自噬影响组蛋白修饰标记H3K4me3调控小鼠早期胚胎发育

doi:10.12307/2026.022

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (5): 1147-1155.doi: 10.12307/2026.022

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自噬影响组蛋白修饰标记H3K4me3调控小鼠早期胚胎发育

胡静1，朱伶2，谢娟2，孔德营1，刘豆豆2

1遵义医科大学基础医学院生理学教研室，贵州省遵义市 563099；2重庆医科大学附属妇女儿童医院，重庆市妇幼保健院人类胚胎工程重庆市重点实验室，重庆市 400013

收稿日期:2024-11-02 接受日期:2024-12-28 出版日期:2026-02-18 发布日期:2025-06-24
通讯作者: 刘豆豆，博士，重庆医科大学附属妇女儿童医院，重庆市妇幼保健院人类胚胎工程重庆市重点实验室，重庆市 400013 并列通讯作者：孔德营，博士，副教授，遵义医科大学基础医学院生理学教研室，贵州省遵义市 563099
作者简介:胡静，男，1997年生，汉族，遵义医科大学在读硕士，主要从事早期胚胎自噬方面的研究。
基金资助:
重庆市科技局项目(CSTB2022NSCQ-MSX0875)，项目参与人：谢娟；国家自然科学基金项目(31760339)，项目参与人：孔德营；贵州省科技计划项目[黔科合基础-ZK(2022)一般594]，项目参与人：孔德营

Autophagy regulates early embryonic development in mice via affecting H3K4me3 modification

Hu Jing1, Zhu Ling2, Xie Juan2, Kong Deying1, Liu Doudou2

1Department of Physiology, School of Basic Medical Sciences, Zunyi Medical University, Zunyi 563099, Guizhou Province, China; 2Chongqing Key Laboratory of Human Embryo Engineering, Chongqing Health Center for Women and Children, Chongqing 400013, China

Received:2024-11-02 Accepted:2024-12-28 Online:2026-02-18 Published:2025-06-24
Contact: Liu Doudou, PhD, Chongqing Key Laboratory of Human Embryo Engineering, Chongqing Health Center for Women and Children, Chongqing 400013, China Co-corresponding author: Kong Deying, PhD, Associate professor, Department of Physiology, School of Basic Medical Sciences, Zunyi Medical University, Zunyi 563099, Guizhou Province, China
About author:Hu Jing, Master candidate, Department of Physiology, School of Basic Medical Sciences, Zunyi Medical University, Zunyi 563099, Guizhou Province, China
Supported by:
a grant from Chongqing Science and Technology Bureau, No. CSTB2022NSCQ-MSX0875 (to XJ [project participant]); National Natural Science Foundation of China, No. 31760339 (to KDY [project participant]); Guizhou Science and Technology Program Project, No. Qiankeheji ZK(2022)General 594 (to KDY [project participant])

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
自噬：是在自噬相关基因(Atg)的调控下利用溶酶体降解受损细胞器、错误折叠蛋白质等物质以应对饥饿、内质网应激、缺氧等各种压力的生物学过程。研究表明，自噬在细胞稳态、衰老、凋亡以及神经退行性疾病等多种生理病理过程中发挥重要作用。
H3K4me3：是一种组蛋白修饰标记，具体指组蛋白H3赖氨酸4位点的三甲基化修饰。H3K4me3修饰主要位于基因的启动子区域，与基因的转录激活相关联。
CUT&Tag测序：即靶向剪切及转座酶技术，是一种利用酶锚定技术进行高效、高分辨率的DNA测序文库构建方法，同时是一种新的DNA-蛋白质互作研究方法，可用于检测组蛋白、RNApolymeraseII和转录因子等具有DNA结合功能的蛋白种类，揭示更多染色质在调控基因表达方面的重要作用，有助于分析细胞量少的样本的特定染色质特征，进一步了解基因调控。

