超声引导针刀松解椎间孔内口对兔软骨终板基质稳态的影响

doi:10.12307/2025.647

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (18): 3758-3766.doi: 10.12307/2025.647

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超声引导针刀松解椎间孔内口对兔软骨终板基质稳态的影响

胡斌涵1，陈灿1，黄茂畅1，赵宇1，刘俊宁1，2，牛素生1，2，张燕1，2

福建中医药大学，1中医学院，2中医骨伤及运动康复教育部重点实验室，福建省福州市 350122

收稿日期:2024-06-21 接受日期:2024-08-12 出版日期:2025-06-28 发布日期:2024-11-27
通讯作者: 张燕，博士，副教授，福建中医药大学，中医学院，中医骨伤及运动康复教育部重点实验室，福建省福州市 350122
作者简介:胡斌涵，男，1997年生，重庆市人，汉族，福建中医药大学中医学院在读硕士，主要从事中医药防治骨关节疾病的基础与临床研究。
基金资助:
福建省自然科学基金项目(2023J01862)，项目负责人：张燕；国家中医药管理局高水平中医药重点学科建设项目(中医骨伤科学，zyyzdxk-2023106)；福建中医药大学中医骨伤科学学科开放课题资助(XGS2023017)，项目负责人：张燕；福建中医药大学基础学科科研提升计划(XJC2022008)，项目负责人：张燕

Effect of ultrasound-guided needle-knife on matrix homeostasis of rabbit cartilaginous endplate

Hu Binhan1, Chen Can1, Huang Maochang1, Zhao Yu1, Liu Junning1, 2, Niu Susheng1, 2, Zhang Yan1, 2

1School of Traditional Chinese Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China; 2Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine for Bone Injury and Sports Rehabilitation, Ministry of Education, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China

Received:2024-06-21 Accepted:2024-08-12 Online:2025-06-28 Published:2024-11-27
Contact: Zhang Yan, MD, Associate professor, School of Traditional Chinese Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China; Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine for Bone Injury and Sports Rehabilitation, Ministry of Education, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China
About author:Hu Binhan, Master candidate, School of Traditional Chinese Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China
Supported by:
Natural Science Foundation of Fujian Province, No. 2023J01862 (to ZY); State Administration of Traditional Chinese Medicine High-level Chinese Medicine Key Discipline Construction Project, No. zyyzdxk-2023106; Open Topic Funding for the Discipline of Traditional Chinese Medicine Orthopedics and Traumatology, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, No. XGS2023017 (to ZY); Basic Science Research Enhancement Program of Fujian University of Traditional Chinese Medicine, No. XJC2022008 (to ZY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
椎间孔内口：是脊神经进入椎间孔的入口，由椎上切迹与椎下切迹构成上下壁，椎体后缘、椎间盘构成前壁，黄韧带、关节突关节构成后壁。
软骨基质稳态：是指软骨细胞外基质成分合成和降解保持平衡，基质中Ⅱ型胶原、蛋白聚糖等含量稳定的状态。

背景：软骨终板基质稳态与椎间盘退变关系密切，针刀松解椎间孔内口后壁黄韧带可改善腰椎间盘退变患者的症状，其作用机制是否与调控软骨终板基质稳态有关尚待明确。
目的：探讨超声引导下针刀松解兔L7/S1椎间孔内口对软骨终板基质稳态的影响。
方法：24只雄性新西兰兔随机分为对照组6只、造模组18只，采用横断棘上棘间韧带后间歇性站立的方式进行腰椎间盘退变造模，时间为12周。造模后将造模组随机分为模型组、针刀组、假针刀组，每组6只。针刀组在超声引导下针刀松解兔L7/S1右侧椎间孔内口后壁黄韧带，假针刀组针刀只抵达椎间孔内口后壁黄韧带表面，共干预4次，每次间隔1周；对照组、模型组兔不做干预。干预结束30 d后，MRI观察椎间盘退变情况；苏木精-伊红染色、番红O固绿染色观察L7/S1椎间盘软骨终板、髓核、纤维环形态并评分；免疫组化检测L7/S1椎间盘髓核、软骨终板Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、基质金属蛋白酶13表达。
结果与结论：①MRI显示，L7/S1髓核相对灰度值模型组明显低于对照组(P < 0.01)，针刀组高于模型组和假针刀组(P < 0.05)；②苏木精-伊红染色及番红O固绿染色显示，模型组髓核、纤维环退变明显，软骨终板变薄，与骨性终板交界处钙化明显，针刀组软骨终板形态及髓核退变较模型组改善；模型组、针刀组、假针刀组形态学评分明显高于对照组(P < 0.01)；针刀组评分明显低于模型组和假针刀组(P < 0.01)；③免疫组化显示，与对照组比较，模型组和假针刀组髓核、软骨终板中Ⅱ型胶原、蛋白聚糖表达明显降低(P < 0.01)，基质金属蛋白酶13表达明显升高(P < 0.01)；与模型组、假针刀组比较，针刀组髓核、软骨终板Ⅱ型胶原、蛋白聚糖表达升高(P < 0.05)，基质金属蛋白酶13表达明显降低(P < 0.01)；④结论：针刀松解椎间孔内口可调节兔软骨终板基质稳态，改善椎间盘退变。
https://orcid.org/0009-0008-2262-8604(胡斌涵)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 腰椎间盘退变, 软骨终板, 针刀, 椎间孔内口, 超声

