阿仑膦酸钠/壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶膜的制备与表征

doi:10.12307/2025.455

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (22): 4720-4730.doi: 10.12307/2025.455

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阿仑膦酸钠/壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶膜的制备与表征

胡晨1，姜莹2，陈佳3，乔光伟1，董文1，马坚1

宁夏医科大学总医院，1口腔颌面外科，3口腔医院正畸科，宁夏回族自治区银川市 750004；2徐州市口腔医院口腔颌面外科，江苏省徐州市 221000

收稿日期:2024-04-24 接受日期:2024-07-05 出版日期:2025-08-08 发布日期:2024-12-06
通讯作者: 马坚，主任医师，宁夏医科大学总医院口腔颌面外科，宁夏回族自治区银川市 750004
作者简介:胡晨，女，1989 年生，黑龙江省哈尔滨市人，汉族，硕士，主治医师，主要从事口腔颌面外科骨组织工程方面的研究。姜莹，女，1996年生，江苏省徐州市人，汉族，硕士，医师，主要从事口腔颌面外科骨组织工程方面的研究。
基金资助:
宁夏自然科学基金项目(2021AAC03357)，项目负责人：胡晨

Preparation and characterization of alendronate/chitosan/polyvinyl alcohol composite hydrogel films

Hu Chen1, Jiang Ying2, Chen Jia3, Qiao Guangwei1, Dong Wen1, Ma Jian1

1Department of Oral and Maxillofacial Surgery, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Xuzhou Stomatological Hospital, Xuzhou 221000, Jiangsu Province, China; 3Department of Orthodontics, Stomatological Hospital, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China

Received:2024-04-24 Accepted:2024-07-05 Online:2025-08-08 Published:2024-12-06
Contact: Ma Jian, Chief physician, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Hu Chen, Master, Attending physician, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China Jiang Ying, Master, Physician, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Xuzhou Stomatological Hospital, Xuzhou 221000, Jiangsu Province, China
Supported by:
Ningxia Natural Science Foundation Project, No. 2021AAC03357 (to HC)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

水凝胶：是由亲水性聚合物链通过化学及物理交联而形成的高分子三维网络结构，可以在水中迅速溶胀并吸收大量的水分，同时保留原有的形状和结构而不溶解于水中。
阿仑膦酸钠：属于第三代双膦酸盐药物，可以通过抑制破骨细胞活性、抑制骨吸收而增加骨量，预防骨折，是治疗绝经后骨质疏松和老年性骨质疏松的一线用药。

背景：骨质疏松症是牙种植治疗的高风险因素，制备缓释阿仑膦酸钠的组织工程支架应用于骨质疏松患者口腔种植手术是当前口腔骨组织工程研究热点。

目的：制备阿仑膦酸钠/壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶膜，表征其缓释性能。
方法：①采用物理交联法制备不同质量比(壳聚糖与聚乙烯醇的质量比分别为3∶7、5∶5、7∶3)的壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶膜与单纯的壳聚糖、聚乙烯醇水凝胶膜，通过表征水凝胶膜的形貌、水接触角、力学性能、溶胀率与细胞相容性筛选适宜的水凝胶膜作为阿仑膦酸钠的载体。②制备含0，0.4，1.2，2.0 mg/L阿仑膦酸钠的单纯壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶膜，将大鼠骨髓间充质干细胞分别与4组水凝胶膜共培养，通过CCK-8法与CD44免疫荧光染色检测水凝胶膜的细胞相容性。将载药壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶膜浸泡于PBS中，采用紫外可见分光光度法检测复合水凝胶膜的药物释放性能。

结果与结论：①表征结果显示，随着水凝胶膜中聚乙烯醇质量的增加，水凝胶膜的结构密度增加、孔隙率减少，水接触角(均在90°以内)、断裂伸长率与抗压强度增大，平衡溶胀率降低，对大鼠骨髓间充质干细胞的增殖均无影响，单纯壳聚糖水凝胶膜可促进大鼠骨髓间充质干细胞的黏附，3∶7、5∶5比例复合水凝胶膜不影响大鼠骨髓间充质干细胞的黏附，单纯聚乙烯醇水凝胶膜、7∶3比例复合水凝胶膜抑制大鼠骨髓间充质干细胞的黏附，综合以上结果，选择5∶5复合水凝胶膜作为阿仑膦酸钠的载体。②CCK-8检测结果显示，含0.4，1.2 mg/L阿仑膦酸钠组复合水凝胶膜无细胞毒性；CD44免疫荧光染色结果显示，含0.4 mg/L阿仑膦酸钠组复合水凝胶膜不影响大鼠骨髓间充质干细胞的黏附，含1.2，2.0 mg/L阿仑膦酸钠组复合水凝胶膜抑制大鼠骨髓间充质干细胞的黏附；含0.4，1.2，2.0 mg/L阿仑膦酸钠的壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶膜在最初6 h内爆发性释放阿仑膦酸钠，此后均匀稳定地释放阿仑膦酸钠，释放时间达96 h以上。③结果表明，5∶5比例的壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶膜具有良好的理化性能、细胞相容性，可以作为阿仑膦酸钠的缓释载体。

https://orcid.org/0009-0005-0302-8257 (胡晨)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 阿仑膦酸钠, 壳聚糖, 聚乙烯醇, 水凝胶, 复合水凝胶膜, 种植体

