自噬相关基因在肺纤维化模型中的表达：生物信息学分析及实验验证

doi:10.12307/2026.040

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (5): 1129-1138.doi: 10.12307/2026.040

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自噬相关基因在肺纤维化模型中的表达：生物信息学分析及实验验证

刘可新1，2，郝凯敏2，庄文越2，3，李正祎1

1吉林医药学院，吉林省吉林市 132001；2北华大学，吉林省吉林市 132001；3浙江万里学院，浙江省宁波市 315100

收稿日期:2024-11-19 接受日期:2025-01-24 出版日期:2026-02-18 发布日期:2025-06-23
通讯作者: 李正祎，博士，教授，硕士生导师，吉林医药学院，吉林省吉林市 132001
作者简介:刘可新，女，1998年生，吉林省长春市人，汉族，北华大学在读硕士(吉林医药学院联合培养)，主要从事生物化学及分子生物学研究。
基金资助:
吉林省自然基金项目(YDZJ202201ZYTS637)，项目负责人：庄文越；吉林医药学院研究生创新计划项目(2023yy01)，项目负责人：刘可新

Autophagy-related gene expression in pulmonary fibrosis models: bioinformatic analysis and experimental validation

Liu Kexin1, 2, Hao Kaimin2, Zhuang Wenyue2, 3, Li Zhengyi1

1Laboratory Academy, Jilin Medical University, Jilin 132001, Jilin Province, China; 2Beihua University, Jilin 132001, Jilin Province, China; 3Zhejiang Wanli University, Ningbo 315100, Zhejiang Province, China

Received:2024-11-19 Accepted:2025-01-24 Online:2026-02-18 Published:2025-06-23
Contact: Li Zhengyi, PhD, Professor, Master’s supervisor, Laboratory Academy, Jilin Medical University, Jilin 132001, Jilin Province, China
About author:Liu Kexin, MS candidate, Laboratory Academy, Jilin Medical University, Jilin 132001, Jilin Province, China; Beihua University, Jilin 132001, Jilin Province, China
Supported by:
Jilin Province Scientific and Technology Development Project, No. YDZJ202201ZYTS637 (to ZWY); Jilin Medical University Graduate Innovation Program, No. 2023yy01 (to LKX)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
肺纤维化：是一种严重的肺部病变，它的主要病理特征是肺泡间质炎性细胞浸润和肺部胶原蛋白的沉积，病变通常会导致肺功能下降、呼吸困难，甚至因呼吸衰竭而死亡。
自噬：是一种程序性细胞死亡机制，可在自噬相关基因的调控下通过溶酶体降解、清除、回收利用受损细胞器和蛋白以维持细胞内稳态。

背景：自噬对上皮细胞、成纤维细胞和肌成纤维细胞之间的应激作用与肺纤维化的形成过程密切相关。
目的：筛选肺纤维化患者基因水平变化与自噬相关的基因，并探究其与肺纤维化患者预后的关联，以期为临床干预肺纤维化提供新的靶点。
方法：以GSE70866下载的基因表达谱数据集为训练集，利用R语言对肺纤维化患者和正常健康者之间基因表达进行差异分析并与自噬相关基因取交集，鉴定出变化最为显著的差异基因。运用多种分析方法筛选出关键预后基因，并构建基因预后模型。根据肺纤维化患者的风险评分分为高风险组和低风险组，应用Siena cohort和Leuven cohort验证集验证预后模型的有效性。并通过转化生长因子β1诱导HFL-1细胞(人胚肺成纤维细胞)建立肺纤维化细胞模型以及博莱霉素气管滴注建立小鼠肺纤维化动物模型验证预后基因的表达。
结果与结论：①肺纤维化组织和正常组织之间存在2 650个差异基因，其中与自噬相关基因有34个发生显著变化；②Siena cohort和Leuven cohort验证集的Kaplan-Meier生存分析曲线显示，高风险组的存活率明显比低风险组低；③筛选出3个与预后相关的自噬基因：骨髓瘤病病毒癌基因、趋化因子配体2、GABAA型受体相关蛋白样1；④体内外研究均显示与对照组相比，肺纤维化模型组骨髓瘤病病毒癌基因和趋化因子配体2 mRNA及蛋白表达显著升高(P < 0.01，P < 0.05)，而GABAA型受体相关蛋白样1 mRNA及蛋白表达有所降低(P < 0.001)；⑤结论：通过生物信息学方法分析了3个自噬相关基因在肺纤维化中的表达及其与肺纤维化患者预后的相关性，构建的预后模型对肺纤维化患者1，2，3年生存率具有良好的预测能力；并且通过体内和体外模型验证了在肺纤维化细胞和组织中骨髓瘤病病毒癌基因和趋化因子配体2呈高水平表达，GABAA型受体相关蛋白样1呈低水平表达。

