安石榴苷对钛颗粒诱导破骨细胞活化的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.12.013

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (12): 1759-1765.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.12.013

• 组织工程骨及软骨材料 tissue-engineered bone and cartilage materials • 上一篇下一篇

安石榴苷对钛颗粒诱导破骨细胞活化的作用

褚耿磊¹，刘思含¹，李东亚²，李洪伟²，郭开今²

¹徐州医学院研究生学院，江苏省徐州市 221004；²徐州医学院附属医院，江苏省徐州市 221002

收稿日期:2016-02-09 出版日期:2016-03-18 发布日期:2016-03-18
通讯作者: 李洪伟，博士，主任医师，硕士生导师，徐州医学院附属医院，江苏省徐州市 221002
作者简介:褚耿磊，男，1989年生，山东省临沂市人，汉族，徐州医学院在读硕士，主要从事组织工程骨材料的研究。
基金资助:
江苏省卫生计生委2015年度面上科研课题(H201528)；徐州市科学技术局项目(KC14SH102)

Effect of punicalagin on osteoclast activation induced by titanium particles

Chu Geng-lei¹, Liu Si-han¹, Li Dong-ya², Li Hong-wei², Guo Kai-jin²

¹School of Graduate, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, China; ²Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China

Received:2016-02-09 Online:2016-03-18 Published:2016-03-18
Contact: Li Hong-wei, M.D., Chief physician, Master’s supervisor, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China
About author:Chu Geng-lei, Studying for master’s degree, School of Graduate, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, China
Supported by:
the Surface Project of Health and Family Planning Commission of Jiangsu Province, No. H201528; the Project of XuZhou Science and Technology Department, No. KC14SH102

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

钛颗粒诱导破骨细胞活化：人工关节在长期活动中产生的磨损颗粒如钛颗粒被单核细胞/巨噬细胞吞噬后，激活核因子κB、丝裂原活化蛋白激酶等信号通路，启动炎症因子转录表达，释放肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6等炎症因子，直接或间接激活破骨细胞，诱导破骨细胞分化成熟并增强破骨细胞的活性。

安石榴苷：是一种可水解的单宁，为石榴皮中较为特异性的成分，具有抗氧化、抗癌、抗炎等多种药理学功效。

背景：有关安石榴苷对破骨细胞形成分化方面的研究很少，对磨损颗粒引起骨吸收类疾病影响的研究更少。

目的：建立钛颗粒诱导的小鼠单核/巨噬细胞株RAW264.7向破骨细胞分化模型，观察不同浓度安石榴苷对破骨细胞增殖分化的影响。

方法：将小鼠单核/巨噬细胞株RAW264.7分5组培养，分别加入培养基(空白组)、含0.1 g/L 钛颗粒悬液的培养基、含0.1 g/L 钛颗粒悬液+25 μmol/L安石榴苷的培养基、含0.1 g/L 钛颗粒悬液+50 μmol/L安石榴苷的培养基、含0.1 g/L 钛颗粒悬液+100 μmol/L安石榴苷的培养基。CCK-8法检测培养1，3，5 d的细胞增殖活性；培养5 d后，抗酒石酸酸性磷酸酶染色检测成熟破骨细胞数量，Western blot法检测IκBα及核转录因子κB p65磷酸化水平，RT-PCR测量活化T细胞核因子c1、抗酒石酸酸性磷酸酶和基质金属蛋白酶9 mRNA的表达。

结果与结论：与空白组比较，钛颗粒和不同浓度安石榴苷对RAW264.7细胞的增殖能力均无影响(P > 0.05)。与空白组比较，钛颗粒组成熟破骨细胞数量、IκBα及核转录因子κB p65磷酸化水平、活化T细胞核因子c1mRNA、抗酒石酸酸性磷酸酶mRNA和基质金属蛋白酶9 mRNA表达显著升高(P < 0.05，P < 0.01)，安石榴苷呈浓度依赖性降低上述指标表达。结果表明安石榴苷可抑制破骨细胞的形成与活化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

