增强自噬的可注射水凝胶微球改善软骨微环境抗软骨细胞衰老

doi:10.12307/2025.439

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (22): 4710-4719.doi: 10.12307/2025.439

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增强自噬的可注射水凝胶微球改善软骨微环境抗软骨细胞衰老

李文铭，李永航，严才平，王星宽，向超，张袁，蒋科，陈路

川北医学院附属医院，四川省南充市 637000

收稿日期:2024-03-04 接受日期:2024-05-11 出版日期:2025-08-08 发布日期:2024-12-06
通讯作者: 陈路，硕士生导师，主任医师，川北医学院附属医院，四川省南充市 637000 蒋科，博士，副主任医师，硕士生导师，川北医学院附属医院，四川省南充市 637000
作者简介:李文铭，男，1997年生，四川省南充市人，汉族，在读硕士，主要从事软骨修复及细胞衰老相关研究。李永航，男，1997年生，江苏省宿迁市人，汉族，在读硕士，主要从事骨再生研究。
基金资助:
南充市2023年市级科技计划专项资金项目(23JCYJPT0036)，项目负责人：王星宽；川北医学院2023年校级科研计划项目(CBY23-QNA01)，项目负责人：王星宽

Injectable hydrogel microspheres that enhance autophagy can improve cartilage microenvironment and resist chondrocyte senescence

Li Wenming, Li Yonghang, Yan Caiping, Wang Xingkuan, Xiang Chao, Zhang Yuan, Jiang Ke, Chen Lu

Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China

Received:2024-03-04 Accepted:2024-05-11 Online:2025-08-08 Published:2024-12-06
Contact: Chen Lu, Master’s supervisor, Chief physician, Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China Jiang Ke, PhD, Associate chief physician, Master’s supervisor, Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China
About author:Li Wenming, Master candidate, Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China Li Yonghang, Master candidate, Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China
Supported by:
Nanchong City 2023 Municipal Science and Technology Plan Special Fund Project, No. 23JCYJPT0036 (to WXK); 2023 University-Level Scientific Research Project of North Sichuan Medical College, No. CBY23-QNA01 (to WXK)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

衰老相关分泌表型：衰老细胞分泌的一组促炎、促血管生成和生长刺激因子(包括基质金属蛋白酶、白细胞介素6、白细胞介素8和许多其他炎症细胞因子)，可对细胞微环境和周围细胞产生影响。
自噬：是细胞内的一种“自食”现象，细胞通过自噬实现自身的代谢需求和某些细胞器的更新，能降解受损的蛋白质、衰老或损伤的细胞器等细胞结构，从而维持机体细胞的正常功能。

背景：细胞衰老是骨关节炎的重大危险因素之一，目前尚无广泛认可的针对衰老细胞的抗骨关节炎治疗策略。

目的：制定可行的针对骨关节炎中衰老细胞的治疗策略。
方法：采用薄膜分散法制备包封雷帕霉素的阳离子脂质体RAPA@Lipo，合成甲基丙烯酰化透明质酸水凝胶，将RAPA@Lipo加入甲基丙烯酰化透明质酸水凝胶水相液中，利用微流控设备制成水凝胶微球，再于紫光光照下交联成固体水凝胶微球(RAPA@Lipo@MS)。将人原代软骨细胞分别与RAPA@Lipo、 RAPA@Lipo@MS共培养，采用CCK-8法、活/死染色评价材料的生物相容性。将大鼠原代软骨细胞分4组培养：正常对照组常规培养48 h，造模组加入H2O2刺激24 h建立衰老细胞模型，RAPA@Lipo组、RAPA@Lipo@MS组建立衰老细胞模型后分别加入RAPA@Lipo、RAPA@Lipo@MS培养24 h，培养结束后，采用免疫荧光观察p62及Ⅱ型胶原蛋白的表达，RT-PCR检测白细胞介素6、基质金属蛋白酶13、Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖及ADAMTS-5的mRNA表达。

