拉喹莫德抑制成骨细胞中缺氧诱导因子2α的表达及其功能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.07.001

摘要/Abstract

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文题释义：

拉喹莫德：是一种新型免疫调节剂，化学名称为N-乙基-N-苯基-5-氯-1，2二氢-1-甲基-2-氧-3-喹啉甲酰胺，其作用机制为通过消除中枢神经系统的白细胞浸润，对鼠类慢性实验性自身免疫性脑脊髓炎性因子子产生完全抑制作用，并且从暴露的剂量直接比较，拉喹莫德的免疫抑制作用是罗喹美克的20倍，可抑制炎症因子CD4⁺细胞和巨噬细胞进入中枢神经组织(即脊髓)，并且改变包括Th2/Th3、白细胞介素4、白细胞介素10、β-转化生长因子等细胞因子的平衡。

缺氧诱导因子2α：是一种半衰期短的蛋白质，可诱导多种炎性因子的释放，细胞中缺氧诱导因子2α蛋白质的表达水平是蛋白质翻译和降解之间动态平衡的结果。

背景：由于骨折会诱导骨细胞缺氧，使骨细胞中的氧张力明显下降，现已证明，其中低氧诱导因子2α是机体在低氧状态下调剂机体功能的一种重要氧依赖转录激活因子，其介导骨折发生时多种炎性因子的释放。

目的：探讨拉喹莫德对成骨细胞中缺氧诱导因子2α的表达和功能的影响。

方法：缺氧处理前分别在蛋白酶体抑制剂MG132或N-乙酰基-亮氨酰-亮氨酰-正亮氨酸存在和不存在的情况下，用10-100 μmol/L的拉喹莫德处理小鼠成骨细胞MC3T3-E1(克隆14)。然后分别在体积分数1%或21%氧张力下进行1-24 h的预处理。

结果与结论：①缺氧诱导因子2α在成骨细胞缺氧中表达明显增高。而拉喹莫德可以抑制成骨细胞中缺氧诱导因子2α及其目标基因在小鼠成骨细胞(MC3T3-E1细胞)中的表达。②拉喹莫德以蛋白酶依赖、von Hippel-Lindau(VHL)蛋白不依赖的方式促进缺氧诱导因子2α的降解，可打断缺氧诱导因子2α和它的分子伴侣热休克蛋白90之间的相互作用，促进缺氧诱导因子2α和激活的蛋白酶C受体之间的相互作用。③结果显示拉喹莫德可能通过影响缺氧诱导因子2α蛋白的折叠和成熟从而促进其降解，可通过改变与伴侣蛋白热休克蛋白90和RACK1的功能性相互作用来抑制成骨细胞中的缺氧诱导因子2α。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID: 0000-0002-6880-9821(方军)

关键词: 组织构建, 成骨细胞, 拉喹莫德, 缺氧, 缺氧诱导因子2α, 热休克蛋白90, 活化的蛋白酶C(RACK1)受体, 蛋白酶体降解

Abstract:

BACKGROUND: Fractures can induce bone cell hypoxia, and remarkably reduce the oxygen tension in cells. Hypoxia-inducible factor-2α is a key oxygen-dependent transcriptional activator to regulate the body function under hypoxia and mediate the release of various inflammatory factors after fractures.
OBJECTIVE: To explore the role of Laquinimod in expression and function of hypoxia-inducible factor-2α in osteoblasts.
METHODS: Mouse osteoblasts MC3T3-E1 (clone 14) were pretreated with Laquinimod at various concentrations(10-100 μmol/L) before hypoxia in the presence or absence of specific proteasome inhibitors MG132 or N-acetyl-leucyl-leucyl-norleucine. Then, the media were pre-conditioned in 1% or 21% oxygen tension for 1 to 24 hours.
RESULTS AND CONCLUSION: Under hypoxia, the expression of hypoxia-inducible factor-2α in osteoblasts was increased remarkably, and Laquinimod could inhibit the expression of hypoxia-inducible factor-2α and its target genes in mouse MC3T3-E1 cells. Mechanistically, Laquinimod promoted hypoxia-inducible factor-2α degradation in a proteasome-dependent but von Hippel-Lindau protein-independent manner. Importantly, we found that Laquinimod disrupted the interaction between hypoxia-inducible factor-2α and its chaperone heat shock protein 90, but promoted the interaction between hypoxia-inducible factor-2α and the receptor of activated protein kinase C. These findings suggest that Laquinimod may promote the degradation of hypoxia-inducible factor-2α by affecting its folding and maturation. Laquinimod is a novel inhibitor of hypoxia-inducible factor-2α by changing its functional interaction with chaperone proteins heat shock protein 90 and receptor of activated protein kinase C.

