脱细胞软骨细胞外基质匀浆联合氧化苦参碱治疗大鼠骨关节炎

doi:10.12307/2025.042

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (13): 2675-2682.doi: 10.12307/2025.042

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

脱细胞软骨细胞外基质匀浆联合氧化苦参碱治疗大鼠骨关节炎

吴富章1，张鹏礼1，章振华1，何永兵1，孙和炎2

1武警安徽省总队医院骨科，安徽省合肥市 230041；2安徽医科大学第一附属医院骨科，安徽省合肥市 230001

收稿日期:2023-12-05 接受日期:2024-03-08 出版日期:2025-05-08 发布日期:2024-09-11
作者简介:吴富章，男，1972年生，安徽省合肥市人，硕士，副主任医师，主要从事修复重建、关节外科方面的研究。
基金资助:
安徽省 “十三五”医疗卫生重点专科建设项目(皖卫科教秘[2021]230号)，项目负责人：吴富章；安徽省自然科学基金项目计划(2008085MH291)，项目负责人：孙和炎

Acellular cartilage extracellular matrix homogenate combined with oxymatrine on treatment of osteoarthritis in rats

Wu Fuzhang1, Zhang Pengli1, Zhang Zhenhua1, He Yongbing1, Sun Heyan2

1Department of Orthopedics, Anhui Provincial Corps Hospital of Chinese Peoples Armed Police Force, Hefei 230041, Anhui Province, China; 2Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230001, Anhui Province, China

Received:2023-12-05 Accepted:2024-03-08 Online:2025-05-08 Published:2024-09-11
About author:Wu Fuzhang, Master, Associate chief physician, Department of Orthopedics, Anhui Provincial Corps Hospital of Chinese Peoples Armed Police Force, Hefei 230041, Anhui Province, China
Supported by:
Anhui Province Key Medical and Health Specialty Construction Project during the “13th Five-Year” Plan Period, No. [2021]230 (to WFZ); Natural Science Foundation of Anhui Province, No. 2008085MH291 (to SHY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

脱细胞软骨细胞外基质：是一种去除了细胞成分的天然生物材料，保留的相关软骨基质成分可为软骨再生提供良好的微环境，促进软骨基质的分泌与软骨形成，已被广泛用于软骨再生研究中。研究已证实，脱细胞软骨细胞外基质治疗骨关节炎具有一定的效果。
骨关节炎：是一种慢性退行性和致残性疾病，主要涉及关节软骨、滑膜、肌腱、韧带及关节周围肌肉等结构的改变，临床上表现为渐进发展的关节疼痛、肿胀、活动受限和关节畸形等。骨关节炎的发病机制极其复杂，衰老、肥胖、创伤、炎症、氧化应激等因素均可诱发骨关节炎，目前主要通过对症治疗(如镇痛消炎、补充关节营养等)来缓解相关症状，尚无根治方法。