结果与结论：①CCK-8检测、活/死染色结果显示，RAPA@Lipo与RAPA@Lipo@MS均具有良好的生物相容性；②与正常对照组相比，造模组细胞p62蛋白表达升高(P < 0.05)，Ⅱ型胶原蛋白表达降低(P < 0.05)，白细胞介素6、基质金属蛋白酶13及ADAMTS-5的mRNA表达升高(P < 0.05)，Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖mRNA表达降低(P < 0.05)；与造模组比较，RAPA@Lipo@MS组p62蛋白表达降低(P < 0.05)，Ⅱ型胶原蛋白表达升高(P < 0.05)，白细胞介素6、基质金属蛋白酶13及ADAMTS-5的mRNA表达降低(P < 0.05)，Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖mRNA表达升高(P < 0.05)；③结果表明，RAPA@Lipo@MS通过增强自噬控制体内细胞质量、减少体内的衰老细胞，局部清除骨关节炎中的衰老细胞和衰老相关分泌表型因子，以此减缓骨关节炎的进展，创造一个促再生的软骨微环境。

https://orcid.org/0009-0008-1808-9871 (李文铭)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 骨关节炎, 水凝胶微球, 自噬, 衰老细胞, 衰老相关分泌表型, 雷帕霉素

Abstract: BACKGROUND: Cell senescence is one of the major risk factors for osteoarthritis, but there is no widely accepted anti-osteoarthritis therapy targeting senescent cells.
OBJECTIVE: To develop a feasible treatment strategy targeting senescent cells in osteoarthritis.
METHODS: The cationic liposome containing rapamycin, RAPA@Lipo, was prepared by thin film dispersion method. Methylallylated hyaluronic acid hydrogel was synthesized, and RAPA@Lipo was added to the methylallylated hyaluronic acid hydrogel aqueous phase solution. The hydrogel microspheres were prepared by microfluidic equipment. Solid hydrogel microspheres (RAPA@Lipo@MS) were crosslinked under violet light. Primary human chondrocytes were co-cultured with RAPA@Lipo and RAPA@Lipo@MS, respectively. The biocompatibility of the materials was evaluated by CCK-8 assay and live/dead staining. Primary rat chondrocytes were cultured in four groups. Normal control group was cultured for 48 hours. The model group was stimulated with H2O2 for 24 hours to establish senescent cell model. RAPA@Lipo group and RAPA@Lipo@MS group were cultured for 24 hours after establishing senescent cell model with RAPA@Lipo and RAPA@Lipo@MS, respectively. After culture, immunofluorescence was used to observe the expression of p62 and type II collagen. RT-PCR was used to detect the mRNA expression of interleukin 6, matrix metalloproteinase 13, type II collagen, aggrecan, and ADAMTS-5.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The results of CCK-8 assay and live/dead staining showed that RAPA@Lipo and RAPA@Lipo@MS had good biocompatibility. (2) Compared with the normal control group, the protein expression of p62 was increased (P < 0.05); the expression of type II collagen was decreased (P < 0.05), and the mRNA expression levels of interleukin 6, matrix metalloproteinase 13, and ADAMTS-5 were increased (P < 0.05); mRNA expression levels of type II collagen and aggrecan were decreased (P < 0.05) in the model group. Compared with the model group, the expression of p62 protein was decreased (P < 0.05); the expression of type II collagen was increased (P < 0.05), and the mRNA expression levels of interleukin 6, matrix metalloproteinase 13, and ADAMTS-5 were decreased (P < 0.05); mRNA expression of type II collagen and aggrecan increased (P < 0.05) in the RAPA@Lipo@MS group. (3) These findings indicate that RAPA@Lipo@MS can control the quality of cells in vivo by enhancing autophagy, reduce senescent cells in vivo, and locally eliminate senescent cells and senescence-associated secretory phenotype factors in osteoarthritis, thereby slowing the progression of osteoarthritis and creating a cartilage microenvironment that promotes regeneration.

Key words: osteoarthritis, hydrogel microsphere, autophagy, senescent cell, senescence-associated secretory phenotype, rapamycin

中图分类号:

李文铭, 李永航, 严才平, 王星宽, 向超, 张袁, 蒋科, 陈路. 增强自噬的可注射水凝胶微球改善软骨微环境抗软骨细胞衰老[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(22): 4710-4719.

Li Wenming, Li Yonghang, Yan Caiping, Wang Xingkuan, Xiang Chao, Zhang Yuan, Jiang Ke, Chen Lu. Injectable hydrogel microspheres that enhance autophagy can improve cartilage microenvironment and resist chondrocyte senescence[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(22): 4710-4719.

