基因和蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(10): 1501-1507.

Wu Lei, Xia Qian, Mao Jiu-feng, Guo Yi, Zeng Xiao, Li Zhi, Wang Bi-chao, Dong Qiang. Expression of osteopontin mRNA and protein in osteoblast cell sheets cultured on different titanium surfaces[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(10): 1501-1507.

图/表（结果） 5

2.1 成骨细胞的观察及鉴定原代培养第4天，镜下可见细胞呈三角形或长梭形，相互独立，无基质连接(图2A)。第3代培养第5天，细胞呈长梭形长满培养瓶底且相互之间有基质连接，生长密集，呈结瓦状(图2B)。碱性磷酸酶染色阳性，镜下观察见细胞质为条梭状、三角状或多边形状，呈棕灰色深染；细胞核呈紫蓝色(图3A)。茜素红染色阳性，镜下见红色灶状钙节结生长(图3B)。Ⅰ型胶原染色阳性，细胞基质呈浅棕黄色，细胞核呈深棕黄色(图3C)。

2.2 成骨细胞膜片的培养及观察成骨细胞接种于钛片上2 d后，镜下可见细胞呈梭形或卵圆形生长，细胞间少有或无基质链接(图4A)。第7天镜下见细胞密集，可见钛片边缘与孔壁间细胞生长良好，呈梭形生长，相互有基质连接，近边缘部偶见细胞生长密集区呈云雾状(图4B)。第14天，大体仔细观察，见每组钛片表面均有一层透明的镜面样薄膜，中间平滑均匀，边缘呈皱褶状，有一定韧性，可做轻微提拉(图4C，D)；镜下观察，膜片中部细胞均匀且重叠生长(图4E)，形态、界限不清，边缘呈均匀重叠的云雾状(图4F)。

2.3 RT-qPCR检测成骨细胞膜片中骨桥蛋白基因的表达培养第7，14天，阳极氧化组、喷砂酸蚀组骨桥蛋白基因表达量均高于对照组(P < 0.05)，阳极氧化组、喷砂酸蚀组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)；组内比较，各组第14天骨桥蛋白基因表达均高于第7天表达量(P < 0.05)，呈上调趋势，见图5。

2.4 Western blotting检测成骨细胞膜片中骨桥蛋白的蛋白表达水平与对照组相比，阳极氧化组、喷砂酸蚀组培养第7，14天骨桥蛋白相对表达水平升高(P < 0.05)，以喷砂酸蚀组培养14 d升高最为明显(P < 0.05)，阳极氧化组、喷砂酸蚀组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)；组内比较，各组培养第14天骨桥蛋白相对表达均高于第7天(P < 0.05)，见图6。

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞学观察实验。

1.2 时间及地点实验于2015年9月至2016年11月在贵州省分子生物学重点实验室完成。

1.3 材料钛片(宝鸡巨伟钛业有限公司)；24 h内新生的SD大鼠(贵州医科大学动物实验中心)；胎牛血清(以色列Biological Industries公司)；DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、青-链霉素(美国Gibco公司)；Ⅰ型胶原酶及抗坏血酸(美国Sigma公司)；总RNA抽提、cDNA合成、SYBR Green PCR Master Mix试剂盒(美国Invitrogen公司)；引物设计合成(上海生工生物工程有限公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天公司)；兔抗鼠OPN单克隆抗体(美国Abcam公司)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗、鼠抗-肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体、抗体稀释液、封闭液及聚丙烯酰胺凝胶(武汉博士德生物工程有限公司)；高效显影胶片、显影液及定影液(柯达公司)；ELC底物液(美国Thermo公司)；聚乙烯二氟膜(美国Millipore公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 原代成骨细胞的培养及鉴定取24 h内新生SD大鼠乳鼠，脱颈处死，于乙醇浸泡消毒5 min，取颅盖骨剪碎成1 mm×1 mm大小骨碎片；37 ℃水浴中，依次用0.25%胰蛋白酶及Ⅰ型胶原酶消化；离心重悬收集沉淀即得原代成骨细胞；采用差速贴壁法纯化，37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养，隔2 d换液。细胞长满培养瓶底，75%-85%后胰蛋白酶消化进行传代，传至第3代备用。按碱性磷酸酶、茜素红、Ⅰ型胶原染色试剂盒说明书操作步骤进行染色鉴定。