背景：自噬作为细胞发育的一个关键调控机制，在胚胎发育的不同阶段发挥着重要作用。目前对于胚胎中自噬如何通过组蛋白修饰来调控胚胎发育的机制尚不明确。
目的：探究胚胎中自噬对H3K4me3修饰的影响以及对胚胎发育的影响。
方法：将小鼠受精卵分为对照组和自噬抑制剂处理组(磷酸氯喹处理组，3-甲基腺嘌呤处理组)，分别体外培养至不同时期，分为早期2-细胞胚胎、中期2-细胞胚胎、晚期2-细胞胚胎、4-细胞胚胎、8-细胞胚胎、桑葚期胚胎、囊胚期胚胎。通过免疫荧光检测分析各组晚期2-细胞胚胎的活性氧、自噬标记蛋白LC3B、P62和DNA损失标记物γH2AX以及各阶段胚胎组蛋白H3K4me3的表达；通过染色体靶向切割和标签化(CUT&Tag)检测各组晚期2-细胞胚胎中H3K4me3修饰变化。
结果与结论：①自噬抑制后，小鼠胚胎发育阻滞；②免疫荧光结果显示，自噬抑制后，与对照组相比，自噬抑制剂处理组的活性氧和γH2AX没有显著差异；③自噬抑制剂处理相对于对照组晚期2-细胞胚胎的H3K4me3水平显著升高；④CUT&Tag结果显示，自噬抑制后，H3K4me3在基因近端启动子区域富集显著增加，并且H3K4me3特异性结合基因增多；⑤结果表明，自噬可能通过调控H3K4me3修饰水平从而影响胚胎发育。

https://orcid.org/0009-0004-9082-3891 (胡静)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 小鼠, 自噬, H3K4me3, 胚胎发育, 组蛋白修饰, 活性氧, DNA损伤, 小鼠胚胎, 甲基化

Abstract: BACKGROUND: Autophagy, as a key regulatory mechanism of cell development, plays an important role in different stages of embryonic development. The mechanism of how autophagy regulates embryonic development through histone modifications is currently unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effect of autophagy on trimethylation of lysine 4 on histone H3 (H3K4me3) modification in embryos and its effect on embryonic development.
METHODS: Mouse fertilized eggs were divided into control and autophagy inhibitor-treated groups (chloroquine phosphate-treated group and 3-methyladenine-treated group), and cultured in vitro to different periods of time, and were then classified as early 2-cell embryos, middle 2-cell embryos, late 2-cell embryos, 4-cell embryos, 8-cell embryos, morula stage, and blastocyst stage. Levels of reactive oxygen species, autophagy marker proteins LC3B and P62, DNA loss marker γH2AX, and H3K4me3 were analyzed by immunofluorescence assay in late 2-cell embryos of each group. Changes in H3K4me3 modification in late 2-cell embryos of each group were detected by CUT&Tag.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Autophagy inhibition caused embryo development arrest. (2) There was no significant difference in reactive oxygen species and γH2AX between the autophagy inhibitor-treated groups and control group. (3) H3K4me3 levels were significantly elevated in the autophagy inhibitor-treated group compared with the control group. (4) CUT&Tag results showed a significantly increased H3K4me3 peaks on the proximal promoter region of the genes after autophagy inhibition and an increase of H3K4me3-specific modification genes. These findings suggest that autophagy may affect embryonic development by regulating the level of H3K4me3 modification.

Key words: mouse, autophagy, H3K4me3, embryonic development, histone modification, reactive oxygen species, DNA damage, mouse embryo, methylation

中图分类号:

胡静, 朱伶, 谢娟, 孔德营, 刘豆豆. 自噬影响组蛋白修饰标记H3K4me3调控小鼠早期胚胎发育[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(5): 1147-1155.

Hu Jing, Zhu Ling, Xie Juan, Kong Deying, Liu Doudou. Autophagy regulates early embryonic development in mice via affecting H3K4me3 modification[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(5): 1147-1155.

图/表（结果） 5

2.1 自噬抑制影响早期胚胎发育为了评估自噬抑制后对胚胎发育的影响，将小鼠受精卵分别放入含3-MA和磷酸氯喹的培养液中培养。结果显示，3-MA处理组(n=20)所有胚胎发育都没有超过4-8-细胞阶段(P < 0.001)，而磷酸氯喹处理组(n=20)的胚胎50%停滞在2-细胞阶段(P < 0.01)，45%在4-8-细胞阶段阻滞(P < 0.001)，见图1A，B和表1。对晚期2-细胞自噬相关蛋白的免疫荧光检测结果显示，3-MA处理组(n=13)的LC3B水平相对对照组(n=15)显著下降(P < 0.001)，磷酸氯喹处理组(n=12)的LC3B水平明显升高(P < 0.000 1)，见图1C，D。此外，P62蛋白水平在3-MA处理组(n=12，P < 0.01)和磷酸氯喹处理组(n=15，P < 0.001)中均明显升高，见图1E，F。以上结果表明自噬抑制会造成胚胎发育阻滞。