图/表（结果） 5

2.1 复合水凝胶微球的制备及其物化特性表征采用基于pdms芯片的微流控装置制备水凝胶微球[16]，水相为甲基丙烯酰化透明质酸单体，油相为95%石蜡油+ 5%Span80混合物，油相对水相施加剪切力，导致混合物分裂形成乳状液滴，在紫外光照射下液滴聚合成水凝胶微球(图1A)，使用时将其放入去离子水中可见快速吸水膨胀为均匀球形[17](图1B)。通过调节水相与油相的比值(Qd∶Qc=1/9)可得到平均直径为310 μm的水凝胶微球[18](图1C)。采用旋转蒸发法制备阳离子脂质体(图1D)，使用马尔文纳米粒度及Zeta电位分析仪测得其平均粒径约为120 nm(图1E)，因(2，3-二油酰基-丙基)-三甲基铵-氯盐为阳离子磷脂，故测得脂质体Zeta电位为+49.5 mV，包封雷帕霉素后正电位略有减少，约+44 mV(图1F)。水凝胶为多孔网状内部结构，可保留大部分水分，冻干后低温放置可保存较长时间，扫描电镜下观察为疏松多孔状球体(图1G)。甲基丙烯酰化透明质酸微凝胶网络内可形成氢键，进一步锚定微凝胶中的脂质体[19]，为证明脂质体在甲基丙烯酰化透明质酸微凝胶中的成功固定化，Dil标记脂质体，置于共聚焦激光显微镜下观察，可见Dil标记的脂质体被成功包封于水凝胶微球中(图1H)。

2.2 水凝胶微球降解与药物的包封与释放为了模拟体内的逐渐降解过程，将甲基丙烯酰化透明质酸水凝胶微球在含有1 000 U/mL透明质酸酶的PBS中，在37 ℃下孵育5周[20]。浸泡第7天，微球的形态几乎没有变化；浸泡第14天，虽然形貌大致完整，但在微球边缘观察到小部分降解缺损；浸泡第21天，微球形态开始变形，难以维持饱满形态，开始塌陷，出现裂缝；浸泡第35天，微球胶大部分消失(图2A)。同时，水凝胶微的残余质量随着时间的推移而减小，这与形貌变化一致(图2B)。
RAPA@Lipo与RAPA@Lipo@MS中雷帕霉素的包封效率分别为(82.85±3.74)%，(60.21±4.54)%(图2C)。在药物释放实验中，RAPA@Lipo与RAPA@Lipo@MS中雷帕霉素的累计释放谱呈双相，初始为快速释放期(约为5 d)，随后为缓释期，并且RAPA@Lipo@MS中雷帕霉素的持续释放时间> 3周(图2D)。

2.3 RAPA@Lipo与RAPA@Lipo@MS的生物相容性活/死染色结果显示3组均未见明显的死细胞，3组间活细胞数量比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图3A，B。CCK-8检测结果显示，相同时间下，3组间细胞增殖吸光度值比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图3C。

2.4 RAPA@Lipo@MS对衰老软骨细胞的影响
2.4.1 软骨细胞自噬与衰老的相关表征细胞衰老的表征通过β-半乳糖苷酶检测[21]。如图4A所示，与正常对照组相比，造模组软骨细胞β-半乳糖苷酶染色强度增强。通过免疫荧光观察p62蛋白的表达，造模组、Lipo@MS组p62蛋白表达高于正常对照组(P < 0.05)，RAPA@Lipo@MS组p62蛋白表达低于造模组、Lipo@MS组(P < 0.05)，造模组与Lipo@MS组p62蛋白表达比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4B，C。同时通过免疫荧光观察p53蛋白的表达，RAPA@Lipo@MS组p53蛋白表达低于造模组(P < 0.05)，见图4D，E。
RT-PCR检测结果显示，与正常对照组比较，造模组细胞内白细胞介素6、基质金属蛋白酶13 mRNA表达升高(P < 0.05)；与造模组、Lipo@MS组比较，RAPA@Lipo@MS组细胞内白细胞介素6、基质金属蛋白酶13 mRNA表达降低(P < 0.05)；造模组与Lipo@MS组细胞内白细胞介素6、基质金属蛋白酶13 mRNA表达比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4F，G。