Abstract: BACKGROUND: Osteoporosis is a high-risk factor for dental implant treatment. The preparation of tissue engineering scaffolds with sustained-release Alendronate and its application in oral implant surgery for osteoporosis patients is a current hot topic in oral bone tissue engineering research.
OBJECTIVE: To prepare alendronate/chitosan/polyvinyl alcohol composite hydrogel film and characterize its sustained release properties.
METHODS: (1) Chitosan/polyvinyl alcohol composite hydrogel films with varying mass ratios (mass ratios of chitosan and polyvinyl alcohol were 3:7, 5:5, and 7:3, respectively), chitosan and polyvinyl alcohol hydrogel films were prepared using a physical crosslinking method. By characterizing the morphology, water contact angle, mechanical properties, swelling rate, and cell compatibility of the hydrogel film, a suitable hydrogel film was screened as a carrier of alendronate. (2) Chitosan/polyvinyl alcohol composite hydrogel films containing 0, 0.4, 1.2, and 2.0 mg/L alendronate were prepared, and rat bone marrow mesenchymal stem cells were co-cultured with the four groups of hydrogel films. The cytocompatibility of the hydrogel films was detected by CCK-8 assay and CD44 immunofluorescence staining. The drug-loaded chitosan/polyvinyl alcohol composite hydrogel films were immersed in PBS. The drug release performance of the composite hydrogel films was detected by ultraviolet-visible spectroscopy.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The characterization results showed that with the increase of the mass of polyvinyl alcohol in the hydrogel film, the structural density of the hydrogel film increased, the porosity decreased, the water contact angle (all within 90°), the elongation at break and the compressive strength increased, and the equilibrium swelling rate decreased. It had no effect on the proliferation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Chitosan hydrogel film could promote the adhesion of rat bone marrow mesenchymal stem cells. The 3:7 and 5:5 ratio composite hydrogel films did not affect the adhesion of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Polyvinyl alcohol hydrogel film and 7:3 ratio composite hydrogel film inhibited the adhesion of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Based on the above results, the 5:5 composite hydrogel film was selected as the carrier of alendronate. (2) CCK-8 assay results showed that the composite hydrogel film containing 0.4 and 1.2 mg/L alendronate had no cytotoxicity. CD44 immunofluorescence staining results showed that the composite hydrogel film containing 0.4 mg/L alendronate did not affect the adhesion of rat bone marrow mesenchymal stem cells, while the composite hydrogel film containing 1.2 and 2.0 mg/L alendronate inhibited the adhesion of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Chitosan/polyvinyl alcohol composite hydrogel film containing 0.4, 1.2, and 2.0 mg/L alendronate released alendronate in the first 6 hours, and then released alendronate evenly and stably, with a release time of more than 96 hours. (3) The results showed that the chitosan/polyvinyl alcohol composite hydrogel film with a ratio of 5:5 had good physical and chemical properties and cytocompatibility, and could be used as a sustained-release carrier of alendronate.

Key words: alendronate, chitosan, polyvinyl alcohol, hydrogel, composite hydrogel film, implant

中图分类号:

胡晨, 姜莹, 陈佳, 乔光伟, 董文, 马坚. 阿仑膦酸钠/壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶膜的制备与表征[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(22): 4720-4730.

Hu Chen, Jiang Ying, Chen Jia, Qiao Guangwei, Dong Wen, Ma Jian. Preparation and characterization of alendronate/chitosan/polyvinyl alcohol composite hydrogel films[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(22): 4720-4730.

图/表（结果） 14

2.1 各组未载药水凝胶膜的形貌表征结果
2.1.1 水凝胶膜的物理外观采用物理交联法制备了壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶膜，如图1所示，膜呈淡黄色透明样，形状与10 cm培养皿底面形状相符，表面光滑平整，具有良好的延展性与柔韧性。

2.1.2 水凝胶膜截面显微镜观光学显微镜下观察各组水凝胶膜横截面形态，如图2所示。P100结构致密、无孔隙，C100结构疏松，具有孔隙状断裂面；随着水凝胶膜中聚乙烯醇质量的增加，壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶膜的结构密度增加、孔隙逐渐减少。

2.1.3 水凝胶膜扫描电镜观图3展示了各组水凝胶横截面的扫描电镜图像，C100、CP30、CP50结构是疏松分层的，各层次表面柔软光滑，高度互连，具有海绵状的特征结构，部分区域显示了层状聚合的叠加状态，类似于褶皱状，而CP70、P100则显示为均质结构，未见断裂面。