摘要
背景：脱细胞软骨细胞外基质治疗骨关节炎具有一定的效果，但其单独应用时的治疗效果有限。氧化苦参碱可缓解白细胞介素1β诱导的软骨细胞凋亡和细胞外基质降解。
目的：观察不同剂量氧化苦参碱与脱细胞软骨细胞外基质联合膝关节腔注射对大鼠骨关节炎的治疗作用。
方法：获取SD大鼠股骨软骨，采用物理、化学与酶相结合的方法制备脱细胞软骨细胞外基质。取50只SD大鼠，利用随机数字表法分为假手术组、骨关节炎组、单纯材料组、低剂量药物组、高剂量药物组，每组10只，后4组采用改良Hulth法建立大鼠骨关节炎模型。造模成功后，单纯材料组大鼠膝关节腔注射脱细胞软骨细胞外基质匀浆，低剂量药物组、高剂量药物组膝关节腔分别注射含50，100 µg氧化苦参碱的脱细胞软骨细胞外基质匀浆。注射4周后取材进行相关检测。
结果与结论：①与假手术组比较，骨关节炎组关节腔积液中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子ɑ、丙二醛水平升高(P < 0.05)，超氧化物歧化酶水平降低(P < 0.05)；与骨关节炎组比较，低剂量药物组、高剂量药物组关节腔积液中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子ɑ、丙二醛水平降低(P < 0.05)，超氧化物歧化酶水平升高(P < 0.05)，其中高剂量药物组变化更显著。②Tunel染色显示，与假手术组相比，骨关节炎组凋亡软骨细胞增多；与骨关节炎组相比，单纯材料组、低剂量药物组、高剂量药物组凋亡软骨细胞减少，其中高剂量药物组减少更显著。③苏木精-伊红与免疫组化染色显示，骨关节炎组大鼠膝关节软骨严重退变，软骨组织中Ⅱ型胶原表达降低(P < 0.05)、基质金属蛋白酶9表达升高(P < 0.05)；与骨关节炎组相比，单纯材料组、低剂量药物组、高剂量药物组大鼠膝关节软骨退变明显改善，软骨组织中Ⅱ型胶原表达升高(P < 0.05)、基质金属蛋白酶9表达降低(P < 0.05)，其中高剂量药物组改善最显著。④Western blot检测显示，与假手术组相比，骨关节炎组软骨组织中Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白表达降低(P < 0.05)，Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Bax蛋白表达升高(P < 0.05)；与骨关节炎组相比，低剂量药物组、高剂量药物组Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白表达升高(P < 0.05)，Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Bax蛋白表达降低(P < 0.05)，其中高剂量药物组改善更显著。⑤结果表明，膝关节腔内联合注射脱细胞软骨细胞外基质与氧化苦参碱可通过促进细胞外基质的合成、抑制炎症与氧化应激反应、抑制软骨细胞凋亡发挥骨关节炎治疗作用，该治疗作用可能与激活Nrf2/HO-1通路有关。

https://orcid.org/0009-0006-9748-3812 (吴富章)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 骨关节炎, 脱细胞软骨细胞外基质, 氧化苦参碱, 软骨细胞, 细胞外基质

Abstract: BACKGROUND: Acellular cartilage extracellular matrix is effective in the treatment of osteoarthritis, but its efficacy is limited when applied alone. Oxymatrine alleviates interleukin-1β-induced chondrocyte apoptosis and extracellular matrix degradation.
OBJECTIVE: To observe the effect of different doses of oxymatrine combined with acellular cartilage extracellular matrix injection in knee cavity on osteoarthritis in rats.
METHODS: The femoral cartilage of SD rats was obtained. The acellular cartilage extracellular matrix was prepared by physical, chemical and enzyme methods. Fifty SD rats were selected and divided into sham operation group, osteoarthritis group, simple material group, low-dose drug group, and high-dose drug group by random number table method, with 10 rats in each group. The latter four groups were treated with modified Hulth method to establish the rat model of osteoarthritis. After successful modeling, acellular cartilage extracellular matrix homogenate was injected into the knee cavity of rats in the simple material group. Acellular cartilage extracellular matrix homogenate containing 50, 100 µg oxymatrine was injected into the knee cavity of rats in the low-dose drug group and the high-dose drug group, respectively. Samples were taken 4 weeks after injection for relevant detection.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the sham operation group, the concentrations of interleukin 1β, tumor necrosis factor ɑ, and malondialdehyde in the joint effusion were increased (P < 0.05), and the concentration of superoxide dismutase in the joint effusion was decreased (P < 0.05) in the osteoarthritis group. Compared with osteoarthritis group, the levels of interleukin 1β, tumor necrosis factor ɑ, and malondialdehyde in joint effusion were decreased (P < 0.05), while the level of superoxide dismutase was increased (P < 0.05) in the low-dose drug group and high-dose drug group, and the changes were more significant in high-dose drug group. (2) TUNEL staining showed that compared with sham operation group, apoptotic chondrocytes increased in osteoarthritis group. Compared with the osteoarthritis group, the apoptotic chondrocytes decreased in the simple material group, the low-dose drug group, and the high-dose drug group, and the decrease was more significant in the high-dose drug group. (3) Hematoxylin-eosin staining and immunohistochemical staining showed that the knee cartilage was seriously degraded, the expression of type II collagen was decreased (P < 0.05), and the expression of matrix metalloproteinase-9 was increased (P < 0.05) in the osteoarthritis group. Compared with the osteoarthritis group, the knee cartilage degeneration of rats in the simple material group, the low-dose drug group, and the high-dose drug group was significantly improved; the expression of type II collagen was increased (P < 0.05) and the expression of matrix metalloproteinase 9 was decreased (P < 0.05), and the improvement was most significant in the high-dose drug group. (4) Western blot assay showed that compared with sham operation group, the expression of Nrf2, HO-1, and Bcl-2 protein in cartilage tissue decreased (P < 0.05); expression levels of Cleaved-caspase-3, Cleaved-caspase-9, and Bax were increased (P < 0.05) in the osteoarthritis group. Compared with the osteoarthritis group, the protein expression levels of Nrf2, HO-1, and Bcl-2 were increased (P < 0.05), and the protein expressions of Cleaved-caspase-3, Cleaved-caspase-9, and Bax were decreased (P < 0.05) in the low-dose and high-dose drug groups. The improvement was more significant in the high-dose drug group. (5) In conclusion, intracavicular injection of acellular cartilage extracellular matrix and oxymatrine can promote the synthesis of extracellular matrix, inhibit inflammation and oxidative stress, and suppress chondrocyte apoptosis, and play a therapeutic role in osteoarthritis, which may be related to the activation of Nrf2/HO-1 pathway.