ORCID: 0000-0003-0275-7317(李洪伟)

关键词: 生物材料, 骨组织工程, 安石榴苷, 钛颗粒, 破骨细胞, 核转录因子κB, 无菌性松动, 活化T细胞核因子c1, 骨溶解

Abstract:

BACKGROUND: Currently, there are few researches on the effect of punicalagin on the formation and differentiation of osteoclasts, and fewer researches on the mechanism of bone resorption diseases induced by wear particles.
OBJECTIVE: To establish a model of titanium particles induced mouse monocyte/macrophage cell line (RAW264.7) differentiating into osteoclasts and to observe the effect of different concentrations of punicalagins on osteoclast proliferation and differentiation.
METHODS: Mouse monocyte/macrophage cell lines (RAW264.7) were divided into five groups, cultured in the culture medium of common (blank group), 0.1 g/L titanium particle suspension, 0.1 g/L titanium particle suspension with 25 μmol/L punicalagins, 0.1 g/L titanium particle suspension with 50 μmol/L punicalagins, 0.1 g/L titanium particle suspension with 100 μmol/L punicalagins, respectively. The cell proliferative activity was detected by cell counting kit-8 assay at 1, 3 and 5 days. At 5 days after culture, number of osteoclasts was measured by tartrate-resistant acid phosphatase staining, the phosphorylation of IκBα and NF-κB p65 was detected by western blot assay, the mRNA expressions of nuclear factor of activated Tc1, tartrate-resistant acid phosphatase and matrix metalloproteinase-9 were measured by reverse transcription-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with control group, titanium particles and different concentrations of punicalagin had no effect on the proliferation of RAW264.7 cells (P > 0.05). The number of tartrate-resistant acid phosphatase staining -positive cells, the phosphorylation of IκBα and NF-κB p65 as well as the mRNA expressions of nuclear factor of activated Tc1, tartrate-resistant acid phosphatase and matrix metalloproteinase-9 were significantly increased compared with those of control group (P < 0.05，P < 0.01). And punicalagins in a concentration-dependent manner decreased the expression of the above indicators. These results indicate that punicalagin can inhibit osteoclast formation and differentiation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

褚耿磊，刘思含，李东亚，李洪伟，郭开今. 安石榴苷对钛颗粒诱导破骨细胞活化的作用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(12): 1759-1765.

Chu Geng-lei, Liu Si-han, Li Dong-ya, Li Hong-wei, Guo Kai-jin. Effect of punicalagin on osteoclast activation induced by titanium particles[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(12): 1759-1765.

图/表（结果） 4

2.1 安石榴苷和钛颗粒对细胞增殖活性影响钛颗粒组1，3，5 d后的RAW264.7细胞活性与空白组比较差异无显著性意义(P > 0.05)；低剂量组、中剂量组、高剂量组1，3，5 d后的RAW264.7细胞活性与空白组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图1。结果表明，安石榴苷浓度在25-100 μmol/L与0.1 g/L 钛颗粒共培养时对RAW264.7细胞增殖无明显影响。

2.2 TRAP染色结果经钛颗粒处理5 d后，RAW264.7细胞变大，有伪足伸出，细胞核聚在中央，数量增多。光镜下计数TRAP阳性细胞：空白组未检出，钛颗粒组成熟破骨细胞数量为(165.30±6.87)个/cm²，低、中、高剂量组光镜下TRAP阳性细胞数分别为(149.70±4.62)，(96.60±3.32)，(65.50±5.45)个/cm²；中、高剂量组TRAP阳性细胞数量低于钛颗粒组(P < 0.05)，见图2。