2.2 自噬抑制不诱导胚胎的活性氧和DNA损伤 3-MA和磷酸氯喹处理后检测小鼠晚期2-细胞胚胎的活性氧和DNA损伤标记物γH2AX，结果显示，3-MA处理组(n=18)和磷酸氯喹处理组(n=17)的活性氧水平与对照组(n=15)无明显差异(P > 0.05)，见图2A，B。γH2AX的免疫染色结果表明，3-MA处理组(n=19)与对照组(n=16)相比没有显著差异(P > 0.05)，磷酸氯喹处理组(n=13)相对于对照组(n=16)没有显著差异(P > 0.05)，见图2C，D。综合以上结果表明自噬抑制对胚胎发育的影响不是由活性氧和DNA损伤引
起的。
2.3 自噬抑制导致胚胎H3K4me3修饰水平增强
2.3.1 各阶段胚胎的H3K4me3水平为了明确小鼠早期胚胎发育过程中H3K4me3修饰的动态变化，通过免疫荧光检测了小鼠胚胎从受精卵到囊胚阶段的H3K4me3水平。结果显示，H3K4me3修饰水平从受精卵到早期2-细胞阶段增强，从中期2-细胞到4-细胞阶段逐渐减弱并降到最低；从4-细胞一直到囊胚阶段又逐渐升高，但这一阶段H3K4me3的总体表达量相对于合子到中期2-细胞阶段较低，见图3A，B。
2.3.2 自噬抑制后H3K4me3的表达为了明确自噬抑制后对H3K4me3修饰是否产生影响，用3-MA和磷酸氯喹处理胚胎后通过免疫荧光检测了晚期2-细胞胚胎的H3K4me3的表达量。结果显示，3-MA(n=9)和磷酸氯喹处理组(n=17)的H3K4me3水平相较于对照组(n=17)均显著升高(P < 0.001)，见图3C，D。
以上结果表明，H3K4me3在胚胎发育过程中经历了修饰逐渐减少然后又逐渐增多的动态变化，在晚期2-细胞时期，胚胎的H3K4me3修饰水平降到了较低水平，自噬抑制剂导致该时期胚胎的H3K4me3修饰水平升高，这可能是自噬抑制造成胚胎发育阻滞的原因之一。
2.4 自噬抑制导致胚胎的H3K4me3修饰模式和强度改变为进一步确定自噬抑制对H3K4me3修饰的影响，进行了CUT&Tag检测分析。结果显示，相较于对照组，磷酸氯喹处理组H3K4me3整体的修饰水平增加(图4A)。通过分类H3K4me3修饰区域，结果显示磷酸氯喹处理后，H3K4me3在近端启动子区域内富集明显增加(图4B)，且热图分析和IGV示例图显示，H3K4me3在转录起始位点(TSS)附近修饰增强(图4C，D)。对H3K4me3修饰基因进行分类分析，结果显示磷酸氯喹处理后，H3K4me3修饰水平特异性增加的基因数量显著增多(图4E)，对修饰水平特异性增加的基因进行GO功能富集分析显示，这些基因主要参与细胞形态发生、细胞连接和细胞增殖的调控(图4F)。以上结果说明自噬通过改变H3K4me3的修饰模式，影响与细胞形态、细胞连接和细胞增殖等关键生物学过程，从而调控胚胎的正常发育。