Key words: osteoarthritis, acellular cartilage extracellular matrix, oxymatrine, chondrocyte, extracellular matrix

中图分类号:

吴富章, 张鹏礼, 章振华, 何永兵, 孙和炎. 脱细胞软骨细胞外基质匀浆联合氧化苦参碱治疗大鼠骨关节炎[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(13): 2675-2682.

Wu Fuzhang, Zhang Pengli, Zhang Zhenhua, He Yongbing, Sun Heyan. Acellular cartilage extracellular matrix homogenate combined with oxymatrine on treatment of osteoarthritis in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(13): 2675-2682.

图/表（结果） 10

2.1 脱细胞软骨细胞外基质的脱细胞结果 苏木精-伊红染色显示，脱细胞处理前的软骨细胞位于软骨陷窝内，而脱细胞处理后的软骨陷窝内已见不到软骨细胞，证实脱细胞软骨细胞外基质完全；番红O固绿染色与甲苯胺蓝染色显示，脱细胞处理后的软骨组织被染成蓝紫色，与脱细胞处理前的软骨组织染色强度相似，证实脱细胞软骨细胞外基质内仍然含有大量的糖胺多糖成分，见图1。
软骨基质生化成分定量检测结果显示，脱细胞处理后软骨基质的DNA含量显著低于脱细胞处理前的软骨基质(P < 0.05)，脱细胞处理后软骨基质的糖胺多糖及胶原含量较脱细胞处理前稍微降低，但差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1。

2.2 实验动物数量分析 术后无大鼠死亡，未出现膝关节感染、伤口感染与皮肤坏死等情况。骨关节炎造模大鼠造模后膝关节肿胀、活动受限与跛行等。50只大鼠全部进入结果分析。
2.3 各组大鼠关节软骨病理形态变化 苏木精-伊红染色显示，假手术组大鼠膝关节表面软骨组织结构完整，软骨细胞大小及形态正常，各层次排列整齐且分布均匀；骨关节炎组大鼠膝关节出现严重退变，关节表面软骨结构遭到完全破坏，出现裂隙且深达软骨下骨，软骨细胞大小及形态异常，细胞萎缩、排列紊乱且无层次，软骨细胞数量显著减少；单纯材料组大鼠膝关节软骨存在退变表现，但病变未累及软骨下骨，软骨细胞形态较正常，软骨细胞数量较骨关节炎组增多；低剂量药物组、高剂量药物组大鼠膝关节软骨退变程度较轻，软骨细胞形态正常，软骨细胞数量较单纯材料组增多，其中高剂量药物组改善效果更明显，见图2。
免疫组化染色显示，假手术组大鼠关节软骨组织中Ⅱ型胶原呈强阳性表达，基质金属蛋白酶9呈弱阳性表达；与假手术组相比，骨关节炎组大鼠关节软骨组织中Ⅱ型胶原阳性表达显著减弱，基质金属蛋白酶9阳性表达显著增强；与骨关节炎组相比，单纯材料组大鼠关节软骨组织中Ⅱ型胶原阳性表达增强，基质金属蛋白酶9阳性表达减弱；与单纯材料组相比，低剂量药物组、高剂量药物组大鼠关节软骨组织中Ⅱ型胶原阳性表达进一步增强，基质金属蛋白酶9阳性表达进一步减弱；相较于低剂量药物组，高剂量药物组大鼠关节软骨组织中Ⅱ型胶原阳性表达增强，基质金属蛋白酶9阳性表达减弱，见图3，4。5组大鼠关节软骨组织中Ⅱ型胶原与基质金属蛋白酶9表达灰度值，见表2。