2.2 各组未载药水凝胶膜的水接触角检测结果图4为各组水凝胶膜的水接触角测试图像。各组水凝胶膜的水接触角数值，见表1，CP30组、CP50组、CP70组、P100组水接触角均大于C100组(P < 0.05)，CP70组、P100组水接触角均大于CP30组、CP50组(P < 0.05)，P100组水接触角大于CP70组(P < 0.05)。

所有水凝胶膜的水接触角均小于90°，表明各组水凝胶膜具有良好的亲水性，是一种有助于细胞贴壁生长与形态伸展良好的材料[22]。
2.3 各组未载药水凝胶膜的力学性能测试结果各组水凝胶膜的力学性能测试结果见图5。结合两种材料类型的主要目标之一是改善复合样品的机械性能。随着聚乙烯醇质量的增加，水凝胶膜的断裂伸长率、抗拉强度逐渐增大，组间断裂伸长率、抗拉强度两两比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.4 各组未载药水凝胶膜的溶胀率测试结果各组水凝胶膜的溶胀率曲线，见图6所示，5组水凝胶膜的溶胀率均在60 min达到平衡状态。除CP30组、CP50组溶胀率比较差异无显著性意义外(P > 0.05)，其余各组溶胀率组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。另外，虽然达到平衡状态时CP30组、CP50组溶胀率比较差异无显著性意义(P > 0.05)，但CP30组达到溶胀平衡后溶胀率呈下降趋势。

2.5 各组未载药水凝胶膜的傅里叶红外光谱测试结果如图7所示，在P100组红外光谱图中，波数为3 273 cm-1峰为羟基-OH伸动峰，波数为2 940 cm-1峰为亚甲基中C-H键伸缩振动峰，1 521 cm-1峰为C-OH弯曲振动峰，1 302 cm-1峰为-OH变形振动峰，1 094 cm-1峰归属于C-O键伸缩振动峰，848 cm-1峰为亚甲基中C-H键面外摇摆振动。在C100组外光谱图中，3 273 cm-1弱峰为氨基与羟基中-OH与N-H键伸缩振动峰，由于峰较弱，这表明该样品分子链内与链间存在大量的氢键，1 638 cm-1峰为酰胺Ⅰ带C=O键伸缩振动峰，1 521 cm-1峰为酰胺Ⅱ带中N-H键弯曲振动峰，1 408，1 302 cm-1峰为亚甲基中C-H键弯曲振动峰，1 065，1 022 cm-1峰为C-O键伸缩振动峰，646 cm-1峰为壳聚糖的结晶敏感峰。在CP70组红外光谱图中，波数为3 273 cm-1附近的羟基的伸缩振动峰强度强于C100组的羟基峰强度且峰宽度变宽，这说明聚乙烯醇与壳聚糖之间形成了氢键。在CP30组中，1 065，1 022 cm-1处壳聚糖中C-O键的特征峰得以保留，这说明在这个比例壳聚糖的结构较为完整。在CP50组、CP70组中1 065，1 022 cm-1峰处壳聚糖中C-O键的特征峰明显降低，646 cm-1处的结晶敏感峰逐渐消失，进一步说明了随着聚乙烯醇比例的增加，壳聚糖链的规整性逐渐被破坏且结晶度降低。3种复合水凝胶膜的红外光谱图基本相似，与单独的组分相比无明显特征峰出现，说明两种材料的混合只是物理混合，在CP50组红外光谱图中3 273 cm-1处峰更宽、强度更大，说明氢键缔合更加紧密。

2.6 各组载药复合水凝胶膜的傅里叶红外光谱测试结果如图8所示，在CP50组红外光谱图中，波数为3 273 cm-1峰为羟基-OH伸缩振动峰，波数为2 940 cm-1峰为亚甲基中C-H键伸缩振动峰，848 cm-1峰为亚甲基中C-H键面外摇摆振动，三者为聚乙烯醇的特征峰，1 638 cm-1峰为酰胺Ⅰ带C=O键伸缩振动峰，1 302 cm-1峰为亚甲基中C-H键弯曲振动峰，两者为壳聚糖的特征峰。在阿仑膦酸钠的红外光谱图中，波数为1 544 cm-1峰为N-H键弯曲振动峰，1 233 cm-1峰为C-N键伸缩振动峰，1 173，1 125 cm-1峰分别归属于PO2反对称伸缩振动与对称伸缩振动峰，1 245，1 015 cm-1峰为C-O键伸缩振动峰，913 cm-1峰为P-OH键伸缩振动峰。在0.4ACP组、1.2ACP组、2ACP组红外光谱中，1 065，1 033 cm-1峰分别归属于为P-OH键的反对称伸缩振动峰和对称伸缩振动峰，相较于CP50组1 065，1 021 cm-1峰的伸缩振动加强，P-OH键特征峰变宽，P-OH键含量增大，说明阿仑膦酸钠药物成功加载到了复合水凝胶膜上。913 cm-1处P-OH键伸缩振动峰消失说明该官能团与别的结构形成了氢键，与聚乙烯醇或壳聚糖中的某种结构进行了整合。另外，在0.4ACP组、1.2ACP组、2ACP组红外光谱图中，3 273，2 940，848 cm-1峰为聚乙烯醇的特征峰，1 638，1 302 cm-1峰为壳聚糖的特征峰，说明不同浓度阿仑膦酸钠的加入均没有破坏CP50的结构。

