1.1 设计 细胞实验+动物实验。
1.2 时间及地点 实验于2025年4-8月在苏州大学骨科研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 6-8周龄C57BL/6雌性小鼠24只，SPF级，体质量18-22 g，购自杭州子源实验动物科技有限公司，许可证号：SCXK(浙)2019-0004。18月龄C57BL/6雌性小鼠6只，SPF级，体质量25-30 g，购自杭州子源实验动物科技有限公司，许可证号：SCXK(浙)2019-0004。实验已通过苏州大学动物实验伦理委员会审批(SUDA20250527A06)，相关实验操作遵循实验动物管理规定。
1.3.2 实验试剂 α-MEM培养基(Hyclone公司)；胎牛血清(东岭生物公司)；PBS(赛国生物公司)；小鼠髓源性抑制细胞分选试剂盒(Stemcell公司)；cDNA合成试剂(Abm公司)；抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒(Sigma公司)；CD11b-BV510抗小鼠流式抗体、Gr1-PE/cy7抗小鼠流式抗体(BioLegend公司)；小鼠白细胞介素6 ELISA 试剂盒、小鼠肿瘤坏死因子α ELISA试剂盒(伊莱瑞特生物公司)；小鼠巨噬细胞集落刺激因子(近岸蛋白公司)；小鼠核因子κB受体活化因子配体(R&D Systems公司)。
1.3.3 实验仪器 流式细胞仪(Thermo公司)；荧光定量PCR仪(BIO-RAD公司)；Micro-CT(SkyScan公司)；光学显微镜(Leica，德国)。
1.4 实验方法
1.4.1 实验分组
实验1：取6-8周龄雌性C57BL/6小鼠6只，其中3只用于分离提取髓源性抑制细胞，另3只用于分离提取骨髓源性巨噬细胞。将髓源性抑制细胞、骨髓源性巨噬细胞进行破骨诱导分化，破骨诱导5 d后，抗酒石酸酸性磷酸酶染色检测破骨细胞形成；破骨诱导3 d后，qRT-PCR检测活化T细胞核因子1、破骨细胞相关免疫球蛋白样受体基因的mRNA表达。
实验2：取6-8周龄雌性C57BL/6小鼠(年轻组，n=6)与18月龄雌性C57BL/6小鼠(自然衰老组，n=6)，通过Micro-CT分析股骨远端骨微结构；收集两组小鼠的骨髓细胞，流式细胞术检测髓源性抑制细胞比例；分离提取两组小鼠的髓源性抑制细胞，进行破骨诱导分化，破骨诱导5 d后，抗酒石酸酸性磷酸酶染色检测破骨细胞形成；破骨诱导3 d后，qRT-PCR检测活化T细胞核因子1、破骨细胞相关免疫球蛋白样受体基因的mRNA表达。
实验3：将12只6-8周龄雌性C57BL/6小鼠随机分为假手术组(n=6)、卵巢摘除组(n=6)。腹腔注射2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉小鼠后固定于鼠板上，无菌条件下开展手术操作，假手术组腹腔切开后查找卵巢后将其复位，缝合腹腔；卵巢摘除组腹腔切开后查找双侧卵巢，实施结扎及卵巢切除术后缝合腹腔。术后连续3 d腹腔注射青霉素钠100 U/g，预防感染。卵巢摘除8周后，通过Micro-CT分析股骨密度降低说明造模成功。验证造模成功后，腹腔注射2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉后处死小鼠，眼眶取血1 mL，分离血清，ELISA法检测血清中肿瘤坏死因子α与白细胞介素6水平；通过Micro-CT分析右侧股骨远端骨微结构；收集两组小鼠左侧股骨骨髓细胞，流式细胞术检测髓源性抑制细胞比例，分离提取髓源性抑制细胞进行破骨诱导分化，破骨诱导5 d后，抗酒石酸酸性磷酸酶染色检测破骨细胞形成；破骨诱导3 d后，qRT-PCR检测活化T细胞核因子1、破骨细胞相关免疫球蛋白样受体基因的mRNA表达。
1.4.2 髓源性抑制细胞的提取与分选 腹腔注射2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉后处死小鼠，浸泡于体积分数75%乙醇中消毒10 min，随后转移至超净工作台；使用已灭菌的手术器械取出小鼠后肢，置于体积分数75%乙醇中浸泡1 min以进一步消
毒；剥离后肢肌肉，使胫骨与股骨充分暴露，放入PBS中浸泡2 min；用无菌镊子剪开胫骨和股骨的两端，以无菌注射器吸取含有1%双抗和体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞；300×g离心6 min后弃上清，将细胞重悬于含体积分数2%胎牛血清的PBS中。
将细胞转移至5 mL聚苯乙烯圆底管中，加入40 μL FcR阻断剂和50 μL细胞分离混合液，混匀后室温孵育10 min；将快速磁珠涡旋30 s后取75 μL加入细胞中，室温孵育5 min；用含体积分数2%胎牛血清的PBS将细胞体积加满至2 mL，混匀；将试管放入磁柱中并室温孵育3min；拿起磁铁，将分选下来的细胞倒入新试管中，用于后续实验。
1.4.3 骨髓源性巨噬细胞的提取 按照1.4.2中的方法获取骨髓细胞，收集细胞悬液，加入红细胞裂解液裂解红细胞；300×g离心6 min后弃上清，重悬细胞并接种于培养皿中，置于37 ℃、体积分数5% CO2 培养箱中静止培养16 h；吸取上清，300×g离心6 min后弃上清，更换含30 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子的培养基[20]，置于37 ℃、体积分数5% CO2 培养箱中静止培养3 d，进行后续实验。