Abstract: BACKGROUND: Cartilaginous endplate stromal homeostasis is closely related to intervertebral disc degeneration. Acupotomy that releases posterior wall ligamentum flavum of the interforaminal orifice can improve the symptoms of patients with lumbar disc degeneration. Whether the mechanism of action is related to the regulation of cartilaginous endplate stromal homeostasis remains to be clarified.
OBJECTIVE: To investigate the effect of ultrasound-guided needle-knife relaxation of the internal orifice of the rabbit L7/S1 intervertebral foramina on the matrix homeostasis of the rabbit cartilage endplate.
METHODS: A total of 24 male New Zealand rabbits were randomly divided into a control group (n=6) and a modeling group (n=18). Lumbar disc degeneration modeling was performed by intermittent standing after transection of the supraspinous interspinous ligament for 12 weeks. After modeling, the modeling group was randomly divided into model group, needle-knife group and fake needle knife group, with 6 rabbits in each group. In the needle-knife group, the ultrasound-guided needle-knife released the ligamentum flavum posterior wall of the right intervertebral foramina, while in the fake needle-knife group, the needle-knife only reached the surface of the posterior wall ligamentum flavum of the intervertebral foramina, with a total of four interventions, each time at an interval of 1 week. No intervention was performed in the control and model groups. Thirty days after the intervention, the disc degeneration was observed by MRI. The morphology of L7/S1 intervertebral disc cartilaginous endplate, nucleus pulposus and annulus fibrosus were observed with hematoxylin-eosin and safranin O-fast green staining and was then scored. The expressions of type II collagen, proteoglycan and matrix metalloproteinase-13 in nucleus pulposus and cartilage endplate of L7/S1 intervertebral disc were detected by immunohistochemistry.
RESULTS AND CONCLUSION: MRI results showed that the relative gray value of L7/S1 nucleus pulposus was significantly lower in the model group than in the control group (P < 0.01), and higher in the needle-knife group than in the model group and the fake needle-knife group (P < 0.05). Hematoxylin-eosin and safranin O-fast green staining showed obvious degeneration of the nucleus pulposus and annulus fibrosus, thinning of the cartilaginous endplate, and obvious calcification at the junction with bone endplate in the model group. The morphology of the cartilaginous endplate and degeneration of the nucleus pulposus were improved in the needle-knife group compared with the model group. The morphological scores of the model group, needle-knife group and fake needle-knife group were significantly higher than those of control group (P < 0.01). The morphological score of the needle-knife group was significantly lower than that of the model group and fake needle-knife group (P < 0.01). Immunohistochemistry results showed that compared with the control group, the expressions of type II collagen and Aggrecan in the nucleus pulposus and cartilage endplate in the model group and fake needle-knife group were significantly decreased (P < 0.01), while the expression of matrix metalloproteinase-13 was significantly increased (P < 0.01). Compared with the model group and fake needle-knife group, the expressions of type II collagen and Aggrecan in the nucleus pulposus and cartilage endplate were increased in the needle-knife group (P < 0.05), while the expression of matrix metalloproteinase-13 was decreased significantly (P < 0.01). In conclusion, the relaxation of the interforaminal orifice by needle knife can regulate the matrix homeostasis of the rabbit cartilage endplate and improve the degeneration of the intervertebral disc.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: lumbar disc degeneration, cartilaginous endplate, needle knife, internal orifice of the intervertebral foramina, ultrasound

中图分类号:

胡斌涵, 陈灿, 黄茂畅, 赵宇, 刘俊宁, 牛素生, 张燕. 超声引导针刀松解椎间孔内口对兔软骨终板基质稳态的影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(18): 3758-3766.