2.7 各组水凝胶膜对细胞增殖的影响图9A显示了各组未载药水凝胶膜浸提液中大鼠骨髓间充质干细胞的相对增殖率，结果显示：培养96 h后，各组未载药水凝胶膜浸提液中的大鼠骨髓间充质干细胞相对增殖率均大于75%，组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。图9B显示了各组载药复合水凝胶膜浸提液中大鼠骨髓间充质干细胞的相对增殖率，结果显示：0.4ACP组、1.2ACP组大鼠骨髓间充质干细胞的相对增殖率均大于75%；培养48，72，96 h，2ACP组细胞相对增殖率低于0.4ACP组、1.2ACP组(P < 0.05)，1.2ACP组细胞相对增殖率低于0.4ACP组(P < 0.05)，说明2ACP有轻度细胞毒性。

2.8 各组水凝胶膜对细胞黏附的影响如图10所示，C100组、CP30组、CP50组表面黏附的大鼠骨髓间充质干细胞数目与空白对照组相比无明显差异，CP70组黏附细胞数量减少，P100组基本已无细胞黏附。如图11所示，CP50组、0.4ACP组表面黏附的大鼠骨髓间充质干细胞数目与空白对照组相比无明显差异，随着阿仑膦酸钠质量浓度的增加，复合水凝胶膜上黏附的细胞越来越少。

定量分析结果显示，未载药水凝胶膜中，C100组黏附细胞数量多于其他5组(P < 0.05)，CP70组、P100组黏附细胞数量少于空白对照组、CP30组、CP50组(P < 0.05)，其余组间两两比较差异均无显著性意义(P > 0.05)；载药水凝胶膜中，1.2ACP组、2ACP组黏附细胞数量少于空白对照组、CP50组、0.4ACP组(P < 0.05)，2ACP组黏附细胞数量少于1.2ACP组，其余组间两两比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，见图12。

2.9 各组载药复合水凝胶膜中阿仑膦酸钠释放性能测试如图13所示，3组载药复合水凝胶膜在PBS中的最初6 h呈爆发性释放阿仑膦酸钠，此后在96 h内均表现出均匀稳定释放，并有继续释放的趋势。6 h后，2ACP组药物累计释药率达到37.2%，0.4ACP组、1.2ACP组药物累计释药率均在30%以下；0.4ACP组、1.2ACP组、2ACP组96 h后的药物累计释药率分别为83.1%，80.4%和82.5%，3组间药物累计释放率比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