2.4.2 成软骨相关表征免疫荧光染色结果显示，造模组细胞内Ⅱ型胶原蛋白表达低于正常对照组(P < 0.05)，RAPA@Lipo@MS组细胞内Ⅱ型胶原蛋白表达高于造模组、Lipo@MS组(P < 0.05)，造模组与Lipo@MS组细胞内Ⅱ型胶原蛋白表达比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5A，B。
RT-PCR检测结果显示，与正常对照组比较，造模组细胞内Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖mRNA表达降低(P < 0.05)，ADAMTS-5 mRNA表达升高(P < 0.05)；与造模组、Lipo@MS组比较，RAPA@Lipo@MS组细胞内Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖mRNA表达升高(P < 0.05)，ADAMTS-5 mRNA表达降低(P < 0.05)；造模组与Lipo@MS组细胞内Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖、ADAMTS-5 mRNA表达比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，见图5C-E[22]。

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引言

骨关节炎是一种常见的年龄相关性疾病，是导致疼痛和身体残疾的主要原因之一，并且晚期骨关节炎患者几乎均须接受手术干预以缓解疼痛和肢体功能障碍[1]。因此，终末期骨关节炎已经成为个人和社会医疗保健的严重负担，若能在骨关节炎发展的早中期加以干预来阻止病程进展，可以降低晚期骨关节炎的发病率[2]。细胞衰老是骨关节炎的重大危险因素之一。骨关节炎作为衰老疾病伴随着自身细胞衰老状态的发生，当衰老状态发生后细胞表型便转变为衰老细胞，并且有研究从接受关节置换手术的骨关节炎患者软骨组织中发现了衰老软骨细胞，证实衰老软骨细胞在骨关节炎中的存在[3]。
衰老细胞具有几个关键特征，即永久性细胞周期阻滞、对细胞死亡信号的抵抗、生物活性分泌组的产生，该分泌组又称衰老相关分泌表型[4]。衰老相关分泌表型中含有基质金属蛋白酶、白细胞介素6和许多其他炎症细胞因子，这些炎症细胞因子的存在持续地对周围细胞微环境造成影响。因此，清除衰老细胞和衰老相关分泌表型因子是延缓骨关节炎发生发展的一个可行策略[5]。目前市面上有许多抗衰老药物，但大多数药物因较严重的不良反应而无法广泛使用，因此需要探索新的抗衰老策略[6]。
自噬与衰老之间存在着密切的关系。自噬是细胞内的一种“自食”现象，细胞通过自噬实现自身的代谢需求和某些细胞器的更新，能降解受损的蛋白质、衰老或损伤的细胞器等细胞结构，从而维持机体细胞的正常功能[7]。衰老后出现的细胞修复机制障碍导致损伤的分子、细胞等大量堆积，并伴随功能障碍的一系列特征，这些正是自噬所能纠正的，因此，通过增强自噬以抗衰老是衰老相关改变重要的调节机制[8]。
雷帕霉素是一种可以抑制哺乳动物雷帕霉素受体的药物，而哺乳动物雷帕霉素受体是自噬的负调控因子，因此雷帕霉素可以促进自噬的发生[9]。雷帕霉素的水溶性较差，关节内递送效率较低，给药后游离于关节腔内，导致利用率低[10]。阳离子脂质体因良好的软骨靶向性和生物相容性被广泛用于药物的包封，其表面的正电荷通过与关节软骨的负电荷吸附作用相互吸引实现软骨靶向，从而实现关节内药物的精准递送[11]。阳离子脂质体较高的稳定性可以保护药物免受外界环境的影响，延长药物的存储寿命[12]，但是单纯应用脂质体包封并不能实现药物的缓释。
甲基丙烯酰化透明质酸水凝胶具有光敏性，配合光引发剂使用时能在蓝光或紫外光下迅速交联固化，具有优异的生物相容性、可降解性[13]。因此，此次实验使用阳离子脂质体包封雷帕霉素后装载于甲基丙烯酰化透明质酸水凝胶微球上来进行药物缓释，通过增强自噬控制体内细胞质量、减少体内的衰老细胞，局部清除骨关节炎中的衰老细胞和衰老相关分泌表型因子，以此减缓骨关节炎的进展，创造一个促再生的软骨微环境。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验，两组间统计学差异采用独立样本t检验，多组间采用单因素方差分析(ANOVA)。