https://orcid.org/0009-0001-9358-1769 (刘可新)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 肺纤维化, 自噬, 生物信息学, 差异表达基因, 预后模型, R语言, 博莱霉素, TGF-β1

Abstract: BACKGROUND: The stress effect of autophagy on epithelial cells, fibroblasts and myofibroblasts is closely related to the formation process of pulmonary fibrosis.
OBJECTIVE: To screen the genes related to autophagy in patients with pulmonary fibrosis, and explore their correlation with the prognosis of patients with pulmonary fibrosis, in order to provide a new target for clinical intervention in pulmonary fibrosis.
METHODS: The gene expression profiling dataset downloaded from GSE70866 was used as a training set, differentially expressed genes between pulmonary fibrosis patients and normal healthy individuals was analyzed using the R language and intersected with autophagy-related genes to identify the differentially expressed genes with the most significant changes. Multiple analysis methods were used to identify key prognostic genes and construct genetic prognostic models. Patients with pulmonary fibrosis were divided into high-risk and low-risk groups according to their risk scores, and the validity of the prognostic model was verified using the Siena cohort and Leuven cohort validation sets. A cell model of pulmonary fibrosis was established by inducing HFL-1 cells (human embryonic lung fibroblasts) with transforming growth factor-β1, and an animal model of pulmonary fibrosis was established in mice by tracheal instillation of bleomycin to validate the expressions of prognostic genes.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) There were 2 650 differentially expressed genes between fibrotic tissue and normal tissue. Among them, 34 genes related to autophagy showed significant expression changes. (2) Kaplan-Meier survival analysis curves for the Siena cohort and Leuven cohort validation sets showed significantly lower survival in the high-risk group than in the low-risk group. (3) Three autophagy genes related to prognosis were screened out: myelocytomatosis viral oncogene (MYC), C-C motif chemokine ligand 2 (CCL2), and GABA type a receptor associated protein like 1 (GABARAPL1). (4) Both in vivo and in vitro studies showed that compared with the control group, the expression levels of myelocytomatosis viral oncogene and C-C motif chemokine ligand 2 mRNA and protein were significantly higher in the lung fibrosis model group (P < 0.01, P < 0.05), while the expression levels of GABA type a receptor associated protein like 1 mRNA and protein were lower (P < 0.001). To conclude, bioinformatics methods are used to analyze the expression of three autophagy-related genes in pulmonary fibrosis and their correlation with the prognosis of patients with pulmonary fibrosis. The constructed prognostic model has good predictive ability for the 1-, 2-, and 3-year survival rates of patients with pulmonary fibrosis. Moreover, in vivo and in vitro models have been used to verify that myelocytomatosis viral oncogene and C-C motif chemokine ligand 2 are highly expressed in lung fibroblasts and tissues, and that GABA type a receptor associated protein like 1 is lowly expressed.

Key words: pulmonary fibrosis, autophagy, bioinformatics, differentially expressed genes, prognostic model, R programming language, bleomycin, TGF-β1

中图分类号:

刘可新, 郝凯敏, 庄文越, 李正祎. 自噬相关基因在肺纤维化模型中的表达：生物信息学分析及实验验证[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(5): 1129-1138.

Liu Kexin, , Hao Kaimin, Zhuang Wenyue, , Li Zhengyi. Autophagy-related gene expression in pulmonary fibrosis models: bioinformatic analysis and experimental validation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(5): 1129-1138.