Hu Binhan, Chen Can, Huang Maochang, Zhao Yu, Liu Junning, Niu Susheng, Zhang Yan. Effect of ultrasound-guided needle-knife on matrix homeostasis of rabbit cartilaginous endplate[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(18): 3758-3766.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物一般情况 24只新西兰兔分为4组，各组兔实验过程中均无脱失。针刀组兔干预过程中未出现下肢抽动，进针点未见无色透明液体渗出。
2.2 各组椎间盘MRI检查结果
2.2.1 MRI显示对照组T2WI像可见髓核呈高亮信号，与纤维环、软骨终板界限清晰；模型组髓核呈灰-黑色，与纤维环、软骨终板界限模糊，纤维环超出椎体终板边缘，椎间盘高度较对照组下降；针刀组髓核亮度略高于模型组，与纤维环、软骨终板界限相对清晰，椎间盘高度较对照组下降，但高于模型组；假针刀组髓核亮度处于模型组与针刀组之间，髓核明显缩小，见图3A。
2.2.2 L7/S1椎间盘相对灰度值比较模型组、针刀组、假针刀组 L7/S1椎间盘相对灰度值均低于对照组(P < 0.01，P < 0.05，P < 0.01)；针刀组高于模型组、假针刀组(P < 0.05)；假针刀组稍高于模型组，但差异无显著性意义(P > 0.05)，见图3B。
2.3 各组椎间盘苏木精-伊红染色、番红O固绿染色及形态学评分结果干预结束30 d后，苏木精-伊红染色及番红O固绿染色结果显示，对照组L7/S1髓核呈椭圆形，有大量圆形空泡状的脊索细胞，基质呈凝胶状；纤维环呈规则的层状结构；软骨终板表层细胞呈椭圆形或梭形，深层细胞近圆形，沿椎间盘盘面方向整齐排列，其与骨性终板交界处含有大量毛细血管。模型组L7/S1髓核不规则，圆形空泡状的脊索细胞消失，出现大量散在的软骨样细胞，基质散在被番红浅染；内层纤维环内折明显，存在大量蛇形纤维，部分断裂，髓核突出至内层纤维环与外层纤维环间；软骨终板厚度不均，较对照组明显变薄，细胞排列紊乱，数量减少，深层近圆形的软骨细胞大量消失，与对照组相比，模型组软骨终板与骨性终板交界处出现钙化区，分隔软骨基质与血管。
针刀组L7/S1髓核呈椭圆形，脊索细胞、软骨样细胞混杂，基质部分浓缩；内层纤维环部分纤维排列紊乱，髓核与纤维环界限相对清晰；软骨终板厚度较模型组均匀，细胞形态与排列较整齐，其与骨性终板交界处含有大量毛细血管。假针刀组L7/S1髓核呈椭圆形，脊索细胞数量较对照组大量减少，可见少量聚集于髓核中央区域圆形空泡状的脊索细胞，基质明显浓缩，可见大面积无细胞存在的基质区域；内层纤维环纤维呈蛇形，髓核与纤维环界限不清；软骨终板变薄，细胞排列紊乱，数量减少，软骨终板与血管间可见明显的钙化区。
形态学评分比较显示，模型组、针刀组、假针刀组评分明显高于对照组(P < 0.01)；针刀组评分明显低于模型组、假针刀组(P < 0.01)；假针刀组评分低于模型组，但差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4。
2.4 各组兔L7/S1椎间盘髓核Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、基质金属蛋白酶13表达免疫组化显示，模型组和假针刀组髓核Ⅱ型胶原、蛋白聚糖阳性表达明显低于对照组(P < 0.01)，基质金属蛋白酶13阳性表达明显高于对照组(P < 0.01)。针刀组Ⅱ型胶原阳性表达明显高于模型组和假针刀组(P < 0.01)，低于对照组(P < 0.05)；蛋白聚糖阳性表达明显高于模型组和假针刀组(P < 0.01，P < 0.05)，低于对照组(P < 0.01)；基质金属蛋白酶13阳性表达明显低于模型组和假针刀组(P < 0.01)，略高于对照组，但差异无