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图/表（结果） 3

2.1 拉喹莫德对缺氧诱导因子2α蛋白质表达的影响 Western bolt结果显示，在缺氧(体积分数1%O₂)刺激1 h后，小鼠MC3T3 E1细胞中，缺氧诱导因子2α即出现，8 h后达到峰值(图1B)，因此，后续实验选择8 h作为缺氧处理时间。而拉喹莫德预处理可以显著地减弱缺氧诱导的缺氧诱导因子2α蛋白积累(图1C)。

2.2 拉喹莫德对缺氧介导的白细胞介素8 和血管内皮生长因子诱导生成的调节作用然后进一步判断拉喹莫德是否对缺氧诱导因子2α目标基因的改变起作用。白细胞介素8和血管内皮生长因子被认为是缺氧过程中缺氧诱导因子2α的目标基因^[15]。反转录PCR分析和酶联免疫吸附试验结果显示，拉喹莫德可以抑制二甲基亚砜和缺氧诱导的白细胞介素8 mRNA的表达(图2A)，与之一致的是，酶联免疫吸附试验结果也显示拉喹莫德可以抑制MC3T3 E1中白细胞介素8蛋白质的分泌(图2B)。此外，拉喹莫德预处理可以抑制缺氧介导的血管内皮生长因子mRNA和蛋白的分泌(图2C，D)。

2.3 拉喹莫德对缺氧诱导因子2α降解的作用不依赖于Hippel-Lindau(VHL)，但受蛋白酶体系统的调节见图3。为了与锚定蛋白的竞争性结合调控。缺氧诱导因子2α与热休克蛋白90结合可以使蛋白质稳定，而与可以和转录延伸因子C相互作用的RACK1结合，缺氧诱导因子2α可以被泛素化，然后以不依赖脯氨酸羟化酶2和VHL的方式降解^[19-20]。

实验拉喹莫德对缺氧诱导因子2α和热休克蛋白90相互作用的影响。MC3T3 E1细胞暴露于缺氧条件8 h，用MG132处理细胞来逆转拉喹莫德引起的缺氧诱导因子2α蛋白质的降解^[21]。与抗缺氧诱导因子2α抗体免疫沉淀，用抗热休克蛋白90抗体进行Western blot结果显示，拉喹莫德抑制缺氧诱导因子2α与热休克蛋白90形成复合物的能力(图3D)。与之相反，与抗缺氧诱导因子2α抗体免疫共沉淀，与抗RACK1抗体的Western blot结果显示拉喹莫德促进缺氧诱导因子2α与RACK1之间的相互作用(图3E)。这些研究发现说明，拉喹莫德干扰缺氧诱导因子2α与热休克蛋白90分子伴侣复合物的相互作用的能力，并促进与RACK1相互作用，从而促进缺氧诱导因子2α的降解，进而影响其折叠和成熟。

为了判定拉喹莫德是否在转录水平诱导缺氧诱导因子2α降低，对拉喹莫德处理的细胞的缺氧诱导因子2α mRNA水平进行分析。常氧条件下，反转录PCR结果显示缺氧诱导因子2α mRNA 表达不受各种浓度的拉喹莫德影响(图4A)。为了检验缺氧诱导因子2α mRNA的缺氧调控是否受到拉喹莫德的影响，细胞在缺氧条件下培养8 h。但是，使用拉喹莫德没有显著改变缺氧诱导因子2α mRNA水平(图4B)。这些数据显示在缺氧和常氧条件下，拉喹莫德不在转录水平调节缺氧诱导因子2α 的表达。