1.2 时间及地点实验于2022年8月至2023年11月在川北医学院科创中心完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞人原代软骨细胞永生化细胞(C28/I2)、大鼠原代软骨细胞(上海瑾原生物科技有限公司，中国)。
1.3.2 主要试剂 Calcein AM/PI工作液、CCK-8试剂、Dil 染色试剂盒(Beyotime，中国)；DMEN/F12完全培养基(GIBCO，美国)；细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(碧云天生物科技有限公司，中国)；RevertAid首链互补DNA合成试剂盒(Thermo Fisher Scientific，美国)；免疫荧光Ⅰ抗、鬼笔环肽、DAPI染液(Servicebio，中国)；荧光Ⅱ抗(博士德，中国)；(2，3-二油酰基-丙基)-三甲基铵-氯盐、1，2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺、胆固醇(上海芃硕生物科技有限公司，中国)；雷帕霉素(MedChemExpress，美国)；透明质酸、甲基丙烯酸酐(麦克林生物科技有限公司，中国)；苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰基亚膦酸锂盐(苏州永沁泉智能设备有限公司，中国)。
1.3.3 主要仪器冻干机(Christ，德国)；马尔文纳米粒度及Zeta电位分析仪(英国)；透射电镜(JEM-1400plus，日本)；FlexStaston3酶标仪(Molecular Devices，日本)；激光扫描共聚焦显微镜(奥林巴斯，日本)；紫外分光光度计(Eppendorf，德国)；透析袋(诺博莱德，中国)；-80 ℃冰箱(海尔，中国)；细胞培养板(康宁公司，美国)；ABI 7300实时PCR系统(ABI，美国)；微量注射泵(苏州永沁泉智能设备有限公司，中国)。
1.4 方法
1.4.1 负载脂质体的制备采用薄膜分散法制备阳离子脂质体。将7 mg (2，3-二油酰基-丙基)-三甲基铵-氯盐、3.5 mg 1，2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺、3 mg胆固醇与2 mg雷帕霉素均溶解在5 mL三氯甲烷中。然后将该混合物在40 ℃水浴下通过旋转蒸发器蒸发成脂质膜，加入3.5 mL 40 ℃预热去离子水水合1 h，超声处理10 min，依次通过0.45，0.22 μm微孔膜过滤得到阳离子脂质体溶液(记为RAPA@Lipo)，置于4 ℃下储存。
1.4.2 甲基丙烯酰化透明质酸水凝胶的合成称取5 g透明质酸溶解于250 mL去离子水溶液中，机械搅拌至溶液澄清透明；向溶液中滴加10 mL甲基丙烯酸酐并搅拌均匀；采用微量注射泵向体系中滴加5 mol/L的NaOH 20 mL，20-30 min滴加完毕，以上整个过程均在冰水浴的条件下完成。体系反应过夜后，4 200 r/min离心30 min，保留上清液并转移至截留分子质量为8 000 Da的透析袋中，室温下透析3 d(平均每天换液3次)。透析完毕后转移至50 mL离心管中，-80 ℃下冷冻过夜，置于冻干机中-40 ℃冷冻干燥72 h，置于-80 ℃密封保存。
1.4.3 甲基丙烯酰化透明质酸水凝胶微球的制备以40 g/L甲基丙烯酰化透明质酸溶液和5 g/L光引发剂苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰基亚膦酸锂盐为水相，95%石蜡油和5%SPAN80为油相，制备水凝胶微球。油相和水相通过微流控泵分别以140 μL/min和10 μL/min的流速注入到装置中，由于两种液相的剪切应力，甲基丙烯酰化透明质酸溶液形成微滴，微滴流入紫外光(40 mW/cm2)照射下的通道，通过光交联形成固体水凝胶微球。使用有机溶剂洗涤微球后置于-80 ℃下过夜，置于-40 ℃下冷冻干燥3 d，获得多孔微球。
1.4.4 负载脂质体水凝胶微球的制备将RAPA@Lipo混入甲基丙烯酰化透明质酸水凝胶水相液中，二者的体积比为1∶3，通过微流控设备制成水凝胶微球，再于紫光光照下交联成固体水凝胶微球(记为RAPA@Lipo@MS)。同理制备不含雷帕霉素的单纯负载阳离子脂质体的甲基丙烯酰化透明质酸水凝胶微球(记为Lipo@MS)。
1.4.5 材料表征