显著性意义(P > 0.05)。假针刀组Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、基质金属蛋白酶13阳性表达与模型组差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5。
2.5 各组兔L7/S1软骨终板Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、基质金属蛋白酶13表达免疫组化显示，模型组和假针刀组软骨终板Ⅱ型胶原、蛋白聚糖阳性表达明显低于对照组(P < 0.01)，基质金属蛋白酶13阳性表达明显高于对照组(P < 0.01)。针刀组Ⅱ型胶原、蛋白聚糖阳性表达明显高于模型组和假针刀组(P < 0.01)，低于对照组(P < 0.01)；基质金属蛋白酶13阳性表达明显低于模型组和假针刀组(P < 0.01)，高于对照组(P < 0.01)。假针刀组Ⅱ型胶原、蛋白聚糖阳性表达明显高于模型组(P < 0.01)，基质金属蛋白酶13阳性表达略低于模型组，但差异无显著性意义，见图6。

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引言

椎间盘退行性变是腰椎退行性变的始动因素和病理基础，在此基础上可发生腰椎间盘突出症、腰椎管狭窄症等疾病[1-2]。临床应用针刀松解椎间孔内口后壁黄韧带后[3-4]，可有效减轻腰椎间盘突出症患者腰痛及下肢放射痛、麻木等症状，但具体作用机制尚待明确。研究表明大部分腰痛患者存在不同程度的软骨终板损伤[5]。BONNHEIM等[6]发现椎间盘退变严重程度与软骨终板较高的胶原蛋白/蛋白多糖比值和较低的渗透性相关。BOOS等[7]通过分析胎儿到老年(88岁)腰椎组织学差异，发现软骨终板退变明显早于髓核退变，认为软骨终板退变是椎间盘退变的始动因素。软骨终板对于维持髓核和椎骨之间力学支持及介导髓核营养代谢至关重要[8]。正常情况下软骨终板处于低代谢状态，基质成分稳定，当软骨细胞受到炎症因子、异常机械加载等刺激，基质中的Ⅱ型胶原、蛋白聚糖含量下降，基质稳态失衡[9]，进而影响髓核营养代谢，椎间盘发生退变[10]。
课题组前期发现腰椎间盘退变模型兔的黄韧带较正常组明显肥厚，胶原纤维增生、走行紊乱，针刀干预后针刀松解区黄韧带出现瘢痕化，但针刀未松解区域的黄韧带胶原纤维含量相对于模型组和假针刀组明显减少，腰椎动力位片也未出现相应节段腰椎失稳程度加重[11]。进一步研究发现针刀松解椎间孔内口处黄韧带能够通过降低力学敏感蛋白整合素α5、β1的表达，抑制p38、核因子κB的表达改善兔腰椎间盘退变[12]。软骨终板是椎间盘物质交换和营养代谢的重要通路，同时在髓核、纤维环和椎骨之间提供力学传导，与椎间盘退变关系密切[13-14]。针刀松解椎间孔内口处黄韧带后改善椎间盘退变是否与影响软骨终板的稳态有关，值得进一步研究。因此，此次研究从软骨终板退变的角度，探讨超声引导下针刀松解兔腰椎椎间孔内口对软骨终板稳态的调控作用，为针刀松解椎间孔内口治疗腰椎间盘退变提供实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，多组之间比较采用ANOVA检验和非参数秩和检验(Kruskal-Wallis检验)。
1.2 时间及地点实验于2023年3月至2024年4月在福建中医药大学中医骨伤及运动康复教育部重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物与分组 24只4月龄健康雄性新西兰兔，体质量2.0-2.5 kg，购自上海市松江区松联实验动物场，生产许可证号：SCXK(沪)2021-107；饲养于福建中医药大学实验动物中心，使用许可证号：SYXK(闽)2020-0003。按数字随机法将24只新西兰雄兔分为对照组(6只)、造模组(18只)，造模完成后，将造模组随机分为模型组、针刀组和假针刀组，每组6只。所有实验均获得福建中医药大学动物伦理委员会批准(审批编号：2023385)。
1.3.2 试剂与仪器舒泰50(法国维克有限公司，BN 93H7A)；速眠新Ⅱ(盐酸赛拉嗪注射液，敦化市圣达动物药品有限公司，070031777)；硫酸阿托品注射液(山西省芮城科龙兽药有限公司，040191511)；苏木素伊红染色试剂盒(索莱宝，G1120)；改良番红O固绿软骨染色试剂盒(索来宝，G1371)；Ⅱ型胶原抗体(MyBioSource，MBS2001926)；基质金属蛋白酶13抗体(CAU30936，biomatik)；蛋白聚糖抗体(Thermo Fisher，MA3-16888)；山羊抗豚鼠IgG(abcam，ab6908)；山羊抗小鼠IgG(abcam，ab6789)；3.0T超导型核磁共振成像系统(SIGNA Archiect)；华声牌便携式彩色多普勒超声系统(型号Clover 60，L15-4线阵探头)；一次性使用无菌小针刀(华夏汉章，1.0 mm×80 mm)。
1.4 实验方法
1.4.1 造模方法采用课题组前期造模方法[12]，皮下注射硫酸阿托品(0.05 mL/kg)20 min后，肌肉注射舒泰50(0.05 mL/kg)、盐酸赛拉嗪注射液(0.05 mL/kg)诱导兔全身麻醉。麻醉成功后，将兔俯卧位屈膝屈髋固定，沿L5、L6、L7棘突连线正中切开长度2 cm皮肤，分离浅筋膜，纵向切开L5/6、L6/7的棘上、棘间韧带两侧深筋膜，分离出L5/6和L6/7的棘上、棘间韧带，并将其剪断(见图1A)。术后1周，再将兔颈戴伊丽莎白圈，调整体位后放入装置中(圈径小于装置直径)，保持直立姿势(见图1B)，每日2次，每次3 h，中间休息2 h，持续12周。
1.4.2 干预方法
针刀组：造模成功后开始干预。麻醉后兔俯卧屈膝屈髋位，体表定位L7棘突后，消毒铺巾。针刀采用纵轴入路[15]，将肌骨超声高频探头平行于后正中线放置于L7棘突上，探头Mark点朝向头侧，缓慢向右侧移动探头，超声图像上可见棘突影逐渐消失，椎板间隙、关节突关节出现。将L7/S1右侧关节突关节出现的平面作为干预平面(见图2A)。以1.0 mm×80 mm型号针刀垂直破皮后，调整针刀角度，与体表成60°从探头尾侧正中进入干预平面，在超声引导下，针刀尖部紧贴L7/S1右侧关节突关节内下缘进入黄韧带(见图2B)，刀刃与黄韧带纤维走行方向相垂直，对椎间孔内口处黄韧带进行松解，以超声下观察到刀刃突破黄韧带，术者手下出现落空感为度，每周干预1次，每次切割3刀，共干预4次 [15]。注意观察操作过程中兔是否出现下肢抽动、出针后是否有无色透明液体渗出。
其他各组：假针刀组入路及干预次数同针刀组，但针刀只抵达椎间孔内口后壁黄韧带表面，不进行松解；对照组、模型组同样抓取兔，但不做干预。
1.4.3 MRI检查干预结束30 d后，麻醉下行兔L4-S1节段椎间盘MRI检查。采用T2加权像(T2WI)，扫描参数