2.3 安石榴苷下调IκBα和核因子κB P65磷酸化水平空白组IκBα和核因子κB P65的磷酸化水平分别为0.33±0.015和0.40±0.020，钛颗粒组IκBα和核因子κB P65的磷酸化水平分别为0.97±0.104和0.86±0.095，两组间比较IκBα和核因子κB P65磷酸化水平差异有显著性意义(P < 0.01)；低剂量组、中剂量组与高剂量组IκBα磷酸化水平分别为0.81±0.054，0.37±0.037，0.21± 0.045，核因子κB P65磷酸化水平分别为0.60±0.056，0.38±0.028，0.23±0.022，与钛颗粒组相比，低剂量组、中剂量组与高剂量组呈剂量依赖性降低IκBα和核因子κB P65磷酸化水平(P < 0.05)，见图3。

2.4 安石榴苷下调NFATc1、TRAP 和MMP-9 mRNA的表达钛颗粒组NFATc1、TRAP 和MMP-9 mRNA的表达水平较空白组明显升高(P < 0.01)；与钛颗粒组比较，安石榴苷呈浓度依赖性抑降低NFATc1、TRAP 和MMP-9 mRNA的表达(P < 0.05)，见图4。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照细胞学实验。

1.2 时间及地点实验于2014年5月至2015年6月在徐州医学院神经生物学实验室完成。

1.3 材料纳米级钛颗粒，平均直径为30-45 nm，由中国矿业大学摩擦学与可靠性工程研究所提供；小鼠单核/巨噬细胞株RAW264.7 (中国科学院上海细胞库)；安石榴苷(C48H28O30，纯度≥98%)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色试剂盒(美国Sigma公司)；显色基质鲎试剂盒(厦门市鲎试剂实验厂有限公司)；细胞增殖-毒性检测试剂盒 (日本同仁化学研究所)；反转录-聚合酶链反应试剂盒(天根生化科技有限公司)；β-actin抗体、P-IκBα、磷酸化核因子κB p65抗体(美国Cell Signaling公司)；IX71光学显微镜(日本OLYMPUS)；Western blot 电泳仪(美国 Bio-Rad 公司)。

1.4 实验方法

钛颗粒及药物处理：取500 mg钛颗粒，高温高压灭菌后，为去除内毒素，将其悬浮于50 mL体积分数为75%的乙醇中浸泡48 h，PBS洗涤3次，烘干，再用体积分数100%乙醇浸泡过夜，紫外线下干燥，用培养基配置成0.1 g/L备用，显色基质鲎试剂盒检测颗粒悬液中内毒素含量<0.1 EU/mL，使用前超声分散1 h^[10]。将安石榴苷溶于PBS中，4 ℃保存备用。

细胞培养及分组：将RAW264.7细胞以1×10⁴/孔接种于6孔板，以含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的α-MEM培养基培养。每3 d换液，细胞长满后，胰酶消化传代。将细胞分5组培养，分别加入培养基(空白组)、含0.1 g/L 钛颗粒悬液的培养基(钛颗粒组)、含0.1 g/L 钛颗粒悬液+25 μmol/L安石榴苷的培养基(低剂量组)、含0.1 g/L 钛颗粒悬液+ 50 μmol/L安石榴苷的培养基(中剂量组)、含0.1 g/L 钛颗粒悬液+100 μmol/L安石榴苷的培养基(高剂量组)。

1.5 主要观察指标

CCK-8法检测细胞增殖活性：将对数生长期RAW264.7细胞接种于96孔板，37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱过夜，按分组培养1，3，5 d后，每孔加入10 μL CCK-8溶液。培养箱孵育2 h后，在酶标仪上测450 nm波长处的吸光度(A)值。

TRAP染色：将RAW264.7细胞以1×10⁴/孔接种于6孔板，培养过夜后按分组处理，培养5 d，细胞每3 d换液。细胞用40 g/L多聚甲醛及丙酮固定后，在以萘酚ASBI磷酸盐作为底物的TRAP染液中37 ℃避光孵育1 h，蒸馏水洗3次，光镜观察，显微镜下计数TRAP阳性细胞。