1.4.4 流式细胞仪检测小鼠骨髓中髓源性抑制细胞比例 按照1.4.2中的方法获取骨髓细胞，300×g 离心6 min后弃上清，将细胞重悬于含体积分数2%胎牛血清的PBS中，取5×10⁵个细胞转移至1.5 mL EP管中；配制流式抗体工作液，在EP管中加入0.3 μL Gr1-PE-Cy7和0.3 μL CD11b-FITC，混匀后于室温避光孵育30 min；加入400 μL含体积分数2%胎牛血清的PBS清洗细胞，300×g离心6 min后去除上清；用400 μL 含体积分数2%胎牛血清的PBS重悬细胞，上机进行流式细胞术检测，使用FlowJo V10软件进行数据分析。
1.4.5 细胞的破骨活化诱导 计数髓源性抑制细胞(或骨髓源性巨噬细胞)，以1×105/孔的密度接种于48孔板中，加入含30 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子的培养基；待细胞贴壁后，实验组更换为含50 ng/mL核因子κB受体活化因子配体+30 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子的破骨细胞诱导分化培养基[21]，对照组更换为新的含30 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子的培养基，置于37 ℃、体积分数5% CO2 培养箱中培养，每3 d换液1次；诱导3 d后提取细胞总RNA进行qRT-PCR检测，诱导5 d后进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色。
1.4.6 细胞抗酒石酸酸性磷酸酶染色 诱导5 d后弃培养基，用PBS清洗细胞2次，每次5 min；40 g/L多聚甲醛固定细胞15 min；将固红GBC盐溶液与亚硝酸钠溶液加入预热至37 ℃的双蒸水中，混匀后室温静置2 min，按照抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒说明书配置染色工作液；将配制好的抗酒石酸酸性磷酸酶染色液滴加至孔板内，置于37 ℃避光孵育30 min；通过光学显微镜观察染色结果并拍照记录，结合Image J软件分析破骨细胞阳性面积。
1.4.7 qRT-PCR检测破骨细胞活化相关基因表达 破骨诱导培养的第3天，弃培养基，用PBS清洗细胞1次；加入1 mL Trizol裂解细胞，使细胞充分裂解；添加200 μL氯仿，轻柔颠倒混匀30 s，置于4 ℃静置10 min；13 000 r/min离心10 min，取上层透明液约400 μL，加入等体积(400 μL)异丙醇，混匀30 s后置于4 ℃孵育10 min；13 000 r/min离心10 min后弃上清，用体积分数75%乙醇洗涤RNA沉淀，13 000 r/min离心10 min后弃上清，此过程重复2次；轻轻晾干RNA沉淀，加入10-20 μL DEPC水，在58 ℃金属浴条件下充分溶解8 min；采用RNA浓度检测仪测量RNA浓度，根据说明书将RNA反转录成cDNA，通过qRT-PCR法检测活化T细胞核因子1、破骨细胞相关免疫球蛋白样受体基因的mRNA表达。基因引物序列见表1。
1.4.8 Micro-CT操作及数据分析 使用SkyScan 1176 微计算机断层扫描仪，启动软件并预热仪器。将股骨样品放置于样品托盘指定位置，关闭扫描舱门，设置扫描参数：X射线电压50 kV，电流200 μA，铝滤片 0.5 mm，扫描分辨率4 000，扫描厚度9 μm，旋转角度70°。进行初步位置校准扫描，确保股骨干骺端位于扫描范围内。重命名样本文件并选择保存路径，启动扫描，完成后取出标本；使用 NRecon软件载入扫描文件，定位预览并选择重建区域。设置数据保存路径并添加至等待队列，点击“Start”启动重建；使用 Dataview 软件打开重建文件，调整视图并保存为数据库格式。通过CTAn软件加载处理后的文件，选择生长板上150层作为分析固定层数，圈定感兴趣区域，设定阈值范围，进行骨密度分析，保存数据并生成Slt 文件格式的三维原始数据。使用Mimics软件加载三维图像，保存固定角度图像，进一步分析骨体积分数、骨小梁数量与骨小梁分离度。
1.4.9 ELISA 法检测小鼠血清中相关炎症因子水平 采集的血样于4 ℃静置12 h后，1 500×g离心20 min，取200 μL血清；将血清加入预包被抗体的96孔板中，加入生物素标记检测抗体、孵育、洗板，加入 Avidin-HRP、显色底物、终止液，检测450 nm
波长处吸光度值，根据标准曲线计算炎性因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素6水平。
1.5 主要观察指标 髓源性抑制细胞与骨髓源性巨噬细胞的破骨细胞分化能力，年轻组与自然衰老组小鼠的股骨远端骨微结构、骨髓细胞中髓源性抑制细胞比例、髓源性抑制细胞的破骨细胞分化能力，假手术组与卵巢摘除组小鼠的股骨远端骨微结构、骨髓细胞中髓源性抑制细胞比例、血清中炎症因子水平以及髓源性抑制细胞的破骨细胞分化能力。
1.6 统计学分析 所有数据均以x±s表示，统计学分析采用GraphPad Prism 9.0.0软件进行。两组间比较采用非配对t检验，超过两组数据的比较则采用单因素方差分析(ANOVA)。统计学显著性水平设定为P < 0.05。文章统计学方法已经通过苏州大学生物统计学专家审核。