如下：矢状面TR=4 000 ms、TE=120 ms、层厚1 mm；横断面TR=4 000 ms、TE=120 ms、层厚2 mm。根据改良Schneiderman′s法使用Image J图像软件测量L7/S1椎间盘髓核正中区域与同一水平脑脊液的灰度值[16]，两者相比计算出L7/S1节段髓核的相对灰度值，对椎间盘退变程度进行评估[17]。
1.4.4 取材方法 MRI检查后，将兔麻醉放血处死，完整取出各组L7/S1节段，于椎弓根处分离椎体与附件，完整取出L7/S1节段前柱，40 g/L多聚甲醛固定48 h，10% EDTA溶液脱钙1个月。
1.4.5 苏木精-伊红染色、番红O固绿染色观察椎间盘形态组织脱钙后，梯度脱水、透明、浸蜡，进行石蜡包埋、切片，切片厚度4 μm。苏木精-伊红染色、番红O固绿染色观察椎间盘软骨终板、髓核和纤维环的形态，采用美国骨科研究学会的兔模型椎间盘组织切片评分系统[18]，评估椎间盘退变程度(表1)。
1.4.6 免疫组化染色检测软骨终板、髓核Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、基质金属蛋白酶13表达切片常规脱蜡复水后。室温下滴加体积分数3% H2O2去离子水，孵育7 min，胃蛋白酶抗原修复液进行抗原修复(37 ℃ 30 min)；5%