水凝胶微球的粒径分析：将甲基丙烯酰化透明质酸水凝胶微球置于6 cm培养皿中，使用光学显微镜观察并拍摄分布均匀的水凝胶微球照片，使用Image J软件分析微球粒径大小。
水凝胶微球降解测试：取30 mg甲基丙烯酰化透明质酸水凝胶微球悬浮在1 mL透明质酸酶溶液(1 000 U/mL，pH=7.4)中，置于摇晃培养箱(80 r/min，37 ℃)中。每隔2 d用新鲜透明质酸酶溶液替换上清液。在指定的时间点测量水凝胶微球的残余质量，并与初始质量进行比较。在称质量前，用滤纸吸去多余的水，重复整个过程，直到得到一个恒定的质量。
水凝胶微球微观形貌观察：将甲基丙烯酰化透明质酸水凝胶微球置于-80 ℃冰箱中冷冻过夜，置于冷冻干燥机中冷冻干燥48 h，使用扫描电镜观察冻干后的水凝胶微球形态。
脂质体的相关表征：①使用马尔文纳米粒度及Zeta电位分析仪(英国)测量脂质体的粒径和Zeta电位；②使用透射电镜观察脂质体的形态；③用10 μmol/L Dil染色脂质体并将其装在甲基丙烯酰化透明质酸水凝胶微球中，使用激光共聚焦显微镜观察脂质体是否成功装载于甲基丙烯酰化透明质酸水凝胶微球中；④采用紫外分光光度计检测雷帕霉素的包封率和释放率：通过紫外分光光度计测得RAPA@Lipo或RAPA@Lipo@MS的吸光度值，采用雷帕霉素标准曲线计算包封效率；⑤将RAPA@Lipo或RAPA@Lipo@MS包装在截留分子质量为3 500 Da的透析袋中，在37 ℃下浸泡在5 mL PBS(pH=7.4)中，以80 r/min的速率搅拌，直到药物释放完成。在特定时间点收集1 mL释放介质检测吸光度值，计算药物释放率，并用等体积的PBS代替被收集的液体。
1.4.6 RAPA@Lipo与RAPA@Lipo@MS的生物相容性
活/死染色：将C28/I2细胞接种于6孔板内，每孔加入1 mL DMEM/F12完全培养基，细胞浓度为1×107 L-1，分3组培养：对照组不加入任何材料，其余2组分别加入0.5 mL的RAPA@Lipo、RAPA@Lipo@MS(2.5 mg/mL)。培养2，3 d后，用PBS清洗3次，加入1 mL Calcein AM/PI工作液孵育30 min，置于荧光显微镜下观察并拍照。使用Image J软件分析活细胞数量。
CCK-8检测：将C28/I2细胞接种于96孔板内，每孔加入100 μL DMEM/F12完全培养基，细胞浓度为1×107 L-1，分3组培养：对照组不加入任何材料，其余2组分别加入100 μL的RAPA@Lipo、RAPA@Lipo@MS(2.5 mg/mL)。培养1，3，5 d后，每孔加入10 µL CCK-8溶液37 ℃孵育1 h，使用FlexStaston3酶标仪在450 nm处测定吸光度值。
1.4.7 衰老细胞模型的建立将大鼠原代软骨细胞接种于6孔板内，每孔加入1 mL DMEM/F12完全培养基，细胞浓度为1×107 L-1，分2组培养：正常对照组不加入任何试剂，造模组加入200 μmol/L的H2O2[14]，摇晃混匀后置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中恒温培养8 h，用PBS清洗3次，更换新鲜对应干预的DMEM/F12完全培养基，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中恒温培养24 h，以此建立衰老细胞模型。
培养结束后，使用PBS清洗3次，每孔中加入1 mL β-半乳糖苷酶染色室温固定15 min[15]，吸出固定液后用PBS清洗3次，每孔加入1 mL工作液(β-半乳糖苷酶染色液A 10 μL、β-半乳糖苷酶染色液B 10 μL、β-半乳糖苷酶染色液C 930 μL、X-Gal溶液50 μL)37 ℃孵育过夜，置于光学显微镜下观察并拍照，验证成功建立模型。
1.4.8 RAPA@Lipo@MS对衰老软骨细胞的影响
实验分组：将大鼠原代软骨细胞接种于6孔板内，每孔加入1 mL DMEM/F12完全培养基，细胞浓度为1×107 L-1，分4组培养：正常对照组不加入任何药物，常规培养48 h；造模组加入200 μmol/L H2O2培养24 h后加入0.5 mL PBS继续培养24 h；Lipo@MS组加入200 μmol/L H2O2培养24 h后加入0.5 mL Lipo@MS继续培养24 h；RAPA@Lipo@MS组加入200 μmol/L H2O2培养24 h后加入0.5 mL RAPA@Lipo@MS(2.5 mg/mL)继续培养24 h。