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引言

随着口腔种植技术在临床中的大量开展，口腔种植手术的年龄局限性逐渐暴露出来。目前口腔种植手术成功案例多集中于中青年患者，老年患者因常伴有骨质疏松等骨代谢性疾病，口腔种植手术成功率较低[1-2]。双膦酸盐类药物，特别是含氮双膦酸盐，主要通过下调破骨细胞活性、抑制骨吸收发挥促成骨作用。阿仑膦酸钠就是含氮双膦酸盐的一种，能持续增加皮质骨厚度和骨密度，是目前已知对破骨细胞有明确抑制作用的药物，被广泛应用于治疗骨质疏松[3-5]。随着双膦酸盐类药物的广泛应用，越来越多文献报道了因长期口服或静脉注射双膦酸盐类药物导致相关性颌骨骨坏死的病例[6-7]。有研究表明，静脉注射双膦酸盐类药物时近一半剂量会被骨组织吸收，其中上、下颌骨特别是牙槽突区域骨代谢功能较四肢骨快，因而在上、下颌骨中双膦酸盐类药物浓度最高[8-9]。为避免全身用药的不良反应，越来越多研究尝试将双膦酸盐类药物用于局部治疗[10-11]。局部应用低剂量阿仑膦酸钠可促进骨再生，但传统的局部给药方式(如局部注射或局部涂敷)常会出现药物短时间内浓度过大、药物疗效作用时间较短等缺点，这就需要增加给药次数和剂量来维持血药浓度，因而并没有避免双膦酸盐类药物带来的不良反应[12-13]。因此，选择一种具有缓释功能的药物载体成为了研究热点。
壳聚糖水凝胶是一种具有三维网络结构的天然高分子材料，对环境无污染，具有易降解、来源广泛、价格低廉、生物相容性好等优点，并且可以通过控制交联程度来调整药物的加载量和释放量，被广泛用于再生医学及组织工程学领域，但膜质脆、机械性能较差、抗水性差、易降解等不足限制了壳聚糖的推广应用[14-15]。为了提高壳聚糖的物理强度、韧性、抗撕裂性和抗磨性，可以选择聚乙烯醇作为壳聚糖的共混聚合物。聚乙烯醇是一种由聚醋酸乙烯酯通过皂化反应水解而成的水溶性聚合物，化学性质稳定、无毒，具有良好的成膜性及生物相容性[16]。壳聚糖/聚乙烯醇水凝胶可以通过物理或化学方式交联制备。化学交联通过加入戊二醛等化学交联剂或通过化学反应使2条聚合物以共价键交联，由于受到化学反应或交联剂的影响限制了化学交联在生物医学领域的应用[17-18]。
因此，此次实验运用物理交联法制备负载阿仑膦酸钠的壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶膜，表征其理化性能与药物缓释作用，为临床扩大口腔种植修复技术的年龄适应范围提供重要参考，为阿仑膦酸钠/壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶膜运用于临床提供基础实验依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计材料表征和体外细胞学实验，组间比较进行单因素方差分析、非参数检验。
1.2 时间及地点实验于2021年3-12 月在宁夏医科大学总医院生物芯片中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 主要试剂与材料聚乙烯醇(光华，中国)；壳聚糖、阿仑膦酸钠、FITC标记的羊抗兔IgG、CD44兔单克隆抗体(Sigma，美国)；冰乙酸(分析纯，大茂，中国)；大鼠骨髓间充质干细胞(塞维尔，武汉)；PBS(中杉金桥，北京)；胎牛血清(Hyclone，美国)；DMEM低糖、0.25%胰蛋白酶(Gibco，美国)；双抗(青霉素/链霉素)、DIPA(Sigma-Aldrich，德国)；CCK-8检测试剂盒(Abcam，英国)；硫酸铈(Merck，德国)。
1.3.2 主要仪器数显恒温磁力搅拌器 85-2型(同创，中国)；全反射傅里叶变换红外光谱仪(IFS66V/S，Bruker，德国)；S-4800 扫描电子显微镜(日立高新，日本)；电热鼓风干燥箱(力辰科技，中国)；10 cm培养皿(华毅生物，中国)；A120Ｓ型电子天平(Sartorius，德国)；光学显微镜(Leica，德国)；接触角测量仪(Dataphysics，德国)；RGM-2100电子万能力学试验机(瑞格尔，中国)；UV-2450型紫外可见分光光度计(岛津，日本)；12PLUS恒温水浴摇床(Grant，英国)；A120S型电子天平(Sartorius，德国)；倒置荧光显微镜(Olympus，日本)。
1.4 实验方法
1.4.1 大鼠骨髓间充质干细胞的培养吸出大鼠骨髓间充质干细胞培养瓶内的多余培养基，置于培养箱内培养，24 h后首次换液，加入含双抗的完全培养基(含体积分数10%胎牛血清，1%青霉素-链霉素的DMEM培养基)3 mL。每2 d换液1次。待细胞融合> 80%后进行传代，首次以1∶2传代，之后1∶3、1∶4传代。选取第3代大鼠骨髓间充质干细胞进行后续实验。