缺氧诱导因子2α是一种半衰期短的蛋白质，因此，细胞中缺氧诱导因子2α蛋白质的表达水平是蛋白质翻译和降解之间的动态平衡的结果^[22]。为了研究拉喹莫德是否通过影响翻译速度来降低缺氧诱导因子2α表达水平，实验采用[³⁵S]标记的蛋氨酸和半胱氨酸脉冲标记实验的方法，通过对比拉喹莫德处理与未处理条件下缺氧诱导因子2α合成速度，对拉喹莫德对缺氧诱导因子2α反应的作用进行了检验。但是，如图4C所示，在对照细胞和拉喹莫德(50或100 μmol/L)处理的细胞中缺氧诱导因子2α合成速度几乎一致，表明拉喹莫德处理不影响缺氧诱导因子2α的合成。

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引言

氧张力(饱和度)下降已被证明对骨细胞生理学有显著的影响。研究已经表明，骨骼的失载荷(失重力)能诱导骨细胞缺氧^[1]。此外，由于脉管系统的中断，骨折也会导致骨细胞中的氧气张力显著下降^[2]。现已证明，在成骨细胞中，缺氧可以上调几种重要基因的表达，包括可以促进新血管的形成和介导炎症反应的血管内皮生长因子和白细胞介素8^[3]。多项证据表明，缺氧依赖性的基因表达的调节作用发生在转录水平，并由缺氧敏感的转录因子，如缺氧诱导因子2α介导完成的；缺氧诱导因子2α的蛋白质水平通过可控的蛋白质水解作用受到氧张力的严格调控^[4]。一方面，von Hippel-Lindau(VHL)肿瘤抑制蛋白对羟基化缺氧诱导因子2α的识别作用可以召集针对缺氧诱导因子2α的E3泛素连接酶复合体，对其进行蛋白酶体降解^[5]。另一方面，热休克蛋白90作为预防相应蛋白质错误折叠和降解的分子伴侣，能够调节缺氧诱导因子2α的降解。热休克蛋白90与缺氧诱导因子2α的PAS(Per-ARNTSim)结构域结合。值得注意的是，热休克蛋白90抑制剂格尔德霉素和17-烯丙基氨基格尔德霉素，即使在VHL缺陷细胞中也可以诱导缺氧诱导因子2α的蛋白酶体降解^[6]。此外，最近已证明活化的蛋白激酶C受体(receptor of activated protein kinase C，RACK1)，一种能与缺氧诱导因子2α相互作用的蛋白质，可以通过与热休克蛋白90竞争结合缺氧诱导因子2α来促进VHL不依赖的缺氧诱导因子2α的蛋白酶体降解。

近期非常有希望进入临床一线治疗多发性硬化症的药物是Teva公司生产的拉喹莫德，对动物模型EAE小鼠和Ⅱ期临床试验中都有良好的治疗效果^[7]，其作用机制可能是通过影响树突状细胞和Th1、Th2细胞的促炎或抑炎细胞因子的分泌来发挥抗炎活性，并且也有报道拉喹莫德通过脑源性神经营养因子依赖的方式发挥神经保护作用^[8]。基于以上结果，2个拉喹莫德的Ⅲ期临床试验已经开始进行，初步结果显示拉喹莫德减慢残疾进程并降低23%的年复发率，且药物不良反应较小^[9]。此外，还证实了拉喹莫德可以通过Nrf2信号传导途径介导极强的抗氧化作用，同时具有强抗氧化作用的重要酶类，如编码还原型辅酶/醌氧化还原酶、血红素氧合酶1和谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位等的表达都有上升^[9]。缺氧时成骨细胞会发生促炎症反应和氧化应激，但是，有关拉喹莫德在缺氧时的生理作用，尤其是对成骨细胞中缺氧诱导因子2α的表达和功能的调节方面的信息在过往研究中却鲜有报道^[10]。因此，实验拟对这一问题进行分析。