图/表（结果） 8

2.1 差异表达基因的筛选及其与预后基因的关联在数据集GSE70866中鉴定了来自Freiburg cohort的20名健康供者和62例肺纤维化患者的差异表达基因(其中高风险组41个样本，低风险组21个样本)，包括1 099个上调基因和1 551个下调基因(图1A)，鉴定出34个自噬相关的差异表达基因(图1B)。在LASSO回归模型中选择了9个候选基因(图1C，D)；在随机森林(random forest，RF)模型中鉴定出9个候选基因(图1E)；在支持向量机(support vector machine，SVM)模型中选择了33个候选基因(图1F)。基于上述3种模型筛选3个预后自噬基因(MYC、CCL2、GABARAPL1)(图1G)。
2.2 预后模型的构建使用多因素Cox回归分析3个影响肺纤维化的独立因素，其中CCL2和MYC为危险因素，GABARAPL1为保护因素。根据这3个基因得到肺纤维化患者预后的风险评分=0.64×MYC exp+0.25×CCL2 exp+(-1.21×GABARAPL1 exp)的中位数(图2A)，将肺纤维化样本根据风险评分分为高风险组和低风险组。K-M生存曲线显示(图2B)，较低的风险评分与较高的生存率相关。患者的风险评分、生存时间和基因表达水平有关(图2C)。ROC曲线用于评价风险评分预测患者的预后能力，并计算1，2和3年的曲线下面积(area under curve，AUC)分别为0.832，0.815和0.829(图2D)。
2.3 预后模型的评估通过计算肺纤维化患者在诊断后1，2和3年的生存率，构建列线图来估计肺纤维化患者的预后(图3A)，并应用Siena cohort和Leuven cohort验证集进行验证。C指数、校准曲线(图3B)和决策曲线(图3C-E)分析表明，列线图模型的精度高[0.753(0.714-0.792)]。在Siena cohort验证集中，AUC值分别为0.742，0.824和0.932(图4A)。在Leuven cohort验证集中，AUC值分别为0.783、0.714和0.714(图4B)。Siena cohort(图4C)和Leuven cohort验证集的Kaplan-Meier生存分析曲线显示(图4D)，高风险组的存活率明显比低风险组低。
2.4 免疫细胞浸润条形图显示了每个样品中免疫细胞的比例(图5A)。低风险组中活化的肥大细胞(P < 0.001)和活化的自然杀伤细胞(P < 0.01)浸润更多；高风险组中活化的CD4记忆T细胞(P < 0.01)、幼稚B细胞(P < 0.001)、静息下的树突状细胞(P < 0.001)和静息的肥大细胞(P < 0.001)浸润更多(图5B)。
2.5 基因集富集分析为了确定2个风险组的功能，对差异基因进行了基因集富集分析。共发现87个基因集[错误发现率(FDR) < 0.25和P < 0.05]，包括白细胞介素相关(白细胞介素4，白细胞介素10，白细胞介素12，白细胞介素13)途径，基质金属蛋白酶、淋巴细胞和非淋巴细胞之间的相互调节作用(图6)。曲线表示富集评分(enrichment score，ES)的情况，结果显示校正后归一化的ES(NES)值为正，峰出现在左侧，基因集中核心分子主要集中在左侧高风险组中。基因集富集分析的详细信息如表2所示。
2.6 体外细胞模型中自噬基因的表达
2.6.1 体外模型建立显微镜下观察HFL-1细胞形态发现，对照组HFL-1细胞呈梭形且边界清晰，排列