2.4 各组大鼠关节软骨组织病理评分 假手术组大鼠关节软骨组织OARSI评分为0，骨关节炎组、单纯材料组、低剂量药物组、高剂量药物组大鼠关节软骨组织OARSI评分分别为17.94±1.23，12.09±1.18，9.32±0.17，5.67±0.15，5组OARSI评分比较差异有显著性意义(P < 0.05)，组间两两比较差异有显著性意义(P < 0.05)。
2.5 各组大鼠关节软骨细胞凋亡 Tunel染色结果显示，假手术组仅见少量的凋亡软骨细胞，与假手术组相比，骨关节炎组凋亡的软骨细胞显著增加多；与骨关节炎组相比，单纯材料组、低剂量药物组、高剂量药物组凋亡的软骨细胞显著减少，见图5。
Image J软件定量分析结果显示，假手术组、骨关节炎组、单纯材料组、低剂量药物组、高剂量药物组软骨细胞凋亡率依次为(6.23±0.38)%，(38.06±3.28)%，(28.17±3.07)%，(18.78±2.69)%，(11.74±1.87)%，骨关节炎组与假手术组、骨关节炎组与单纯材料组、单纯材料组与低剂量药物组、低剂量药物组与高剂量药物组软骨细胞凋亡率比较差异均有显著性意义(P < 0.05)。

2.6 各组大鼠关节腔积液中炎症因子与应激指标变化 与假手术组比较，骨关节炎组大鼠关节腔积液中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子ɑ、丙二醛水平升高(P < 0.05)，超氧化物歧化酶水平显著降低(P < 0.05)；与骨关节炎组比较，单纯材料组大鼠关节腔积液中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子ɑ、丙二醛、超氧化物歧化酶水平均无明显变化(P > 0.05)；与骨关节炎组比较，低剂量药物组、高剂量药物组大鼠关节腔积液中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子ɑ、丙二醛的质量浓度降低(P < 0.05)，超氧化物歧化酶含量升高(P < 0.05)；与低剂量药物组比较，高剂量药物组大鼠关节腔积液中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、丙二醛的质量浓度降低，超氧化物歧化酶含量升高(P < 0.05)，见表3。

2.7 各组大鼠关节软骨组织中Nrf2/HO-1通路蛋白与凋亡蛋白表达 Western blot检测显示，与假手术组比较，骨关节炎组大鼠关节软骨组织中Nrf2、HO-1蛋白表达下降(P < 0.05)；与骨关节炎组比较，单纯材料组大鼠关节软骨组织中Nrf2、HO-1蛋白表达无明显变(P > 0.05)；与骨关节炎组比较，低剂量药物组、高剂量药物组大鼠关节软骨组织中Nrf2、HO-1蛋白表达升高(P < 0.05)；与低剂量药物组比较，高剂量药物组大鼠关节软骨组织中Nrf2、HO-1蛋白表达升高(P < 0.05)；5组大鼠关节软骨组织中NQO1蛋白表达比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图6，表4。

与假手术组比较，骨关节炎组大鼠关节软骨组织中Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Bax蛋白表达升高(P < 0.05)，Bcl-2的蛋白表达降低(P < 0.05)；与骨关节炎组比较，单纯材料组大鼠关节软骨组织中Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Bax蛋白表达降低(P < 0.05)，Bcl-2蛋白表达升高(P < 0.05)；与单纯材料组比较，低剂量药物组、高剂量药物组大鼠关节软骨组织中Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Bax蛋白表达降低(P < 0.05)，Bcl-2蛋白表达升高(P < 0.05)；与低剂量药物组比较，高剂量药物组大鼠关节软骨组织中Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Bax蛋白表达降低(P < 0.05)，Bcl-2蛋白表达升高(P < 0.05)，见图7，表5。