BSA封闭液孵育(37 ℃ 30 min)；分别加入Ⅱ型胶原抗体(1∶400)、蛋白聚糖抗体(1∶400)和基质金属蛋白酶13抗体(1∶400)，4 ℃下孵育过夜；加入相应二抗(37 ℃ 30 min)；在室温下用DAB显色剂孵育约6 min后，苏木精染色1 min，分化液分化15 s，反蓝6 min后，二甲苯透明，中性树胶封固。显微镜观察后，采用Image J软件计算阳性区域的积分吸光度(A)值。
1.5 主要观察指标 ①MRI观察椎间盘退变情况；②L7/S1椎间盘软骨终板、髓核、纤维环形态并评分；③L7/S1椎间盘髓核、软骨终板Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、基质金属蛋白酶13的表达。
1.6 统计学分析实验数据使用SPSS 24.0软件进行处理、分析。计量资料以x±s表示，多组之间比较采用ANOVA检验，不符合正态布的数据，则采用非参数秩和检验(Kruskal-Wallis检验)。假设检验水准均取α=0.05，即P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经福建中医药大学统计学专家审核。

讨论

《素问·痿论》中所述“宗筋主束骨而利关节”。“筋”维持腰椎活动稳定，“束骨”以维持骨关节正常连接，为椎体运动提供了桥梁，控制椎体在正常范围内活动，起到了“利关节”的作用。因此，筋骨平衡是腰椎稳定的前提[19] 。姿势不正、劳逸失度等原因导致腰椎肌肉、韧带等积劳成伤，形成粘连、结节、条索等病理性损害，破坏了椎体筋骨之间的动态平衡，引起腰椎病变。针刀以针的理念刺入人体，在人体内又能发挥刀的治疗作用[20]，可对肌肉、韧带的粘连、瘢痕进行松解，调整机体力学状态，恢复“动态平衡”，从而“行血气而营阴阳，濡筋骨，利关节”[21]。
椎间孔内口是脊神经进入椎间孔的入口，由椎上切迹与椎下切迹构成上下壁，椎体后缘、椎间盘构成前壁，黄韧带、关节突关节构成后壁。临床应用针刀松解椎间孔内口后壁黄韧带后，腰椎间盘突出症患者的疼痛程度、腰部及下肢症状明显减轻，同时腰椎功能得到了改善[3，22-24]。但目前针刀松解椎间孔内口对腰椎间盘退变的具体作用及机制尚未明确。由于椎间孔内口的解剖特点，针刀松解时存在对硬脊膜、神经根等造成损伤的可能性。超声可实时动态获取肌肉、韧带等组织的影像，在超声引导下进行针刀松解时，可实时检测针刀的进针深度及轨迹，提高靶点治疗的精准性和安全性，有利于针刀松解操作模块化、可重复性[25]。在实验过程中发现，超声图像上可以清晰地看到针刀在关节突关节内下缘接触到黄韧带时，黄韧带出现一定的形变，此时术者手下稍用力，在出现落空感的同时，超声实时观察到了针刀突破黄韧带的影像，两者相互印证，可保证准确松解椎间孔内口后壁处黄韧带，有效避免进针部位不一致、损伤过多的黄韧带，刺激黄韧带增生肥厚[26]，同时避免进针深度过大，增加损伤硬脊膜、神经根的风险。此次实验中针刀组未出现脑脊液漏、触发神经反射等表现，体现了超声引导对保证针刀松解椎间孔内口安全的必要性。
小鼠、大鼠软骨终板直接与生长板相邻，中间存在极小的次级骨化中心，而兔软骨终板则与骨性终板相邻，与人类似[27-28]。故采用兔建立椎间盘退变模型，可更好地模拟人椎间盘退变的过程。与体内植入固定装置外接加压装置[29]、针刺破坏纤维环等造模方式相比较[30]，此次实验造模方法通过切断兔腰椎干预节段以外的棘上、棘间韧带后保持兔间歇性站立对椎间盘施加间歇性轴向载荷[12]，针刀干预节段结构未被人为损伤或压迫，因此使用该模型更适合用于探讨超声引导下针刀松解椎间孔内口对腰椎间盘退变的影响。MRI检查结果显示，此次实验模型组兔L7/S1椎间盘髓核亮度下降，纤维环超出了椎体边缘，相对灰度值明显低于对照组，模型组兔椎间盘退变明显。针刀干预后，髓核灰度值较模型组、假针刀升高，说明针刀松解兔椎间孔内口对于退变的椎间盘起到了改善的作用。