规则，模型组细胞间隙增宽，HFL-1细胞呈扁平状，边界不清晰，细胞核比例增大，并且转化生长因子β1刺激后，HFL-1细胞间的连接变得更加疏松，以上形态学改变证明细胞造模成功(图7A，B)。
2.6.2 qRT-PCR检测结果显示，与对照组比，转化生长因子β1模型组HFL-1细胞的MYC和CCL2 mRNA表达水平升高(P < 0.01，P < 0.05)，GABARAPL1 mRNA表达水平降低(P < 0.001，图7C)。
2.6.3 Western blot检测结果显示，与对照组相比，转化生长因子β1模型组HFL-1细胞的MYC和CCL2 蛋白表达水平升高(P < 0.01，P < 0.001)，GABARAPL1 蛋白表达水平降低(P < 0.001，图7D)。
2.7 体内动物模型中自噬基因的表达
2.7.1 实验动物数量分析实验选用小鼠共20只，分为2组，每组10只，在造模过程中各组小鼠的死亡数为0。
2.7.2 小鼠肺组织苏木精-伊红染色结果对照组小鼠肺组织肺泡结构清晰完整，未发现肺泡炎性渗出及纤维化病变；而博莱霉素模型组肺泡结构紊乱，肺泡壁显著增厚，炎性细胞显著浸润，提示肺纤维化小鼠建模成功(图8A)。
2.7.3 qRT-PCR检测结果与对照组相比，博莱霉素模型组小鼠肺组织中的MYC和CCL2 mRNA表达水平明显升高(P < 0.05，P < 0.01)，而GABARAPL1 mRNA表达水平则有所下降(P < 0.001，图8B)。
2.7.4 Western blot检测结果与对照组相比，博莱霉素模型组小鼠肺组织中的MYC和CCL2 蛋白表达水平明显升高(P < 0.001)，而GABARAPL1 蛋白表达水平则降低(P < 0.001，图8C)。

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引言

材料方法

1.1 设计通过数据库筛选关键靶基因，构建细胞及动物模型进行体内外实验验证。
1.2 时间及地点实验于2023年5月至2024年11月在吉林医药学院检验学院实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 数据来源及在线工具基因表达数据库GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)的GSE70866基因表达谱；R语言(4.2.0)及R程序包(limma包)；人类自噬数据库(Human autophagy databse，HADb，http://www.autophagy.lu/)；基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)Cluster Profiler R软件包(v3.6.0)软件。
1.3.2 主要试剂和仪器博莱霉素(日本株式会社)；F12K培养基(HyClone公司)；转化生长因子β1 (Sigma公司)；1%戊巴比妥钠(国药集团化学试剂有限公司)；β-actin抗体、骨髓瘤病病毒癌基因(Myelocytomatosis viral oncogene，MYC)抗体、趋化因子配体2(C-C motif chemokine ligand 2，CCL2)抗体、GABAA型受体相关蛋白样1(GABA type a receptor associated protein like 1，GABARAPL1)抗体(ABclonal公司)；增强型ECL、RNA抽提试剂盒、反转录试剂盒、QPCR试剂盒(诺唯赞有限公司)；BCA蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；胰酶(Gbico公司)；QPCR仪(Bio-Rad公司)；BX51型显微镜(Olympus公司)；全自动凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)。
1.3.3 细胞实验所用人胚肺成纤维细胞HFL-1细胞购自中国上海生命科学研究院细胞库。用含体积分数10%胎牛血清的F12K培养基培养HFL-1细胞，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养。
1.3.4 实验动物 4周龄的成年雄性ICR小鼠共20只，体质量18-22 g，均由长春亿斯实验动物技术有限公司提供，生产许可证号SCXK(吉)-2018-0007。该研究经过吉林医药学院实验动物伦理委员会审批，批准编号2023-LW005。
1.4 实验方法
1.4.1 筛选差异基因从GEO数据库下载GSE70866基因表达谱数据，包含肺纤维化患者和健康人的肺组织基因表达数据。以GSE70866数据集为训练集，利用R语言及R程序包对GSE70866的基因表达数据进行差异分析，确定肺纤维化组和对照组之间差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)的数据。利用人类自噬数据库筛选自噬相关基因，与差异基因取交集，鉴定出变化最为显著的差异基因。利用基因集富集分析软件中的用Cluster Profiler R软件包(v3.6.0)，运用LASSO回归、生存分析、单因素和多因素Cox回归分析筛选出关键预后基因，并构建基因预后模型。通过计算基因表达量和相应回归系数，对肺纤维化患者进行风险评分，根据模型中位数风险评分将肺纤维化患者分为高风险组和低风险组。为验证预后模型的有效性，应用Siena cohort和Leuven cohort验证集进行验证。通过R语言中的survival包进行Kaplan-Meier(K-M)生存分析和绘制生存曲线，通过R语言中的pROC包绘制受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线。使用CIBERSORT分析2个风险组中22种免疫细胞类型的丰度。从CIBERSO网站下载R脚本，使用R包“ggplot2”将2组人群中22种免疫细胞类型的丰度可视化为小提琴图。
1.4.2 细胞实验分组及给药取对数生长期HFL-1细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，并接种于无菌培养瓶内，调整细胞接种浓度为 5×107 L-1，每瓶均加入细胞悬液5 mL，待HFL-1细胞生长至大约80%融合时，分瓶传代，取第5代细胞进行实验，将细胞分为对照组和转化生长因子β1模型组。对照组使用含体积分数1%血清的F12K培养基培养，转化生长因子β1模型组使用5 ng/mL转化生长因子β1诱导24 h建立肺纤维化细胞模型，给药剂量参考文献[2]中的体外实验。造模后，于倒置相差显微镜下观察HFL-1细胞形态变化。