Western blot检测：采用RIPA裂解液裂解各组细胞，提取总蛋白质，BCA蛋白定量试剂盒定量后，取等量蛋白，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分离，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，常温5%脱脂牛奶封闭1 h后加入一抗(p-IκBα，p-NF-κB P65，β-actin 1∶1 000), 4 ℃冰箱一抗孵育过夜，TBST缓冲液洗涤3×5 min，辣根过氧化物酶标记的二抗 (1∶500)室温避光孵育2 h，TBST缓冲液洗涤3×5 min。Odyssey红外激光成像，Image J软件分析灰度值，实验重复3次。

半定量反转录-聚合酶链反应分析：各组细胞培养 5 d后，收获细胞，采用Trizol试剂，按操作说明提取细胞内mRNA。取出2 μL经核酸测定仪测定RNA纯度和浓度。引物序列由上海生工生物技术有限公司设计合成。根据反转录试剂盒说明书进行反转录合成cDNA, 再进行PCR扩增cDNA( 94 ℃，30 s；57 ℃，30 s；72 ℃，60 s)。

取PCR扩增产物6 μL上样于2%琼脂糖凝胶，100 V电压下电泳45 min，于紫外线箱中观察并照相记录，用Image J分析软件对目的基因和参照基因条带进行灰度分析，实验重复3次。

1.6 统计学分析计量数据采用x(_)±s表示，应用SPSS 17.0统计软件分析。多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。组间两两比较采用q 检验。检验水准：α=0.05，P < 0.05表示差异有显著性学意义。

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讨论

人工假体无菌性松动是假体翻修的主要原因之一^[11]。既往认为，假体与骨骼匹配不良、假体位置不当、假体老化及应力遮挡等机械性因素是引起无菌性松动的主要原因。最新的研究表明，人工假体长期磨损产生微小颗粒引起的骨吸收因子的释放及炎症性破骨细胞活化，在这个过程中扮演了重要角色^[12-13]。以往认为微米级颗粒是诱导骨溶解的主要微粒，但随着激光捕获显微切割技术和透射电镜的引入，在松动界膜组织中发现了各种纳米级微粒，包括金属纳米颗粒、陶瓷纳米颗粒、高分子聚乙烯纳米颗粒^[14-16]，由于纳米级微粒更易被吞噬细胞所吞噬，因而在无菌性松动中可能扮演了更为重要的作用。

人工关节在长期活动中产生的磨损颗粒如钛颗粒被单核细胞/巨噬细胞吞噬后，激活核因子κB、丝裂原活化蛋白激酶等信号通路，启动炎症因子转录表达，释放肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6等炎症因子，直接或间接激活破骨细胞，诱导破骨细胞分化成熟并增强破骨细胞的活性^[17-19]。破骨细胞是体内负责骨吸收的细胞，因此，靶向抑制破骨细胞活化被认为是逆转假体无菌性松动最有效的治疗策略^[20]。目前已有研究用双膦酸盐类药物、基因治疗来抑制磨损颗粒的不良反应，并且取得了一些进展，但与临床应用还有很大距离。近年来，中药及其提取物在治疗骨溶解导致的假体无菌性松动的研究中受到更多重视。安石榴苷是一种可水解的单宁，为石榴皮中较为特异性的成分，石榴皮是中国传统的中药材，具有涩肠止泻、止血、驱虫的功效^[21]。Lee等^[22]筛选1 400种中药萃取物发现石榴皮中安石榴苷是一种有效的免疫抑制剂，它可抑制NFATc1的激活，NFATc1是破骨细胞分化成熟过程中重要的转录因子，它参与调控多种破骨细胞特异性基因的表达，因此，猜想安石榴苷可抑制钛颗粒诱导的破骨细胞活化。