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引言

自噬是细胞中通过降解受损细胞器、错误折叠蛋白等物质来应对饥饿、内质网应激、缺氧等各种压力的生物学过程，也是维持细胞稳态的正常生理活动，与细胞分化、发育和衰老等生物学过程密切相关[1-3]。在自噬过程中，微管相关蛋白1轻链3B(microtubule associated protein 1 light chain 3B，LC3B)和P62可作为重要的蛋白标记物。其中，LC3B-Ⅰ可被脂化为膜结合的LC3B-Ⅱ，并定位于自噬体膜上，常被用于衡量自噬活性的高低。P62是一种选择性自噬底物，通过与LC3B相互作用将结合的泛素化蛋白运输到自噬体中，最终被溶酶体降解[4-5]。研究发现自噬不仅在体细胞中发挥作用，在早期胚胎中同样具有重要意义[5-6]。在小鼠卵母细胞中自噬活性较低，受精4 h后自噬被激活，直到4-细胞阶段仍有较强的自噬活性。研究发现早期胚胎不同时期自噬水平不同，年轻小鼠和老龄小鼠胚胎的自噬活性也有显著差异。自噬水平和胚胎的发育能力相关，有研究表明自噬缺陷的胚胎蛋白质合成率降低[7-8]，缺乏关键自噬基因，如Atg7或Beclin1则会导致胚胎发育异常或阻滞[9-10]。但是目前关于自噬影响胚胎发育的机制研究甚少，有待深入探究。
组蛋白H3第4位赖氨酸(H3K4)甲基化首次发现于鳟鱼睾丸中[11]。随后的研究中，组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化(trimethylation of lysine 4 on histone H3，H3K4me3)被认为与基因的转录活性相关[12-14]。H3K4me3富集与活跃基因启动子区域，通过招募转录激活因子促进基因启动子区域的染色质开放状态，从而激活基因录[13-14]。在胚胎发育过程中，H3K4me3的动态变化对于精确调控基因表达模式至关重要，可直接影响胚胎发育和细胞命运决定[15-18]。最近，有研究通过低输入染色质免疫沉淀测序(chromatin
immunoprecipitation-sequencing，ChIP-seq)方法描绘了小鼠早期胚胎中合子基因组激活(zygotic genome activation，ZGA)和第一细胞命运决定期间组蛋白修饰的全基因图谱[15-16，19]，发现在卵母细胞中，约22%的小鼠卵母细胞基因组与宽的H3K4me3结合区域相关[15]，该结合区域被定义为一种非经典的H3K4me3(ncH3K4me3)。与经典的H3K4me3在启动子富含CpG区域的尖锐峰不同，ncH3K4me3在成熟卵母细胞基因启动子和远端位点处以宽峰形式存在，且与DNA甲基化区域重叠并呈负相关性[15-16]。受精后，ncH3K4me3直到ZGA阶段才被经典的H3K4me3所取代[16]。在牛卵母细胞到胚胎转变过程中也有类似的发现[20]。这些研究表明H3K4me3 在卵母细胞到合子过渡(maternal-zygotictransition，MZT)以及合子基因组激活(ZGA)过程中扮演着重要角色，且其修饰模式呈现出动态变化。
研究表明组蛋白修饰与自噬调控相关。例如，饥饿诱导的自噬使甲基转移酶G9a从核心自噬基因启动子区域脱离，导致组蛋白H3第9位赖氨酸二甲基化(H3K9me2)减少和组蛋白H3第9位赖氨酸乙酰化(H3K9ac)增加[21]。自噬诱导还可影响精氨酸甲基转移酶(coactivator-associated arginine methyltransferase 1，CARM1) 的稳定性，从而调控组蛋白H3第17位精氨酸(H3R17)的甲基化修饰[22]。FÜLLGRABE等[23]的研究指出，自噬的增加会导致酵母到人类等多种物种的细胞中H3K4me3水平的改变，但并未深入研究其中的机制。在早期胚胎方面，自噬变化是否会通过影响H3K4me3的修饰进而对胚胎发育产生作用，目前尚无相关报道。因此，此次研究通过抑制小鼠胚胎的自噬水平，探究自噬对H3K4me3修饰的调控情况及其对胚胎发育的影响，有望为提高胚胎发育率和辅助生殖成功率提供理论支持。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外胚胎学实验。