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引言

骨关节炎为较常见的关节炎类型之一，是一种慢性退行性和致残性疾病，主要涉及关节软骨、滑膜、肌腱、韧带及关节周围肌肉等结构的改变，临床上表现为渐进发展的关节疼痛、肿胀、活动受限和关节畸形等[1-2]。骨关节炎的发病机制极其复杂，衰老、肥胖、创伤、炎症、氧化应激等因素均可诱发骨关节炎，目前主要通过对症治疗(如镇痛消炎、补充关节营养等)来缓解相关症状[3-5]，
尚无根治方法。因此，医学科研者一直致力于寻找针对骨关节炎更加安全有效的治疗方法。
脱细胞软骨细胞外基质是一种去除了细胞成分的天然生物材料，保留的相关软骨基质成分可为软骨再生提供良好的微环境，促进软骨基质的分泌与软骨形成，已被广泛用于软骨再生研究中[6-8]。并且研究已证实，脱细胞软骨细胞外基质治疗骨关节炎具有一定的效果[9-10]，但其单独应用时的治疗效果有限。氧化苦参碱是从苦参中提取的的四环喹嗪啶类化合物，具有抗氧化应激、抗炎、抗纤维化、抗细胞凋亡等多种药理活性[11-12]。氧化苦参碱可通过抑制免疫炎症因子分泌和改善氧化应激状态对大鼠冠状动脉结扎诱发的实验性急性心肌梗死发挥保护作用，可通过抑制心肌细胞焦亡、提升心肌细胞活力来改善脂多糖诱导的心肌损伤[13]；此外，氧化苦参碱还可缓解白细胞介素1β诱导的软骨细胞凋亡和细胞外基质降解[14]。
以上研究表明，氧化苦参碱可作为治疗骨关节炎的潜在药物。因此，此次实验将氧化苦参碱与脱细胞软骨细胞外基质复合物联合注射于骨关节炎大鼠膝关节腔内，观察治疗作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。
1.2 时间及地点 实验于2022年10月至2023年3月在安徽医科大学第一附属医院中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 雄性SD大鼠60只，8-10周龄，SPF级，体质量280-300 g，购自安徽医科大学动物实验中心，使用许可证号：SYXK(皖)2022-004。其中5只用于制备脱细胞软骨细胞外基质，剩余55只用于大鼠膝骨关节炎模型实验中。大鼠分笼饲养(5只/笼)，自由摄食、饮水，饲养环境温度(23±1)℃、相对湿度55%、12 h光明/12 h黑暗循环。实验方案已经通过安徽医科大学第一附属医院伦理委员会批准(批准编号：202203789)。
1.3.2 试剂与仪器 氧化苦参碱(98%)购自购自陕西昊辰生物科技有限公司；dsDNA HS Quet试剂盒、HYP测试盒测量、二甲基亚甲蓝试剂盒、Tunel染色试剂盒购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司；Tris-HCl低渗溶液、离子去污剂、抑肽酶、核酸酶溶液购自北京雷根生物技术有限公司；Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶9抗体购自上海研生实业有限公司；核因子E2相关因子2(NF-E2-related factor 2，Nrf2)、血红素加氧酶1(heme oxygenase 1，HO-1)、非竞争性氧化还原酶1(non-Q-dependent Reductase，NQO1)抗体及Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Bcl-2、Bax抗体购自武汉博欧特生物科技有限公司；白细胞介素1β、肿瘤坏死因子ɑ、丙二醛及超氧化物歧化酶检测试剂盒购自购自北京盒子生工科技有限公司；高速离心机(JDR1701，广州吉迪仪器有限公司)。