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材料方法

1.1 设计随机对照细胞学实验。

1.2 时间及地点实验于2014年12月至2015年3月在潍坊医学院药理实验室完成。

1.3 材料小鼠成骨细胞MC3T3-E1(克隆14)为山东大学药理实验室提供。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养 MC3T3-E1细胞在添加体积分数10%胎牛血清和1%青霉素和链霉素的α-基础培养基中培养。缺氧处理前分别在蛋白酶体抑制剂MG132或N-乙酰基-亮氨酰-亮氨酰-正亮氨酸(日本Wako公司)存在和不存在的情况下，用范围在10-100 μmol/L之间的不同浓度的拉喹莫德(图1A，Teva 公司)处理细胞。然后分别在1%或21%氧张力下进行不同时间的预处理(1-24 h)，用含有体积分数0.1%胎牛血清(Hyclone公司)和1%青霉素和链霉素的α-基础培养基(Gibco公司)更换培养基。

对于环境(21%)氧张力实验，细胞在湿润的培养箱(美国Nuaire公司)中，37 ℃，体积分数95%空气，体积分数5% CO₂的条件下培养^[11]。对于缺氧实验，细胞在湿润的培养箱(美国Nuaire公司)中，37 ℃，体积分数5% CO₂，氧张力降到1%，补充N₂的条件下培养。

1.4.2 RNA干预使用Trizol试剂(Invitrogen公司)从MC3T3 E1细胞中提取总RNA。使用高容量cDNA反转录试剂盒(美国Applied Biosystems公司)从2 μg总RNA合成cDNA，用通过反转录PCR合成的cDNA对MC3T3 E1细胞中血管内皮生长因子和白细胞介素8的表达进行研究。

使用的血管内皮生长因子引物为：正向 5’-CTA TGT GCT GGC TTT GGT GA-3’，反向5’-GCC GGC GCC CTC CAT-3’。使用的白细胞介素8引物为：正向5’-CTG GCC GTG GCT CTC TTG-3’，反向5′-CCT TGG CAA AAC TGC ACC TT-3’。使用的缺氧诱导因子2α引物为：正向5’-GTC GGA CAG CCT CAC CAA ACA G-3’，反向5’-TAG GTA GTG AGC CAC CAG TGT CC-3’。使用的β-actin 的引物为：正向5’-CTG TCG AGT CGC GTC CAC CC-3’，反向5’-GCT TTG CAC ATG CCG GAG CC-3’。

1.4.3 免疫沉淀和Western bolt分析免疫沉淀分析实验中，用含有50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)、150 mmol/L NaCl、0.1%乙基苯基聚乙二醇、1 mmol/L二硫苏糖醇、蛋白酶抑制剂混合物、正钒酸钠和氟化钠的细胞裂解缓冲液裂解细胞，使用Pierce BCA蛋白质检验试剂盒(美国Pierce公司)测定蛋白质浓度。取1 mg全细胞裂解物与5 μg 抗AIP1或抗14-3-3的抗体(美国Cell signaling公司)在4 ℃孵育过夜，形成抗原-抗体复合物^[12]。使用蛋白质A/G琼脂糖珠(Santa Cruz公司)沉淀形成的抗原-抗体复合物，4 ℃下沉淀2 h，然后在SDS样品缓冲液中洗脱琼脂糖珠。蛋白质样品经10%SDS-PAGE电泳，然后电转移到SDS–PAGE上。Western bolt分析实验中，用细胞裂解缓冲液裂解细胞(美国Cell Signaling公司)，然后细胞裂解液经SDS–PAGE电泳，再根据上述方法进行免疫印迹分析^[13]。

1.4.4 酶联免疫吸附试验小鼠血管内皮生长因子和白细胞介素8 酶联免疫吸附试验试剂盒购自R & D Systems。简而言之，在6孔培养板中培养MC3T3 E1细胞，对分别暴露于缺氧(体积分数1%O₂)条件1，4，8，和24 h的缺氧诱导因子2α的表达进行了测定，收获细胞上清，采用酶联免疫吸附试验方法对血管内皮生长因子和白细胞介素8水平进行检测。