1.4.2 实验分组及膜片的制备

钛片的处理：取钛片18个，分3组处理，每组6个：定制TA1钛作为基底表面，以金相砂纸从800-2 000^#逐级打磨至相对“镜面”样作为机械抛光表面(图1A)，作为对照组；以光滑表面通过丙酮、无水乙醇、去离子水浸泡脱脂后，在电解环境(光滑表面作为阳极，石墨为阴极，5%硫酸与3%磷酸混合液作为电解质液，80 V直流电压作用 3 min)处理后作为阳极氧化表面，因电化学氧化呈深蓝色氧化薄膜覆盖表面(图1B)，为阳极氧化组；以200 μm直径的Al₂O₃在4 kg/cm²压力，45°角，15 cm工作距离条件下对光滑钛表面做喷砂处理，之后以60%硫酸和10%盐酸混合液在60 ℃环境下浸泡作酸蚀处理，此方法处理后为喷砂酸蚀表面，因喷砂后酸蚀，肉眼见表面有大小不一，凹凸不平的微孔(图1C)，为喷砂酸蚀组；各组钛片规格均为直径(14.5±0.3)mm，厚度(1.0±0.2)mm的圆钛片。表面处理好后洗净晾干，高压备用。

制备细胞膜片：取第3代成骨细胞，消化、离心，重悬，以0.5×10⁹ L^-1的细胞浓度接种于3组钛表面，每孔加入适量16%的完全培养基及50 mg/L的抗坏血酸。于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱连续培养7，14 d，如期在倒置相差显微镜下观察细胞膜片形态。

1.5 主要观察指标

成骨细胞膜骨桥蛋白基因检测：连续培养7，14 d，采用物理刮取法从各组钛片上刮取得到细胞膜片，按操作步骤提取总RNA。利用DU64核酸蛋白分析仪检测并计算总RNA的纯度和浓度。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA质量。按照试剂盒说明书反转录合成cDNA，-80 ℃保存备用。以β-actin作为内参基因，骨桥蛋白作为目的基因，每组设3个平行对照孔，独立实验重复3次。用RT-qPCR SYBR Green Ⅰ检测。总反应体系20 μL，按说明书操作步骤进行。采用2^-^??Ct法对骨桥蛋白mRNA表达的CT值进行分析，最后以目的基因的相对定量用作统计学分析。

免疫蛋白印迹法(Western blotting)检测骨桥蛋白蛋白：连续培养7，14 d，刮取成骨细胞膜片，捣碎裂解，离心，取上清后用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定，-80 ℃保存备用。Western blotting检测骨桥蛋白蛋白表达水平。每个样本取5 μg上样蛋白量，于12%的SDS-PAGE电泳分离，转移至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBS-T封闭，洗涤，一抗孵育过夜，洗去多余一抗，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗，孵育，洗去多余二抗，显影曝光。晾干胶片，以β-actin作为内参，用Image J软件扫描胶片像素灰度。

1.6 统计学分析采用SPSS 17.0统计学软件进行统计学分析，实验数据在组间比较时采用单因素方差分析，组内比较时采用配对t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

在口腔种植领域，对于骨缺损可采用自体骨、同种异体骨、异种骨或人工骨替代材料等移植方法修复，但各有优缺点。自体骨移植往往需要开辟第二术区，可能增加手术创伤和术中术后并发症的风险^[7-8]，且供区骨来源有限。同种异体骨或异种骨植入可能引发免疫排斥反应，周围组织长期反复处于炎症状态，延迟愈合^[10]。人工骨替代材料无骨诱导活性，植骨后骨组织形成、改建及血管化需要较长的时间。因此，采用成骨速度快、效果好的骨替代材料及创伤更小的治疗方法，具有重要的临床应用意义。

目前，细胞膜片技术在骨组织工程方面研究进展迅速。有学者利用骨髓间充质干细胞构建细胞膜片来修复骨组织缺损，取得了良好效果^[11-12]。骨髓间充质干细胞在组织工程领域应用十分广泛，是一种在体外易于增殖且可向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等多个方向诱导分化的多能干细胞^[13-16]。Nakamura等^[17]发现应用间充质干细胞构建的细胞膜片可明显修复大鼠股骨缺损及骨不连。但通过骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化而成的成骨细胞与体内直接提取的成骨细胞，在形态和生理功能上还是有差异且可能分化率不高^[18]。实验采用成骨细胞制取膜片，细胞获取容易，易于在体外培养和扩增，是体外研究比较理想的细胞之一，且成骨细胞在种植体表面的黏附、聚集是成骨的关键^[19]。