1.4.2 不同质量比壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶膜的制备准确称取20 g聚乙烯醇颗粒置于烧杯中，加入180 mL去离子水定容，置于磁力加热搅拌器(90 ℃，500 r/min)上搅拌1 h，待样品溶解完全得到澄清透明的黏稠状溶液，冷却至室温，得到10%聚乙烯醇溶液备用。将2 g 壳聚糖粉末加入至200 mL乙酸水溶液(1 mol/L)中，手动振荡摇匀，使壳聚糖完全溶解，得到溶液备用。将壳聚糖与聚乙烯醇分别按照质量比3∶7、5∶5、7∶3、1∶0和0∶1混合，室温下搅拌过夜，溶液呈黏稠状透明均质，静置2 h；分别量取30 mL混合溶液置于10 cm×10 cm培养皿中，置入70 ℃鼓风干燥箱中干燥2 h，室温下干燥成膜，依次标记为CP70、CP50、CP30、C100、P100。
1.4.3 不同质量比壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶膜的表征检测通过水凝胶膜的表征检测结果，选择合适的一组水凝胶膜作为阿仑膦酸钠的载体。
(1)水凝胶膜理化性能表征
光镜观察：将5组水凝胶膜纵剖面冰冻切片，置于光镜下观察。
扫描电镜观察：将5组水凝胶膜于纵剖面固定，喷涂金钯膜数秒，置于扫描电镜下观察。
接触角检测：在室温条件下，定体积滴加去离子水约5 μL至5组水凝胶膜表面，使用接触角测量仪检测水接触角。
力学性能测试：在室温和相对湿度52%条件下，参照GB/T 1040.1-2018制样，以拉伸速度为50 mm/min用电子万能力学试验机检测5组水凝胶膜的抗拉强度和断裂伸长率。
水凝胶溶胀率测试：称量充分干燥的5组水凝胶膜质量(md)，分别浸泡于pH=7.4的PBS中，每隔30 min取出，称量水凝胶质量(mt)，计算溶胀率。溶胀率Q=(mt-md)/md×100%。
傅里叶红外光谱测试：使用全反射傅里叶变换红外光谱仪在4 000-400 cm-1 红外区内扫描，得到5组水凝胶膜的傅里叶红外光谱图，分析材料的化学结构。
(2)水凝胶膜细胞相容性表征
水凝胶膜浸提液的制备：参照ISO 10993-12:2021医疗器械生物学评价标准(双面面积总和3 cm2/mL)，将3.9 cm×3.9 cm水凝胶膜浸泡在10 mL完全培养基中室温下浸提24 h，得到5组水凝胶膜浸提液。
CCK-8法检测细胞增殖：将100 μL大鼠骨髓间充质干细胞悬液接种于96孔板内，细胞浓度为5.0×106 L-1，分7组培养：实验组分别加入C100、CP30、CP50、CP70、P100浸提液100 μL，阴性对照组加入完全培养基
100 μL，空白对照组加入完全培养基100 μL(无细胞)，每组5复孔。培养2 h及1，2，3，4 d后，加入CCK-8工作液孵育4 h，使用酶标仪检测450 nm处的吸光度值，计算细胞相对增殖率。细胞相对增殖率(%)=(A实验-A空白)/A阴性×100%。根据细胞相对增殖率值判断毒性分级，≥75%记为无细胞毒性，50% <细胞相对增殖率< 75%记为轻度细胞毒性，1%≤细胞相对增殖率≤50%记为中度细胞毒性，细胞相对增殖率< 1%记为重度细胞毒性。
CD44免疫荧光染色检测细胞黏附：CD44作为大鼠骨髓间充干细胞明确阳性表达的表面抗原，用其标记大鼠骨髓间充质干细胞后倒置荧光显微镜下可观察到完整的细胞形态。将C100、CP30、CP50、CP70、P100剪成1.5 cm×1.5 cm的正方形，经环氧乙烷及紫外线消毒后置于6孔板内。将1 mL大鼠骨髓间充质干细胞悬液分别接种于含有水凝胶膜的6孔板内，细胞浓度为5.0×106 L-1，空白对照为单纯的大鼠骨髓间充质干细胞培养组，每组3复孔。培养5 d后取出培养板，吸出培养基，40 g/L多聚甲醛固定20 min，用PBS冲洗3次，每次5 min；用0.2%TritonX-100打孔，小牛血清封闭，吸干封闭液，用PBS冲洗3次，每次5 min；加入CD44兔单克隆抗体4 ℃孵育过夜，用PBS冲洗3次，每次5 min；加入FITC标记山羊抗兔IgG，37 ℃杂交1 h，用PBS冲洗3次，每次5 min；加入5 mg/L DAPI避光孵育复染核2 min，用PBS冲洗3次，每次5 min；用含抗荧光淬灭剂的封固液封固，置于倒置荧光显微镜下观察、拍照。使用Image J 软件检测免疫荧光染色强度，进行半定量分析。
1.4.4 负载不同质量浓度阿仑膦酸钠壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶膜的制备大量研究表明，≤10-5 mol/L的阿仑膦酸钠对成骨细胞没有毒性作用，> 10-10 mol/L的阿仑膦酸钠对破骨细胞开始有抑制作用，随着阿仑膦酸钠浓度的增大，对破骨细胞抑制作用增强[19-20]，因此实验在10-6-10-5 mol/L数量级中选取阿仑膦酸钠质量浓度梯度，分别为0.4，1.2，2.0 mg/L。