1.4 方法
1.4.1 制备脱细胞软骨细胞外基质 取SD大鼠5只，腹腔注射3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后获取膝关节，解剖膝关节，利用刀片从股骨侧关节表面切下软骨片，所有操作在冰块上进行；用PBS洗涤软骨片3遍，随后置于-40 ℃环境中冷冻12 h，20-25 ℃下解冻3 h，冷冻-解冻过程重复2次。将软骨片投入10 mmol/L Tris-HCl低渗溶液中，置于-40 ℃环境中冷冻12 h，20-25 ℃下解冻3 h，冷冻-解冻过程重复2次。将含有软骨片的10 mmol/L Tris-HCl低渗溶液置于摇床上(45 ℃，150 r/min)持续振荡24 h；将软骨片置入离子去污剂中于摇床上持续振荡24 h，低渗溶液-离子去污剂过程重复3次。将软骨片用PBS洗涤3次，投入含10 kIU/mL抑肽酶的PBS中，置于摇床上持续振荡24 h。将软骨片投入核酸酶溶液中37 ℃消化3 h，转移至含10 kIU/mL抑肽酶的PBS中(45 ℃)洗脱24 h，置于含0.1%Triton X-100的PBS中(45 ℃)洗脱24 h，随后进入PBS中(45 ℃)洗涤24 h[15]。将制备的脱细胞软骨细胞外基质置于紫外线下消毒。
将消毒后的脱细胞软骨细胞外基质置于液氮中3 min，然后迅速转移至研磨仪中进行研磨(70 Hz，3 min)，反复重复上述操作，直至软骨片被研磨成颗粒状。利用生理盐水将脱细胞软骨细胞外基质颗粒配制成400 g/L的匀浆备用[16]。
1.4.2 评估软骨脱细胞效率 ①组织学分析：将未脱细胞与脱细胞的软骨片分别置于40 g/L多聚甲醛中固定24 h，置入EDTA脱钙液进行脱钙处理，石蜡包埋，5 µm切片，分别进行苏木精-伊红染色、番红O固绿染色与甲苯胺蓝染色。②软骨基质生化成分定量检测：将未脱细胞与脱细胞的软骨片冷冻干燥至恒质量，加入木瓜蛋白酶溶液
(60 ℃)水浴12 h，10 000×g离心30 min使溶液澄清，保存在-80 ℃冰箱备用。采用二甲基亚甲蓝法测量糖胺多糖含量，采用HYP测试盒测量胶原含量，采用dsDNA HS Quet试剂盒测量DNA含量。
1.4.3 建立大鼠骨关节炎模型 取45只SD大鼠，采用改良Hulth法建立骨关节炎大鼠模型。大鼠称质量后腹腔注射3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉，选择右侧膝关节剃毛，切开皮肤，完全暴露关节囊，在髌韧带与内侧副韧带之间纵行切开关节囊，以完全暴露内侧副韧带，切断内侧副韧带、摘除内侧半月板、切断前交叉韧带，通过轴移实验确认韧带完全切断。用含抗生素的生理盐水冲洗关节囊，逐层缝合。术后连续3 d肌肉注射青霉素20×104 U/d。术后密切观察伤口情况以及大鼠精神状态等。造模6周后，随机选取5只大鼠麻醉后处死，通过膝关节苏木精-伊红染色图片观察到关节面与胫骨平台出现较明显的磨损，提示造模成功。
将造模成功的40只大鼠采用随机数字表法分成4组，骨关节炎组、单纯材料组、低剂量药物组、高剂量药物组，每组10只。取剩余的10只大鼠作为假手术组，采用同样方式打开关节囊后直接缝合，不进行骨关节炎造模。