1.4.5 缺氧诱导因子2α脉冲标记用不含半胱氨酸/蛋氨酸的α-基础培养基洗涤细胞后，在同样的培养基中孵育2 h，然后用[³⁵S]标记的半胱氨酸/蛋氨酸(3.3 TBq/L)电脉冲标记细胞，分别在标记15 min和45 min后收集细胞^[14]。对于缺氧处理的细胞，预先在缺氧条件下平衡洗涤和孵育培养基，所有的操作都在低氧室中进行。收集总蛋白裂解液，然后用缺氧诱导因子2α抗体进行免疫沉淀。从琼脂糖珠上洗脱下来后，对放射性标记的缺氧诱导因子2α蛋白质进行SDS-PAGE电泳，HydroTech干胶设备(美国Bio-Rad Laboratories公司)干胶，放射自显影成像。实验重复4次。

1.5 主要观察指标首先进行时间过程的研究，在MC3T3 E1细胞中，通过Western免疫印迹分析法，对分别暴露于缺氧(体积分数1%O₂)条件1，4，8和24h的缺氧诱导因子2α的表达进行了测定。随后的实验选择8h作为缺氧处理时间。然后进一步判断拉模奎德是否对缺氧诱导因子2α目标基因的改变起作用。为了进一步理解拉喹莫德降低缺氧诱导因子2α水平的机制，使用蛋白酶体的药理学抑制剂对蛋白酶体系统在拉喹莫德诱导的缺氧诱导因子2α降解中起到的作用进行研究。

1.6 统计学分析所有实验结果以x(_)±s表示。使用单因素方差分析和Tukey’s HSD检验进行统计学分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

骨细胞周围环境中氧张力的改变与发育、失用、失载荷和骨折等情况有关^[1]，实际上，据报道骨折处的氧张力可以低至0.8%^[23-24]，缺氧主要通过缺氧诱导因子α转录因子的稳定化促进基因表达的适应性改变。缺氧诱导因子1 转录因子由一个受氧调节的缺氧诱导因子2α 亚基和一个组成表达的缺氧诱导因子1β亚基构成，缺氧诱导因子2α能够在2个脯氨酸位点被羟基化，这一过程在氧气和Fe²⁺存在时由脯氨酸羟基化酶催化完成。VHL识别羟基化的缺氧诱导因子2α后可以召集针对缺氧诱导因子2α的E3泛素连接酶复合物，促进它们在蛋白酶体中的降解^[25-26]。有意思的是，拉喹莫德以一种VHL不依赖的方式促进缺氧诱导因子2α的降解。此外，缺氧诱导因子2α需要热休克蛋白90来维持其稳定性、折叠和转运^[27]。热休克蛋白90抑制剂格尔德霉素和17-烯丙基氨基格尔德霉素即使在VHL缺陷细胞内也可以诱导缺氧诱导因子2α的蛋白酶体降解^[28]。值得注意的是，RACK1可以通过与热休克蛋白90竞争性地与缺氧诱导因子2α结合促进非VHL依赖的缺氧诱导因子2α蛋白酶体降解^[29-30]。重要的是，本次实验结果表明，拉喹莫德干扰缺氧诱导因子2α与其分子伴侣热休克蛋白90复合物的相互作用，但是可以促进它与 RACK1的相互作用。拉喹莫德可能对热休克蛋白90 和RACK1的功能的效应物都有影响。进一步的研究将对上述现象的机制进行全面的阐释。

在低氧条件下，缺氧诱导因子1与缺氧反应元件的目标启动子结合，激活基因表达^[31]。在缺氧诱导因子1依赖的机制之外，缺氧介导的基因表达也可以通过一种非缺氧诱导因子1依赖的机制被激活。例如，缺氧条件下白细胞介素8的诱导可能就是依赖于核因子κB途径和依赖缺氧诱导因子1的途径^[32-35]。与本实验的发现一致，以前的研究也表明拉喹莫德通过抑制共激活因子的召集而表现出核因子κB功能^[34]。缺氧诱导的基因白细胞介素8和血管内皮生长因子都参与血管生成，拉喹莫德对白细胞介素8和血管内皮生长因子的抑制作用揭示了拉喹莫德在调节缺氧介导的血管生成中的潜在作用。实际上，已经证明拉喹莫德可通过抑制血管内皮生长因子受体2的表达来抑制血管生成^[36]。总之，实验首次论证了拉喹莫德是一种新型缺氧诱导因子2α抑制剂，可通过改变与伴侣蛋白热休克蛋白90和RACK1的功能性相互作用来抑制缺氧诱导因子2α。

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