破骨细胞属血源性单核-巨噬细胞系统，多核为其重要功能形式，它通过分泌酸和蛋白酶溶解骨组织启动骨重建、完成骨吸收，RANKL/RANK/OPG调节轴是其分化和活化的主要调节形式^[23]。已有研究表明钛颗粒能上调RANK的表达水平^[24]，本次研究也得到了相同的结果，钛颗粒加入后RANK/RANKL表达量增加，成熟破骨细胞数量增多，安石榴苷可显著降低RANK/RANKL的含量；TRAP染色结果证明，安石榴苷组阳性细胞数量较少，且随药物浓度升高，其阳性细胞数量逐渐降低。因此，安石榴苷通过干扰RANK/RANKL通路抑制破骨细胞活化。

破骨细胞内游离Ca²⁺作为一种重要的第二信使，广泛参与细胞的运动、代谢和分化等功能调节，在钛颗粒的刺激下，成骨细胞表达RANKL增多，RANKL可通过Ca²⁺信号通路诱导并激活NFATc1。NFATc1转录因子常以高度磷酸化形式存在于细胞质中，细胞内Ca²⁺水平增加，NFATc1去磷酸化，导致NFATc1进入核内激活一系列破骨细胞特异性基因表达，如基质金属蛋白酶9、TRAP、组织蛋白酶K等^{[6-7, 25]}。本实验表明，安石榴苷可显著降低NFATc1、TRAP、基质金属蛋白酶9的表达，并呈浓度依赖表达降低，表明安石榴苷可不仅可以影响NFATc1的表达，也可以影响其下游因子的表达。

核因子κB是参与假体周围骨溶解的主要信号通路之一，与RANKL／RANK诱导的破骨细胞活化密切相关^[4-5]。正常情况下，二聚化的核因子κB可与核因子κB的抑制蛋白家族(IκB)相互作用而于胞质中保持失活状态。在RANKL信号通路激活的情况下，IκB蛋白可被磷酸化、泛素化后降解，p50和p65形成有活性的二聚体，进入细胞核，激活核因子κB，启动一系列基因转录^[26]。既往研究表明，安石榴苷通过干扰核因子κB的信号传递，能够抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7的炎症反应，降低肿瘤坏死因子α释放，最终抑制细菌内毒素脂多糖诱导的破骨细胞活化^[27]。在实验中发现，钛颗粒加入5 d后，IκB及核因子κB p65的磷酸化水平明显升高，表明核因子κB通路被激活，安石榴苷的加入能够抑制IκB及核因子κB p65的磷酸化，并呈浓度依赖性。因此，安石榴苷通过调控IκB和核因子κB p65的磷酸化水平，抑制核因子κB通路，影响破骨细胞活性。

近年来，安石榴苷在骨组织的研究中受到越来越多的重视，Jean-G:lles等^[28]发现安石榴苷、鞣花酸和石榴中其他多酚能抑制基质金属蛋白酶13胶原酶对Ⅱ型胶原蛋白的降解，阻止关节中软骨的破坏，防止关节炎的发生，其中安石榴苷的抑制作用与其浓度呈剂量依赖关系。又有研究发现，安石榴苷可促进成骨细胞的增殖、分化、钙化结节形成，抑制成骨细胞表达RANKL，对骨量及骨改建有调节作用^[29]。虽然安石榴苷在预防抗骨质疏松、关节炎及磨损颗粒介导的骨溶解等骨吸收类疾病中有一定作用，但安石榴苷对人体可能还存在一些负面影响，有研究报道安石榴苷能导致牛肝脏坏死和肾病毒的产生，但这些负面影响只是在大剂量服用安石榴苷时才会产生^[30]。

综上所述，本实验发现安石榴苷通过多靶点抑制破骨细胞密切相关的转录因子核因子κB和NFATc1，从而抑制破骨细胞的形成和活化，这说明其具有治疗磨损颗粒介导骨吸收类疾病的潜在前景。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

安石榴苷对钛颗粒诱导破骨细胞活化的作用

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