1.2 时间及地点实验于2023年6-11月在重庆市妇幼保健院人类胚胎工程重庆市重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物雌性ICR小鼠140只(6-8周龄)，雄性ICR小鼠28只，购自中国北京斯贝福(SPF)生物技术公司。动物实验经重庆市妇幼保健院实验动物福利伦理委员会批准(批准号：2024076)。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物经颈椎脱臼法处死。
1.3.2 胚胎培养试剂 KSOM培养基(货号MR-121-D)、M2培养液(货号M716)均购自Sigma公司。
1.3.3 药物自噬抑制剂基磷酸氯喹(Chloroquine，货号HY-17589A)、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyl adenine，3-MA，货号HY-19312)均购自MedChemExpress公司。
1.3.4 主要试剂盒 Hoechst 33342(货号C1022)、活性氧检测试剂盒(货号S0033S-1)均购自碧云天公司；染色体靶向切割和标签化(clevage under target and tagment，CUT&Tag)试剂盒(货号TD903-02)、VAHTS DNA Clean Beads(货号N411)均购自诺唯赞公司；孕马血清激素(PMSG，百奥莱博)；人绒毛膜促性腺激素(HCG，武汉纯度生物科技有限公司)。
1.3.5 抗体兔抗SQSTM1/p62(货号ab109012，RRID：AB_2810880)购自abcam公司；兔抗LC3B(货号2775S)、兔抗H3K4me3(货号9751S)、兔抗H2A.X(9718S)均购自CST公司；Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG(货号A11008)购自赛默飞公司。
1.4 实验方法
1.4.1 受精卵获取选取6-8周龄ICR雌鼠，注射 10 IU孕马血清激素48 h后进行10 IU人绒毛膜促性腺激素注射，与ICR雄鼠合笼。注射人绒毛膜促性腺激素16-17 h后收集受精卵，放入KSOM培养液中于体积分数5% CO2培养箱中培养。胚胎体外培养至不同时期：注射人绒毛膜促性腺激素后31-32 h为早期2-细胞胚胎，39-40 h为中期2-细胞胚胎，46-48 h为晚期2-细胞胚胎，54-56 h为4-细胞胚胎，68-70 h为8-细胞胚胎，76-78 h为桑葚期胚胎，88-102 h为囊胚期胚胎。
1.4.2 药物处理参考产品说明书细胞实验使用剂量，将受精卵分别放入含有自噬抑制剂20 μmol/L磷酸氯喹(磷酸氯喹处理组)和5 mmol/L 3-MA(3-MA处理组)的KSOM培养液中，放入体积分数5% CO2培养箱中培养，培养至晚期2-细胞胚胎；对照组受精卵仅用KSOM培养液培养。
1.4.3 活性氧检测按照活性氧检测试剂盒说明书，将晚期2-细胞胚胎移至含10 μmol/L 活性氧荧光探针(DCFH-DA)的KSOM培养液中孵育30 min，然后用M2培养液洗涤胚胎3次，使用激光共聚焦显微镜测量488 nm激发和525 nm发射波长的荧光强度检测细胞内的活性氧水平。