1.4.4 造模后分组治疗方法 造模6周后，骨关节炎组大鼠右侧膝关节腔内注射生理盐水50 µL，单纯材料组大鼠右侧膝关节腔内注射脱细胞软骨细胞外基质匀浆50 µL，低剂量药物组大鼠右侧膝关节腔内注射含50 µg氧化苦参碱的脱细胞软骨细胞外基质匀浆50 µL(将氧化苦参碱直接加入脱细胞软骨基质匀浆中)，高剂量药物组大鼠右侧膝关节腔内注射含100 µg氧化苦参碱的脱细胞软骨细胞外基质匀浆50 µL。治疗4周后，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后收集关节腔积液，然后处死大鼠，取出膝关节软骨，部分置于-80 ℃冰箱中保存，部分置于40 g/L多聚甲醛中固定8 h。
1.5 主要观察指标
1.5.1 关节软骨病理形态变化 样本置于40 g/L多聚甲醛中固定8 h后，置入EDTA脱钙液中脱钙4周，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片，进行苏木精-伊红染色与免疫组化染色(Ⅱ型胶原与基质金属蛋白酶9)。免疫组化染色步骤如下：切片脱蜡、水洗，进行抗原修复，柠檬酸钠修复液沸腾后室温冷却，用蒸馏水清洗3次，牛血清白蛋白封闭后滴加一抗4 ℃孵育过夜；孵育二抗、显色、复染，脱水、封固。
1.5.2 关节软骨组织病理评分 根据关节软骨病理形态变化，采用国际骨关节炎研究协会(Osteoarthritis Research Society International，OARSI)评分评估软骨退变[17-18]，从基质染色、软骨组织结构、软骨细胞簇集与潮线完整性4个方面进行评分，评分范围0-24分，得分越高说明骨关节炎越严重。
1.5.3 Tunel染色检测软骨细胞凋亡 取关节软骨石蜡切片，进行脱蜡与梯度乙醇水化，轻轻甩干切片后滴加蛋白酶K工作液，置于37 ℃温箱中孵育20 min；用PBS清洗切片3次，滴加0.1%Tritin室温孵育20 min；用PBS清洗切片3次，滴加Tnuel试剂盒中Buffer溶液室温孵育10 min，滴加Tunel反应液37 ℃孵育2 h；用PBS清洗切片3次，滴加DAPI染色液避光室温孵育10 min；用PBS清洗切片3次，滴加抗荧光淬灭封片剂，置于荧光显微镜下观察。利用Image J软件定量分析凋亡细胞数量，计算细胞凋亡率。
1.5.4 关节腔积液中炎症因子与应激指标变化 收集关节腔积液，置于离心机内2 000 r/min离心10 min，保留上清，利用Elisa法检测白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、丙二醛及超氧化物歧化酶的浓度。参考试剂盒说明书进行相关操作。
1.5.5 关节软骨组织中Nrf2/HO-1通路蛋白与凋亡蛋白的表达 将冻存的软骨组织置于研钵中研磨，加入组织裂解液充分裂解。利用BCA 蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度。取10 μg蛋白样品，进行SDS-PAGE 凝胶电泳，置于冰上进行转膜1 h，取出PVDF 膜并用TBST清洗，置于血清白蛋白中室温振荡孵育2 h，洗膜后加入一抗稀释液(Nrf2、HO-1及NQO1抗体，稀释比例分别为1∶1 000、1∶2 000、1∶10 000；Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Bcl-2、Bax抗体，稀释比例分别为1∶1 500、1∶2 000、1∶10 000、1∶2 500)4 ℃ 孵育过夜，洗膜后加入对应的二抗室温振荡孵育2 h，洗膜后用ECL避光充分显色，然后用凝胶成像仪观察蛋白表达情况。