Okano等利用细胞对温敏性聚合物凝胶的亲和性不同来获得细胞膜片^[1]。但该方法获得的膜片仅由单层细胞组成，且温敏性凝胶价格昂贵。与之相比，物理刮取法是一种更为简单易行的细胞膜片制取方法^[20]。实验以细胞刮刀由膜片外周向中心沿培养皿底壁仔细刮起，即可获得较完整的细胞膜片。该法获取的膜片由多层细胞和细胞外基质组成，具有一定的弹性和机械性能，可进行折叠或卷曲，有良好的操作性^[21]。以非酶解的方式获得，作为一种移植细胞的新方法具有以下优势：①保留了大量的细胞外基质和细胞间连接蛋白及细胞表面活性^[22]；②制取过程中无需细胞接种支架材料，避免了细胞流失，缩短了体外培养时间^[23]；③避免了支架材料植入体内可能发生的不良反应，具有更好的生物相容性^[24]，并更加经济安全；④可塑性强，可直接或通过注射、包裹等方式进行移植^[25]。加入水溶性的抗坏血酸以50 mg/L质量浓度加入培养，催化成骨细胞增殖、矿化的进程，利于早期血管化的形成^[21]。骨桥蛋白是一种分泌型磷酸化糖蛋白，在骨改建中多由成骨细胞和破骨细胞分泌，维持着骨基质矿化和骨吸收的平衡^[26-27]。作为成骨细胞成熟阶段的特异性标志物之一，骨桥蛋白的出现与成骨细胞成熟度相一致^[28]。根据实验RT-qPCR及Western blotting检测结果，阳极氧化组、喷砂酸蚀组骨桥蛋白基因及蛋白在各时间点的表达均高于对照组，且随着时间的推移而不断上调，提示各组成骨细胞膜片均处于成熟或矿化高峰期，阳极氧化组、喷砂酸蚀组钛膜片比对照组膜片能更快地培养出成熟或矿化程度更高的成骨细胞膜片，更有利于缩短膜片向成骨分化的时间；这可能与钛片表面改性后的理化微结构有关。经喷砂酸蚀的钛表面形成的一级微孔(20-40 μm)类似于骨陷窝，二级微孔(1-3 μm)嵌入一级微孔，形成“孔中有孔”的结构，凹陷边缘呈圆滑的锯齿状，整个表面成阶梯状，凹凸不平，类似于连绵起伏的小丘陵^[29]；而阳极氧化钛表面在此参数电化学条件下，易形成无定型TiO₂纳米管(内径30-80 nm)阵列结构，类似“蜂窝孔”状^[30]。这两种微粗糙的表面均具有良好的生物相容性^[31]，静态水接触角大于5°而小于65°^[32-33]，呈亲水性表面，能增加表面积，为细胞附着及其伪足伸展提供更多的点位，利于细胞的铺展浸润，且使得细胞取向性生长，能合理构建各自特有的细胞骨架^[34-38]，亲水性的表面还利于羟基磷灰石的沉积及钙、磷等成骨必要离子、蛋白的吸附^[39-46]。Lai等^[47]发现喷砂后酸蚀钛表面比光滑钛表面上培养的成骨细胞表达更高的α1、α2、αV及β1等整合素亚单位，且细胞分化、氧化膜厚度增加，接触点更多；Keselowsky等^[48]也证实喷砂后酸蚀的钛表面培养MG63细胞能较光滑钛表面培养表达更高的整合素α5，增加了纤维黏连蛋白的结合强度；付晓龙等^[49]发现阳极氧化处理可在纯钛表面形成均匀一致的纳米孔结构，但并不改变纯钛的物相构成，与成骨细胞联合培养后，实验组与对照组相比细胞密度变大，且呈现多边形结构，并向周围材料伸出更多的板状伪足，同时骨保护素mRNA表达明显高于对照组。这些实验结果与本实验一致，体现了相对光滑钛表面而言，阳极氧化、喷砂酸蚀处理钛表面能促进成骨细胞的增殖、矿化。然而，本实验结果中，阳极氧化组、喷砂酸蚀组间比较并无统计学意义，可能是因为阳极氧化组、喷砂酸蚀组表面相似的微粗糙度及表面能使得细胞膜片在其上附着生长表现出相似的生物学行为。Huang等^[50]将机械抛光、喷砂酸蚀及喷砂酸蚀后阳极氧化钛表面作比较，发现Ⅰ型胶原及骨钙素的mRNA表达上后两者均较前者有显著的高表达，但是后两者之间并无统计学差异，认为这可能是该两种表面相似的粗糙度导致相近的结果；尹星等^[51]在两次阳极氧化法的钛表面及喷砂后酸蚀钛表面培养MG63细胞来评价不同处理的表面对成骨细胞增殖分化的影响，结果显示，作为成骨早期矿化标志之一的碱性磷酸酶，在第3，5天其表达在两组之间无统计学意义；王亚敏^[32]认为微/纳米形貌的表面在10 nm-10 μm范围内时，其尺寸数量级与细胞及大分子蛋白质大小相当，所以对界面特性影响微乎其微。三者与本实验一致，可能是在该参数处理下的钛表面，不足以因钛表面微孔直径从微量的不同而发生显著质的变化。

综上所述，实验直接以成骨细胞膜片来评价不同钛表面的特性，简化了细胞诱导过程，且缩短了细胞培养时间。获取的膜片具有一定的机械性能和可塑形性，初步证实了微粗糙的表面有利于成骨细胞膜片的增殖、矿化，如果后续试验能探究其具体的成骨机制及体内实验充分验证其良好的血管化、成骨，则有望为今后修复种植区骨缺损的临床治疗提供一定新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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成骨细胞膜片在不同钛表面骨桥蛋白基因和蛋白的表达

Expression of osteopontin mRNA and protein in osteoblast cell sheets cultured on different titanium surfaces

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