1.4.4 免疫荧光小鼠胚胎用酸性操作液(0.3%HCl)去除透明带后，在固定液(40 g/L多聚甲醛)中室温固定30 min，然后在1%Triton X-100中透膜10 min，在洗涤液(0.1%吐温20，0.01%Triton X-100)中洗涤3次后将胚胎置于含1%牛血清白蛋白(BSA) 的PBS中室温封闭1 h。在4 ℃一抗[LC3B、P62、磷酸化组蛋白H2AX(phosphorylated H2AX，γH2AX)、H3K4me3]孵育过夜。第2天，在洗涤液中洗涤胚胎3次，并在室温下孵育二抗1 h，然后用Hoechst 33342染细胞核10 min，在洗涤液中洗涤胚胎后用抗荧光淬灭剂封固，最后用激光共聚焦显微镜检测荧光强度。同一蛋白参数设置一致，将目的蛋白荧光强度比上DAPI荧光强度进行标准化后，得到标准化后的荧光强度值，再各组之间进行比较。
1.4.5 CUT&Tag 使用Hyperactive InSitu ChIP Library Prep Kit for Illumina (TD903-02)试剂盒完成DNA测序文库的构建。用Dig-wash buffer润洗胚胎2次，放入含0.5 μg抗体和50 μL Antibody Buffer，4 ℃孵育过夜。用Dig-wash buffer缓冲液洗涤2次后，放入含1 μg 二抗和100 μL Dig-wash buffer，室温孵育1 h。用Dig-wash buffer洗涤2次后，加入含1 μL pA/G和49 μL Dig-300 buffer，室温孵育1 h。Dig-300 buffer清洗2次，放入含10 μL 5×TTBL和40 μL Dig-300 buffer(每个样本50 μL)。金属浴37 ℃孵育60 min。
每个样本加1.75 μL 0.5 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、0.5 μL 10%十二烷基硫酸钠(SDS)和0.5 μL 20 mg/mL蛋白酶k，涡旋混匀，50 ℃孵育1 h。加入50 μL DNA提取液(4 ℃)，涡旋1 min，13 000 r/min离心10 min。吸上清 (水相上层)，量体积，加体积1/10的3 mol/L NaAc pH 5.2(ST351，室温放置)，然后加1 μL的糖原。加上清等体积的异丙醇，-80 ℃放置30 min。4 ℃ 13 000 r/min离心30 min。去上清，留下蓝色斑点，用预冷的体积分数80%乙醇清洗，静置5 min。离心5 min，弃上清，留蓝色斑点，晾干，加入15 μL无酶水溶解。文库扩增：①灭菌PCR管中：移液器吹打混匀，实验体系：片段化DNA 15 μL，2x CAM 25 μL，N5xx 5 μL，N7xx 5 μL。②PCR仪：72 ℃ 3 min，95 ℃ 3 min，(98 ℃ 10 s + 60 ℃ 10 s)× (9-20)循环，72 ℃ 5 min，4 ℃∞。吸取75 μL VAHTS DNA Clean Beads至扩增产物中，室温孵育5 min。置于磁力架上分离磁珠和液体，移除上清。加入200 μL 新鲜配置的体积分数80%乙醇漂洗磁珠2次，每次30 s。开盖空气干燥3-5 min。加入20 μL 无酶水充分吹打混匀磁珠，室温孵育5 min。置于磁力架分离磁珠和液体，吸取20 μL上清转移到新的EP管中。CUT&Tag测序由深圳市吉因加医学检验实验室完成，并对磷酸氯喹处理组H3K4me3特异性增加的区域对应基因进行GO富集分析。
1.5 主要观察指标 ①早期胚胎发育率；②胚胎的活性氧和DNA损伤情况；③胚胎H3K4me3修饰水平；④胚胎的H3K4me3修饰模式和强度。
1.6 统计学分析使用SPSS 29.0 软件统计分析。数据以平均值±标准误表示，单因素方差分析用于评估组间差异。利用 GraphPad Prism 9.0 软件绘图。文章统计学方法已经通过遵义医科大学基础医学院生物统计学专家审核。