1.4.3 动物实验分组及给药将ICR小鼠随机分为对照组、博莱霉素模型组，每组10只。造模时称取小鼠体质量，并在腹腔注入1%戊巴比妥钠溶剂35 mg/kg麻醉后，将小鼠定位在手术台上，并在颈部中侧处做一个纵行切口，钝性分开小鼠气管周边组织，用一次性注射器快速注入气管5 mg/kg的博莱霉素(给药剂量综合参考文献[6，9]而确定)建立小鼠肺纤维化模型，为使药物能够在小鼠肺组织内充分扩散，将小鼠呈直立位摇晃3 min。造模后次日，对照组给予同等剂量溶剂，观察28 d后取材，每日观察小鼠生理状态，每2 d称量体质量，并做好记录。

1.4.4 苏木精-伊红染色石蜡切片置入60 ℃恒温箱过夜；将切片浸入二甲苯Ⅰ 10 min，转入二甲苯Ⅱ 10 min，再转入二甲苯Ⅲ10 min进行脱蜡；再依次将切片浸入体积分数95%乙醇5 min，90%乙醇5 min，80%乙醇5 min，70%乙醇5 min，蒸馏水
5 min；进行脱水；将切片浸入苏木精染液5 min；进行染色自来水漂洗3 s后将切片浸入丽春红品红染液5 min染色；用1×PBS 冲洗1 min，2次；将切片浸入苯胺蓝染液2 min染色；用1×PBS 冲洗 1 min；依次将切片浸入体积分数70%乙醇5 min，80%乙醇5 min，90%乙醇5 min，95%乙醇5 min，无水乙醇5 min脱水；将切片浸入二甲苯I 10 min，转入二甲苯Ⅱ 10 min透明；晾干后，用中性树脂封固，镜下观察。
1.4.5 qRT-PCR 检测自噬基因mRNA的表达水平
(1)小鼠肺组织样品处理：冰上取各组小鼠新鲜的右肺组织，电子天平称量15 mg，加入500 μL的Buffer RL1(已加入β-巯基乙醇)后用研钵将组织彻底研磨均匀。
(2)HFL-1细胞样品处理：收集处于对数生长期的HFL-1细胞，按照细胞数量3×105接种于培养瓶中，每瓶加入培养液5 mL，待细胞贴壁按照“1.4.2”分组处理。用胰酶将细胞完全消化后离心留取沉淀。
应用RNA抽提试剂盒提取小鼠肺组织和HFL-1细胞总RNA，按HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR 反转录试剂盒说明书步骤合成cDNA。按ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒说明书步骤进行实时荧光定量PCR扩增反应。在NCBI(National

Coalition Building Institute)中查找基因序列，用Primer Premier 6.0软件设计引物。扩增反应条件：①95 ℃ 30 s；②95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s (40个循环)，绘制熔解曲线。采用2-ΔΔCt法进行相对定量。引物序列如表1所示。