RT-PCR检测：培养结束后，分离提取4组细胞总RNA，使用RevertAid首链互补DNA合成试剂盒进行反转录。随后，使用ABI 7300实时PCR系统进行RT-PCR反应。采用比较周期阈值(2-ΔΔCT法)计算Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖、血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5(recombinant A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin 5，ADAMTS-5)、白细胞介素6、基质金属蛋白酶13 mRNA的相对表达量。所有实验均重复3次。相关引物见表1。

免疫荧光染色：培养结束后，分析正常对照组、造模组、Lipo@MS组、RAPA@Lipo@MS组的p62、Ⅱ型胶原蛋白表达，造模组与RAPA@Lipo@MS组的p53蛋白表达。用PBS洗涤2次，40 g/L多聚甲醛固定10 min。加入0.1%TritonX-100处理15 min，分别加入兔抗人Ⅱ型胶原、p62、p53多克隆抗体(稀释比例均为1∶50)4 ℃孵育过夜。第2天，加入cy3标记的山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G二抗室温下1 h。细胞骨架和细胞核分别用FITC标记的鬼笔环肽和Dapi染色。置于激光共聚焦显微镜获得荧光图像，使用Image J软件分析荧光强度。
1.5 主要观察指标 RAPA@Lipo与RAPA@Lipo@MS的生物相容性，以及对衰老软骨细胞的影响。
1.6 统计学分析采用SPSS 23.0(IBM Corp.，Armonk，NY，USA)和Graphpad Prism 9(Graphpad Software，USA)软件进行统计分析。两组间统计学差异采用独立样本t检验，多组间采用单因素方差分析(ANOVA)。数据以x±s表示。P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经川北医学院生物统计学专家审核。