软骨终板主要由软骨细胞及其合成分泌的Ⅱ型胶原、蛋白聚糖及少量的基质金属蛋白酶等共同构成的半固体状态凝胶状的细胞外基质组成。软骨终板基质作为一层渗透屏障，可以作为营养物质向椎间盘传递的通道，其结构的完整性有利于椎间盘组织的营养、代谢物质的交换[31]。同时蛋白聚糖和Ⅱ型胶原又能形成稳定结构，可以在承受髓核静水压和椎骨压力的同时，连接纤维环对抗椎体间产生的剪切力和拉伸力[32-33]。当软骨细胞受到异常机械加载等刺激后，软骨基质合成和分解失衡，导致其渗透率降低，髓核营养代谢障碍，椎间盘退变。韩涛等[34]将离体的兔L1/2、L3/4、L5/6完整运动节段放入培养装置中进行轴向静态加压发现软骨终板中的细胞数量、蛋白聚糖和Ⅱ型胶原随着加载培养时间增加而减少。ZHENG等[35] 采用外部加压装置对兔L4/5椎间盘实施间歇性轴向加压8周后，发现髓核脱水，软骨终板表面出现缺损，软骨细胞外基质减少。此次实验通过苏木精-伊红染色、番红O固绿染色对L7/S1软骨终板、髓核、纤维环形态学变化进行观察发现，模型组软骨终板与对照组比较明显变薄，与骨性终板交界处出现不规则钙化区，在血管与软骨终板基质间形成了阻隔带，意味着该区域的椎间盘营养代谢通路受阻，很可能是导致模型组中髓核细胞数量减少、椎间盘退变的主要原因[14]；而针刀组软骨终板厚度明显高于模型组，细胞排列分层清晰，与骨性终板交界处只存在部分区域钙化，使得软骨终板介导髓核与毛细血管的营养物质交换功能得以持续，从而改善椎间盘的退变。
基质金属蛋白酶是一大类具有广泛的底物特异性的含有锌离子结合催化结构域的蛋白水解酶。基质金属蛋白酶13作为其家族成员之一，能优先降解Ⅱ型胶原，同时酶解其他基质分子[36]。HUANG等[37] 对人软骨细胞施加频率为1 Hz拉伸量为10%的循环张力，24 h后发现软骨细胞上整合素α5β1表达显著升高，Ⅱ型胶原表达明显降低，而细胞外基质分解代谢因子基质金属蛋白酶13表达增加。此次研究结果显示模型组软骨终板基质金属蛋白酶13表达较对照组明显增加，Ⅱ型胶原、蛋白聚糖表达明显降低，而针刀干预后软骨终板基质金属蛋白酶13表达明显下调，Ⅱ型胶原、蛋白聚糖表达增高，进一步印证了间歇性轴向压力能够促进软骨终板中基质金属蛋白酶13表达引起软骨细胞外基质降解，而针刀松解椎间盘退变兔的L7/S1椎间孔内口可抑制软骨终板中基质金属蛋白酶13表达，缓解细胞外基质的异常降解，调节其稳态平衡，从而改善软骨终板退变。此次实验还检测了髓核Ⅱ型胶原、蛋白聚糖及基质金属蛋白酶13的表达，发现模型组Ⅱ型胶原、蛋白聚糖表达较对照组明显减少，而基质金属蛋白酶13表达增高；针刀组Ⅱ型胶原、蛋白聚糖表达则较模型组、假针刀组明显增高，基质金属蛋白酶13表达较低，表明髓核退变与软骨终板退变高度相关。
综上所述，针刀松解兔L7/S1右侧椎间孔内口处黄韧带30 d后，软骨终板基质稳态得到了改善，从而有助于缓解椎间盘退变。结合课题组前期研究结果[11-12]，针刀松解兔L7/S1右侧椎间孔内口处黄韧带短期内可改善椎间盘退变，对腰椎稳定性无明显影响，但其长期影响尚待进一步研究探讨。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

超声引导针刀松解椎间孔内口对兔软骨终板基质稳态的影响

Effect of ultrasound-guided needle-knife on matrix homeostasis of rabbit cartilaginous endplate

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