准确称取0.04 g阿仑膦酸钠粉末置于100 mL容量瓶中，加入去离子水定容，振荡摇匀，使阿仑膦酸钠完全溶解，得到0.4 g/L阿仑膦酸钠溶液备用。用移液枪移分别取220，660，1100 μL 0.4 g/L阿仑膦酸钠溶液加入壳聚糖与聚乙烯醇质量比5∶5的混合溶液中，于室温下搅拌过夜，溶液呈黏稠状透明均质，静置2 h；分别量取30 mL混合溶液置于10 cm×10 cm培养皿中，置入70 ℃鼓风干燥箱中干燥2 h，室温下干燥成膜，得到含0.4，1.2，2.0 mg/L阿仑膦酸钠的壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶膜，依次标记为0.4ACP、1.2ACP、2ACP。
1.4.5 载药复合水凝胶膜的傅里叶红外光谱测试使用全反射傅里叶变换红外光谱仪在4 000-400 cm-1 红外区内扫描，得到CP50、阿仑膦酸钠、0.4ACP、1.2ACP、2ACP的傅里叶红外光谱图，分析材料的化学结构。
1.4.6 载药复合水凝胶膜的细胞相容性检测按照1.4.3中的方法制备CP50、0.4ACP、1.2ACP、2ACP水凝胶膜浸提液。
CCK-8法检测细胞增殖：将100 μL大鼠骨髓间充质干细胞悬液接种于96孔板内，细胞浓度为5.0×106 L-1，分5组培养：实验组分别加入0.4ACP、1.2ACP、2ACP浸提液100 μL，阴性对照组加入CP50水凝胶膜浸提液100 μL，空白对照组加入完全培养基100 μL(无细胞)，每组5复孔。培养2 h及1，2，3，4 d后，加入CCK-8工作液孵育4 h，使用酶标仪检测450 nm处的吸光度值，计算细胞相对增殖率。根据细胞相对增殖率判定细胞毒性。
CD44免疫荧光染色检测细胞黏附：将CP50、0.4ACP、1.2ACP、2ACP剪成1.5 cm×1.5 cm的正方形，经环氧乙烷及紫外线消毒后置于6孔板内。将1 mL大鼠骨髓间充质干细胞悬液分别接种于含有水凝胶膜的6孔板内，细胞浓度为5.0×106 L-1，空白对照为单纯的大鼠骨髓间充质干细胞培养组，每组3复孔。培养5 d后取出培养板，进行CD44免疫荧光染色，染色步骤与定量分析
同1.4.3。
1.4.7 紫外-可见分光光度法测试载药复合水凝胶膜中的阿仑膦酸钠释放性能参照ISO 10993-12:2021医疗器械生物学评价标准，分别制备2ACP、CP50的PBS浸提液10 mL，取2ACP、CP50浸提液、PBS各2 mL，分别加入0.1%硫酸铈溶液1.5 mL混合均匀，室温下反应1 h，用0.5 mol/L硫酸溶液定容至10 mL，在220-600 nm波长范围内进行扫描，测定可行性，将320 nm定为阿仑膦酸钠的测量波长。精密称取阿仑膦酸钠 8 mg，加入100 mL去离子水中备用；分别吸取备用溶液0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL置于烧杯中，作为标准溶液，以0.5 mol/L硫酸溶液同法制备溶液为阴性对照，于320 nm处测定吸光度值，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标，得出阿仑膦酸钠在1.6-24.0 μg/mL质量浓度范围内呈线性关系，标准曲线为：y=0.042 7x+0.055 8，R2=0.996 8。
称取一定质量的0.4ACP、1.2ACP、2ACP各4份，分别放入密闭的20 mL玻璃瓶中，加入10 mL PBS，置于37 ℃恒温摇床(100 r/min)中，前6 h，每小时取2 mL阿仑膦酸钠释放液；12，24，36，48，60，72，84，96 h，分别取2 mL阿仑膦酸钠释放液，每次取样后向瓶中补加2 mL PBS，于320 nm处测定吸光度值，计算阿仑膦酸钠的累计释放率。
1.5 主要观察指标不同质量比壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶膜的形貌、水接触角、力学性能、溶胀率与细胞相容性，不同质量浓度阿仑膦酸钠/壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶膜的细胞相容性与药物缓释性能。
1.6 统计学分析采用SPSS 26.0软件进行统计学分析，检测数据呈正态分布，组间比较采用单因素方差分析；检测数据呈非正态分布，采用非参数检验。P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经宁夏医科大学生物统计学专家审核。