讨论

在迄今为止的研究中衰老一直被认为是骨关节炎的重要病因，骨关节炎的特征是细胞衰老，组织和器官功能随着时间的推移逐渐丧失[23]。而针对衰老的药物研究亦是层出不穷，到目前为止也没有一种公认的安全无害的抗衰老药物[24]。自噬是介导溶酶体中蛋白质和细胞器降解的重要细胞过程，因其作为蛋白稳态网络的一部分而与细胞质量控制密切相关[25]。已有研究表明，增强自噬可控制体内细胞质量，减少体内的衰老细胞[26]。基于此点出发，此次实验通过增强自噬来达到局部清除骨关节炎中衰老细胞的目的，以此减缓骨关节炎的进展，创造一个促再生的软骨微环境。
雷帕霉素是一种广谱抗生素，它被发现可以通过增强细胞自噬来发挥控制细胞质量的作用[27]。雷帕霉素增强自噬的机制主要涉及以下几个方面：①哺乳动物雷帕霉素受体抑制：哺乳动物雷帕霉素受体是一个重要的细胞生长和代谢调控因子，其活性抑制可以促进自噬的发生；②单磷酸腺苷活化蛋白激酶激活：单磷酸腺苷活化蛋白激酶是一个能量传感器，其激活可以促进细胞内ATP水平下降，从而促进自噬的发生；③LC3-Ⅱ的转化：雷帕霉素可以促进LC3-Ⅰ转化为LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ是自噬体膜的组成成分，其增加可以促进自噬体的形成和自噬过程的进行；④溶酶体功能的增强：溶酶体是自噬体降解的终点，其功能的增强可以促进自噬的进行和降解物质的清除[28-29]。
雷帕霉素的生物利用度差、治疗指数窄，单一使用后会迅速从体内清除[30]，脂质体包封可以提高雷帕霉素的水溶性，使得雷帕霉素实现一定的缓释[31]。此次实验通过阳离子脂质体包封雷帕霉素，阳离子脂质体可以通过改变其表面电荷实现药物的靶向输送和软骨穿透[32]。阳离子脂质体表面的正电荷与关节软骨的负电荷通过电荷吸附作用相互吸引实现软骨靶向，完成雷帕霉素的精确递送[33]。阳离子脂质体具有较高的稳定性，可以保护药物免受外界环境的影响，延长药物存储寿命；并且阳离子脂质体由天然或合成的脂质组成，生物体相容性良好，减少了不良反应的风险。此实验发现包封于微球中载药脂质体的包封率有所降低，这种降低可能是在水凝胶微球洗涤去油过程中药物泄漏所致。不过单纯应用脂质体包封并不能实现药物的长时间缓释，于是使用甲基丙烯酰化透明质酸水凝胶微球封装了脂质体，在水凝胶微球中加入脂质体可以进一步增加给药系统的稳定性，有助于局部给药。甲基丙烯酰化透明质酸水凝胶具有光敏性，配合光引发剂使用时能在蓝光或紫外光下迅速交联固化，兼具天然和合成生物材料的特征，具有优异的生物相容性、可降解性[34]。水凝胶微球内具有纳米网状结构，可将纳米颗粒稳定在其内，形成具有扩展功能的新复合材料。此外，甲基丙烯酰化透明质酸微凝胶网络中的氮、氧元素可以与磷脂中的磷、氮、氧相互作用形成氢键，进一步锚定微凝胶中的脂质体，并且微球从表面到内部的降解是一个缓慢过程，有利于药物的长期释放。
材料生物相容性实验结果表明，Lipo@MS具有良好的生物相容性，可作为药物缓释载体应用于生物体内。尽管单独大量使用阳离子脂质体时可能对细胞有轻微伤害[35]，但观察到单独使用脂质体未对细胞造成实质损伤，可能是由于应用脂质体的量并未达到可对细胞造成损害的量，而包封在水凝胶微球中缓释的阳离子脂质体则更大程度地减轻了这一损伤，对细胞几乎无损伤[36]。
细胞衰老的一个主要特征就是溶酶体β-半乳糖苷酶活性的增加，在不同类型衰老细胞中以及在体内外实验中，β-半乳糖苷酶都是识别衰老的标志物。200 μmol/L H2O2处理后的软骨细胞β-半乳糖苷酶染色强度增强，说明了衰老细胞造模成功。
p62蛋白也称为SQSTM1蛋白，是一种与细胞信号转导、氧化应激和自噬有关的泛素结合蛋白[37]。p62与泛素相互作用，为多个信号转导蛋白提供支架，诱导蛋白酶体或溶酶体降解蛋白，其含量与自噬程度呈反比[38]。p53蛋白水平升高是导致细胞衰老和产生各种衰老现象的主要原因之一，此次实验在对衰老细胞进行相同处理下观察了p53蛋白的表达，发现与衰老软骨细胞相比，应用自噬增强剂雷帕霉素后衰老软骨细胞的p62与p53蛋白表达下降，说明雷帕霉素通过增强自噬达到了抗衰老细胞的目的[39]。
衰老细胞拥有特征性的衰老相关分泌表型[40]。衰老细胞的积累和衰老相关分泌表型分泌的增加都会促进衰老相关疾病的发生发展[41]。此次实验通过RT-PCR检测对衰老相关分泌表型因子进行了量化，结果显示：与正常对照组相比，衰老软骨细胞内白细胞介素6、基质金属蛋白酶13等衰老相关分泌表型因子表达量显著上调，使用RAPA@Lipo@MS后明显抑制了衰老软骨细胞内衰老相关分泌表型因子的表达，说明通过增强自噬后清除了体内的衰老细胞，降低了衰老相关分泌表型因子的表达。
在明确了RAPA@Lipo@MS可以通过增强自噬来清除体内衰老软骨细胞后，进一步证实RAPA@Lipo@MS对骨关节炎的治疗作用。随着骨关节炎的进展，软骨细胞表达的Ⅱ型胶原蛋白逐渐减少[42]。此次实验结果显示，应用RAPA@Lipo@MS后衰老软骨细胞内的Ⅱ型胶原蛋白表达明显增加，成软骨相关基因表达升高，ADAMTS-5基因表达降低，说明通过增强自噬控制体内细胞质量，减少体内的衰老细胞，局部清除骨关节炎中的衰老细胞和衰老相关分泌表型因子，增强了其成软骨能力[43]。
RAPA@Lipo@MS通过增强自噬控制体内细胞质量、减少体内的衰老细胞，局部清除骨关节炎中的衰老细胞和SASP因子，以此减缓骨关节炎的进展，创造一个促进再生的软骨微环境。接下来将在动物体内应用RAPA@Lipo@MS，进而成为一种医工结合的新型临床治疗策略。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

增强自噬的可注射水凝胶微球改善软骨微环境抗软骨细胞衰老

Injectable hydrogel microspheres that enhance autophagy can improve cartilage microenvironment and resist chondrocyte senescence

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