1.4.6 Western blot法检测自噬相关基因蛋白的表达水平
(1)小鼠肺组织样品处理：于冰上剪取各组小鼠肺组织20 mg，加入180 μL裂解液，裂解1 h，12 000 r/min离心4 ℃ 5 min，取透明上清备用。
(2) HFL-1细胞样品处理：HFL-1细胞按照3×105接种于培养瓶中，每瓶加入培养液5 mL，待细胞贴壁按照“1.4.2”分组处理后，将细胞消化离心，加入80 μL RIPA裂解液，冰上裂解1 h至完全裂解，取上清。
组织和细胞样品的总蛋白浓度用蛋白BCA试剂盒测定，用10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离凝胶分离45 μg蛋白并转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜中。5%脱脂牛奶25 ℃下封闭1 h，加入MYC(1∶1 000)、CCL2(1∶1 000)、GABARAPL1
(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)特异性抗体孵育过夜。用含吐温-80(TBS-T)的Tris缓冲液洗涤，加入抗兔辣根过氧化物酶抗体(1∶10 000)孵育1 h。用增强型ECL显影液显色，全自动凝胶成像系统采集和分析数据。
1.5 主要观察指标 ①肺纤维化预后与自噬相关基因的筛选结果；②肺纤维高风险组及低风险组生存曲线下面积；③ROC和Kaplan-Meier生存曲线评估预后模型；④小鼠肺组织病理变化；⑤肺组织及HFL-1细胞中MYC、CCL2和GABARAPL1的mRNA和蛋白表达。
1.6 统计学分析采用SPSS 24.0软件和GraphPad Prism 9. 0 R 4. 3. 2 统计软件进行统计学分析并绘制图像。2组数据的比较用非参数曼惠特尼检验(Mann-Whitney test)；多组变量的比较用鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskal-Wallis test，K-W)。风险评分符合正态分布，依据中位数分为低风险组和高风险组。计量资料以x±s表示，行方差齐性检验，多组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05被认为差异有显著性意义。文章的统计学方法已经通过吉林医药学院生物统计学专家审核。