讨论

壳聚糖水凝胶是一种具有多孔隙结构的天然高分子材料，这些孔隙既可以作为储存药物的仓库，又可以充当药物扩散的途径[15]。孔隙可以在水凝胶合成过程中通过相分离形成，交联密度是控制孔径、孔体积分数的关键因素，通过改变交联密度可以调整药物的加载量和释放量[23]。此次实验选取壳聚糖水凝胶作为药物的载体，但壳聚糖水凝胶的显著缺点是机械性能低，易导致水凝胶过早溶解，使负载药物从目标部位过早流出[18，24-25]。交联可以为复合水凝胶膜提供机械强度和物理完整性，当水凝胶具有添加剂特性，例如聚乙烯醇，可极大提高材料的机械性能[26]。此次实验在壳聚糖水凝胶中加入聚乙烯醇后复合水凝胶膜的抗拉强度及断裂伸长率得到了显著提高。各组水凝胶膜的断裂伸长率、抗拉强度多重比较均存在显著差异，这可能由于聚乙烯醇的加入改变了-NH2和-OH基团的分子间作用力，提高了复合水凝胶膜的机械性能[27]。同时随着聚乙烯醇含量的增加，壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶膜的结构密度增加、孔隙逐渐减少，药物的储存及扩散途径也随之减少，增加了材料延缓药物释放的性能[15，25]。因此，保留恰当的孔隙率可以控制药物从水凝胶基质中的扩散，降低药物释放速率。
水凝胶良好的亲水及吸水膨胀性能使之在膨胀状态下保留大量水或生物液体，具有类似于活体组织的质地，完全膨胀的水凝胶在植入体内后可以最大限度地减少对周围组织的刺激，将治疗药物固定在由半透膜包围的聚合物基质中，保护它们免受免疫系统排斥[28-30]。此次实验中所有壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶膜的水接触角都小于90°，并且均在60 min达到溶胀平衡状态，这表明所有壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶膜都具有良好的亲水性和吸水膨胀性。溶胀达到平衡状态时，CP30、CP50的溶胀率高于CP70及P100(P < 0.05)，表明CP30、CP50的亲水性和吸水膨胀性能更佳。虽然达到溶胀平衡状态时CP30、CP50溶胀率比较无显著差异，但CP30复合水凝胶膜溶胀率在达到溶胀平衡后仍呈下降趋势，这和C100溶胀率曲线趋势一致。考虑含壳聚糖质量比例较大的水凝胶膜虽能提高平衡溶胀率，但链间分子力较弱，当高度膨胀时链间分子力将不再能够抵抗任何外力，水凝胶结构被侵蚀发生分解[24]。而结合了更多聚乙烯醇的CP50红外光谱图中，3 273 cm-1处峰更宽、强度更大，说明氢键缔合更加紧密，表明水凝胶结构中交联的更加紧密。水凝胶结构中交联紧密度可提供弹性力，阻止水凝胶在水中无限溶解，防止了链间相互垮塌，增加刚度，这些特性对于保护药物成功递送至移植部位免受机械变形及材料降解非常重要[18，24，31- 32]。由于优异的亲水性、机械强度、溶胀能力，此次实验选择CP50复合水凝胶膜作为药物递送的构型。
此次实验结果显示，最初6 h，阿仑膦酸钠从复合水凝胶膜中呈爆发性释放，可能是由于初始时药物与周围环境之间形成了较大浓度梯度差，使材料内部较表浅的药物快速扩散出水凝胶膜。众所周知，阿仑膦酸钠可以作为骨吸收抑制剂加速骨生长和间隙愈合[33]，因此，此次实验中阿仑膦酸钠在复合水凝胶膜中的早期突释可能会对骨结合过程的早期阶段发挥有益作用。对于种植体骨结合而言，早期固定、平衡局部骨代谢、满足骨结构和成分要求可以增强种植体初期稳定性，降低种植体植入初期发生微动进而导致种植失败的风险[34]。6 h后，复合水凝胶膜中的阿仑膦酸钠均表现出均匀稳定释放，释放时间长达96 h且释放曲线逐渐变缓，释放速率逐渐降低并有继续释放的趋势。药物释放时间的延缓可以使阿仑膦酸钠以局部小浓度持续作用于种植体周围骨，能够在种植体周围较长时间维持治疗浓度，这为临床增强骨密度、改善种植体周围骨质疏松环境提供了一个有效思路。
生物材料在临床使用时不仅要具有各种理化性能，还要具有良好的生物相容性，对细胞无明显的生物毒性[35]。此次实验采用CCK-8法及CD44免疫荧光染色法进行各未载药水凝胶膜生物相容性检测，CCK-8检测结果表明，不同质量比例的壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶膜对大鼠骨髓间充质干细胞无毒性作用，是一种具有良好生物相容性的材料[18，36]；但CD44免疫荧光染色结果与CCK-8检测结果有所不同，显示CP70、P100具有一定的细胞毒性作用，考虑为聚乙烯醇细胞黏附性较差的原因[37]。CCK-8检测结果显示，0.4ACP、1.2ACP浸提液培养24 h的大鼠骨髓间充质干细胞相对增殖率均高于75%，表明0.4ACP、1.2ACP均具有良好的细胞相容性；培养48 h后，0.4 ACP组、1.2ACP组、2ACP组细胞相对增殖率比较差异显著(P < 0.05)，说明负载阿仑膦酸钠的复合水凝胶膜毒性随阿仑膦酸钠质量浓度的上升而上升，因此0.4ACP是生物相容性最好的复合水凝胶构型；培养96 h后，2ACP组细胞相对增殖率在55%-77%之间，与其余各组相比差异显著(P < 0.05)，说明2ACP具有轻度细胞毒性。
综上所述，CP50具有良好的机械性能与生物相容性，可以作为阿仑膦酸钠药物缓释材料和细胞支撑材料。负载0.4 mg/L阿仑膦酸钠的CP50具有良好的细胞相容性，未观察到明显的细胞毒性作用，表明0.4 mg/L 阿仑膦酸钠是生物相容性良好的应用质量浓度，可用于后续动物实验给药。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

阿仑膦酸钠/壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶膜的制备与表征

Preparation and characterization of alendronate/chitosan/polyvinyl alcohol composite hydrogel films

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