讨论

哺乳动物早期胚胎发育是一个高度复杂且连续的过程，受众多通路的精细调节，其中自噬活性的变化对胚胎发育有重要作用。在小鼠胚胎中，自噬活性于受精后4 h激活，TSUKAMOTO等[24]通过显微注射GFP-LC3B到胚胎中监测胚胎的自噬活性变化，观察到自噬活性在胚胎的不同时期呈现动态变化，并且不同年龄阶段小鼠胚胎的自噬活性也不相同。有研究表明，Atg5(自噬相关蛋白5)敲除的卵母细胞与Atg5缺失的精子受精，胚胎发育在4-细胞或8-细胞阶段受阻[7]。此次研究通过使用自噬抑制剂3-MA和磷酸氯喹抑制小鼠胚胎自噬，进一步证实了自噬异常的胚胎发育阻滞的现象。有研究表明核移植胚胎用自噬激活剂雷帕霉素处理后胚胎发育潜能得到改善[25-27]。由此可见，自噬在早期胚胎发育中不可或缺，但是目前关于自噬造成胚胎发育阻滞的机制尚不明确。
在着床前胚胎中，活性氧作为线粒体代谢的副产物，对于正常的胚胎形成至关重要[28]。研究表明，较低水平的活性氧可以作为重要的信号分子，通过调控关键转录因子(如核因子κB)促进胚胎致密化和囊胚形成[29-30]。然而，过量的活性氧会导致胚胎DNA损伤和基因表达异常，从而诱导细胞凋亡，导致胚胎碎片化[28]。通过抗氧化剂减少细胞内过量的活性氧，可有效改善胚胎的发育[28，31]。此次研究中，检测了自噬抑制剂处理后晚期2-细胞胚胎的活性氧水平和DNA损伤标志物γH2AX，结果显示自噬抑制并未引起显著的氧化应激和DNA损伤，表明这些因素不是主要导致胚胎发育阻滞的因素。
组蛋白修饰作为整个着床前胚胎发育过程中的关键调控事件，影响转录调节因子与染色质的相互作用[32-33]。其中，H3K4me3是基因转录激活的表观遗传学标志，在卵母细胞成熟和胚胎发育中起重要作用[34]。有研究显示，卵母细胞受精后，H3K4me3在父本和母本基因组以及胚胎基因组中呈现出显著的动态变化，这种变化在调控胚胎发育过程中基因表达的时序性，以及母源向合子的转变起着关键作用[16，19]。此次研究通过检测早期胚胎各时期的H3K4me3表达量发现，从合子到早期2-细胞阶段，H3K4me3修饰水平增强，随后到4-细胞阶段逐渐降低至最低；随后，4-细胞阶段到囊胚阶段，H3K4me3修饰水平略微上升，再次证明了胚胎发育过程中H3K4me3的动态变化。多项研究表明，胚胎中H3K4me3修饰水平的改变对胚胎发育相关基因的表达具有显著影响，最终影响胚胎的正常发育。例如，研究发现KDM5家族(如KDM5A、KDM5B、KDM5C等)在不同物种胚胎中作为H3K4me3去甲基化酶，通过精准调控H3K4me3修饰状态，间接影响基因表达，从而在胚胎发育的关键阶段如ZGA、谱系分化和囊胚形成等过程发挥重要作用。当通过敲低或敲除KDM5家族改变胚胎基因组中H3K4me3修饰水平，可导致胚胎发育阻滞或异常[19，35]。DANG等[20]研究也表明，在牛胚胎中，KDM5A-5C的缺失导致H3K4me3水平升高，干扰超过1 000个基因的表达，从而导致囊胚率显著降低。在此次研究中，发现抑制胚胎自噬后，晚期2-细胞胚胎的H3K4me3修饰显著升高，因此自噬抑制造成的H3K4me3修饰水平的升高，可能是导致胚胎发育阻滞的原因之一。研究进一步探究了抑制胚胎自噬后H3K4me3修饰的具体位置变化。CUT&Tag结果显示，自噬抑制后H3K4me3在基因近端启动子区域富集增多；磷酸氯喹处理组中，H3K4me3特异性结合的基因数量明显增多，这些基因的功能主要和胚胎分裂、染色体分离等相关。这表明自噬抑制后可能造成胚胎发育相关基因的H3K4me3修饰增强，进而导致这些基因的异常转录，从而影响胚胎发育。值得注意的是，在其他细胞中，H3K4me3同样具有重要的调控功能，例如，在心肌细胞中，组蛋白甲基转移酶复合物亚基CXXC锌脂蛋白1(Cfp1)缺失可导致的H3K4me3修饰水平降低，可通过影响成熟相关基因的表达，从而复杂地影响成熟过程[36]。在癌症研究中，H3K4me3修饰可调节细胞增殖和生长相关基因表达，从而影响肿瘤的发生发展。例如，在结直肠癌中，敲低H3K4甲基转移酶复合物的核心亚基DPY30引起的H3K4me3异常可导致其与PCNA、Ki67 和细胞周期蛋白A2启动子区域的结合降低，从而抑制结直肠癌细胞增殖和周期进程[37]。这些研究表明，H3K4me3作为一种关键表观遗传标记，在多种细胞中具有广泛的调控作用。
此项研究初步发现自噬水平改变会造成胚胎的H3K4me3修饰位置以及修饰水平改变从而影响胚胎发育，为自噬影响胚胎发育的机制提供了新的证据。目前研究发现，高龄胚胎的自噬水平下降，这或许就是高龄胚胎发育潜能降低的原因之一。此次研究进一步确认了自噬活性降低会导致胚胎发育水平下降，所以在高龄胚胎中激活自噬或许可以改善高龄胚胎的发育潜能，研究为此提供了一定的论据支持。此研究虽然发现了自噬和H3K4me3的调控关系，但有待进一步揭示自噬造成H3K4me3修饰水平改变的原因，以及自噬造成H3K4me3修饰改变以后，下游信号通路以及关键基因的异常变化。自噬是一种降解蛋白的方式，所以作者猜测抑制胚胎自噬后，H3K4me3甲基化酶的降解可能受阻，造成甲基化酶的高表达，从而造成H3K4me3的修饰增加。除此之外，泛素蛋白酶体降解途径是细胞中另一蛋白降解方式，某些蛋白可以同时被自噬和泛素蛋白酶体途径降解，当自噬被抑制后，泛素蛋白酶体途径的降解可能发生了代偿性升高，导致H3K4me3去甲基化酶的降解增加，由此可能会造成H3K4me3的去甲基化酶含量减少，进而造成胚胎的H3K4me3擦除减少。这些猜想还需要在后续的研究中进一步验证。总之，研究发现自噬在胚胎发育中起重要的作用，可能通过影响基因的H3K4me3修饰进而影响胚胎发育相关基因的表达，从而影响胚胎发育。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

自噬影响组蛋白修饰标记H3K4me3调控小鼠早期胚胎发育

Autophagy regulates early embryonic development in mice via affecting H3K4me3 modification

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