讨论

肺纤维化的临床特征是肺功能减退和进行性呼吸困难[10]。导致肺纤维化的原因很多，主要包括免疫异常[11]、病毒感染[12]、环境污染[13]、放射线、化学品及药物等[9]。肺纤维化的发病率正逐年上升，但目前尚无有效的治疗方法，且预后极差[14]。自噬是一种重要的生理机制，它能够帮助机体维持动态平衡。自噬功能紊乱导致许多疾病，如自身免疫性疾病[15]、肿瘤[16]、纤维化和神经退行性疾病[17-18]。自噬在肺纤维化中起着复杂但关键的调节作用[19]。自噬可以清除受损的线粒体，减少氧化应激和炎症反应[20-21]，还可以调节细胞外基质的合成和降解，维持细胞外基质的平衡[22]，防止过度沉积和纤维化并且可以调节细胞凋亡和存活，维持细胞的稳态，防止细胞过度死亡和纤维化[23]。
此次研究在Freiburg cohort中肺纤维化组和健康组之间总共确定了34个与自噬相关的差异表达基因。使用3种机器学习方法筛选了与预后相关的3个基因。使用单/多因素Cox对预后基因进行回归分析并构建预后模型，结果显示与肺纤维化有关的3个影响肺纤维化基因中，CCL2和MYC为保护因素，GABARAPL1为危险因素。根据这 3个基因得到肺纤维化患者预后风险评分的中位数，将肺纤维化样本分为高风险组和低风险组，并分别进行K-M生存分析，发现高风险评分的患者总生存期比低风险评分的患者更差，即GABARAPL1是肺纤维化的保护性预后基因，基因的mRNA高水平与患者的不良预后呈负相关；MYC和CCL2是肺纤维化的危险性预后基因，这2个基因的mRNA高水平与患者的不良预后呈正相关。预后模型在Siena cohort和Leuven cohort验证集中得到验证。ROC曲线表明，风险评分模型具有可靠有效的预测精度。在Siena cohort验证集中，AUC值分别为0.742，0.824和0.932，在Leuven cohort验证集中，AUC值分别为0.783，0.714和0.714，表明预后模型预测总生存率的能力较强。该预后模型可以良好地预测肺纤维化患者1，2，3年生存情况，为肺纤维化患者治疗提供帮助。
MYC是一种位于mTOR下游的转录因子，在生长因子存在的情况下可以刺激成纤维细胞的增殖[24]。在纤维化过程中，MYC表达减少介导纤维连接蛋白和胶原沉积到细胞外基质中，并减弱细胞增殖[25]。研究发现，大鼠肺泡巨噬细胞培养可促进成纤维细胞内MYC mRNA水平增高，而氧自由基对促成纤维细胞内MYC mRNA水平增高有抑制作用[26]。在肺纤维化形成过程中，肺泡巨噬细胞所产生的氧自由基对MYC表达起调控作用，使其表达增高，成纤维细胞增殖，最终导致肺纤维化[27]。研究表明，MYC高表达可以增强自噬机制，促进肿瘤细胞的生长和治疗抵抗[28]。而沉默MYC能够激活JNK1-Bcl2通路抑制自噬体形成，抑制自噬[29]。在肺纤维化中，MYC可能通过诱导特发性肺纤维化患者原代成纤维细胞分化为衰老相关分泌表型(SASP)，从而加重其纤维化表现[30]。干扰MYC后，阻断下游的smad2/3通路，细胞无法响应转化生长因子β1刺激，无法产生促纤维化的效应，从而阻止纤维化进程[31]。
CCL2是一种人类肝素的基因，是第一种被报道的人趋化因子，是促炎细胞因子信号的重要来源，能够有效地吸引单核和中性粒细胞，从而发挥促炎作用[32]。CCL2的表达增加与凝血酶在肺损伤期间发挥的强效促纤维化作用有关[33]。转录因子与CCL2启动子中的核因子κB和激活蛋白1 (AP-1) 元件的结合增加有助于凝血酶刺激后的活性转录。此外，CCL2还可能通过增加纤维细胞募集，成纤维细胞增殖及纤维化细胞因子转化生长因子β的产生等机制直接参与肺纤维化[34]。CCL2也能激活成纤维细胞，提示CCL2是介导自噬-成纤维细胞相互作用的关键信号[35]。
γ-氨基丁酸受体相关蛋白(GABARAP)家族是一组重要的蛋白质，而GABARAPL1是其中一个重要的成员，它们在调节细胞内的自噬和受体向方面发挥着重要作用[36]。通过调节基本的细胞过程，如自噬和受体向质膜的运输，促进细胞内环境的稳定[37]。GABARAPL1是自噬体形成的关键节点，通过结合于自噬前体或溶酶体膜上使自噬前体膜性结构不断延伸，直至完全包裹待降解的细胞质组分，由此形成自噬体[38]。此次研究结果显示在肺纤维化细胞和动物模型中预后相关的自噬基因MYC和CCL2呈高水平表达，GABARAPL1呈低水平表达，这与生物信息学分析结果一致，这3个基因可能成为肺纤维化治疗潜在的靶向性分子。
综上所述，此次研究从GSE70866和自噬数据集筛选出肺纤维化与非肺纤维化患者中差异表达的基因，通过Cox比例风险回归分析最终得到3个与肺纤维化预后相关的自噬基因并构建风险预后模型，该模型对肺纤维化患者1，2，3年生存率具有良好的预测能力。同时，通过构建体内和体外的肺纤维化模型，验证了3个自噬相关基因在肺纤维化中的表达水平，发现 MYC和CCL2在疾病组中呈高水平表达，GABARAPL1呈低水平表达，为后续深入机制研究及开发新的靶向治疗药物提供了研究数据。此次研究通过生物信息学方法分析了MYC、CCL2和GABARAPL1 在肺纤维化中的表达及其与肺纤维化患者预后的相关性，为肺纤维化潜在标志物及治疗靶点的开发提供新思路。自噬是一个复杂的细胞过程，涉及许多基因，研究仅筛选出3个自噬基因可能无法全面反映自噬在肺纤维化中的作用，后续将深入开展研究，进一步揭示自噬与肺纤维化预后的关系。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

自噬相关基因在肺纤维化模型中的表达：生物信息学分析及实验验证

Autophagy-related gene expression in pulmonary fibrosis models: bioinformatic analysis and experimental validation

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