1.6 统计学分析 利用统计分析软件GraphPad Prism 8.0进行数据统计处理。实验获得的数据以x±s形式表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，以P < 0.05表示差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过安徽医科大学第一附属医院生物统计学专家审核。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

细胞外基质与细胞共同处于一个相同的动态微环境中，二者在力学、生物化学等许多方面存在错综复杂的关系[19-20]：细胞外基质具备的天然三维拓扑结构可改变疾病进程中的细胞行为，影响干细胞的增殖与分化；另外，细胞外基质的组分还作为细胞表面受体(如整合素等)的配体，经由多种类型的细胞表面受体接受并传递细胞外基质中的信号，并在基质和细胞之间产生动态的相互作用，进而调节一系列诸如细胞黏附、凋亡、增殖、迁移和分化等生物学行为，因此细胞外基质还被认为是细胞表型的主要调节因子。软骨由细胞外基质与分散在细胞外基质中的软骨细胞组成。细胞外基质含有胶原蛋白、糖胺聚糖、蛋白聚糖及连接蛋白等多种成分，其在维持软骨生物力学性能、分散关节运动过程中的压力与剪应力、提供弹性支撑方面发挥着重要的作用[21-22]。软骨细胞外基质由软骨细胞合成，通过合成代谢和分解代谢维持软骨环境的稳定，软骨细胞外基质也可以促进软骨的生长[23-24]。当创伤等因素引起软骨细胞损伤时，软骨细胞的合成代谢被破坏，软骨细胞外基质成分减少，软骨组织动态平衡遭到破坏，如此导致损伤逐渐加重。YANG 等[25]的研究证实细胞外基质既是软骨细胞增殖的优良培养底物又是一种生物活性基质，可促进软骨细胞的增殖并保持其活性，适用于体内软骨再生。脱细胞软骨细胞外基质是通过物理、化学和酶等技术去除细胞成分而获得的，在较完全去除细胞成分的基础上保留了大量的糖胺多糖与胶原成分，LU等[26]研究报道猪源性脱细胞软骨细胞外基质支架在异种移植中未发生明显的免疫炎症反应，具有良好的生物相容性，并可促进脂肪间充质干细胞的成软骨分化；LIU等[27]研究显示脱细胞软骨细胞外基质可促进骨髓干细胞的软骨分化，促进兔软骨损伤后的软骨再生。此次实验采用物理、化学、酶相结合的方法制备了脱细胞软骨细胞外基质，在较完全去除细胞成分的基础上保留了大量的糖胺多糖与胶原等成分，为软骨损伤修复提供了良好的物质支持。
软骨损伤是骨关节炎的主要病理特征，由于软骨中没有提供营养物质的血管，其营养获取只能经由滑膜渗透吸收，因此病理条件下的软骨修复能力非常有限；软骨损伤主要包括软骨细胞外基质的异常代谢和软骨细胞的异常代谢、纤维化和凋亡。此外，软骨的炎症反应也与软骨细胞外基质密切相关[28-29]：在骨关节炎的病理条件下，受应激、炎症递质等的影响，软骨细胞在NADPH氧化酶作用下产生过量的活性氧，而过量的活性氧通过直接降解软骨细胞外基质组分、抑制软骨细胞外基质合成，发挥促软骨分解的作用，激活基质金属蛋白酶并诱导软骨细胞凋亡。氧化苦参碱具有抗炎、抗肿瘤、抗纤维化、抑制破骨细胞分化等多种生物活性，氧化苦参碱可通过抑制核因子κB信号通路的激活来减少炎症因子的产生，进而缓解炎症反应[30]；可缓解白细胞介素1诱导的软骨细胞软骨细胞凋亡、炎症反应并提升软骨细胞活力[14]，调节关节软骨的合成代谢与分解代谢[31]，发挥抗骨关节炎的作用。Ⅱ型胶原是软骨基质的主要组成部分，而基质金属蛋白酶9可促使软骨基质的降解，导致软骨损伤。细胞凋亡也参与了骨关节炎的发生发展过程，起始蛋白caspase-9诱导并活化下游细胞凋亡执行蛋白 caspase-3，凋亡蛋白 caspase-3 和 caspase-9 被异常激活，使得软骨组织产生大量的 Cleaved-caspase-3和Cleaved-caspase-9，并进一步执行 DNA 裂解及细胞凋亡过程，加重软骨损伤。Bcl-2家族成员的构成比例是细胞凋亡调控的关键因素，Bcl-2和Bcl-x1有抗凋亡作用，Bax、Bad和Bak有促凋亡作用。此次实验结果显示，脱细胞软骨细胞外基质匀浆膝关节腔内注射后可调节骨关节炎大鼠软骨组织的合成代谢与分解代谢、减少软骨细胞的凋亡，促进软骨损伤的修复，获得了与以往研究一致的结论[9-10]，但是未发现其具有抗炎、抗氧化应激作用。在脱细胞软骨细胞外基质匀浆的基础上增加氧化苦参碱后，氧化苦参碱发挥了强大的抗炎、抗氧化应激作用，并进一步提升了调节软骨组织的合成代谢与分解代谢、减少了软骨细胞的凋亡，使得抗骨关节炎作用更加显著，并且具有一定的剂量依赖性，提示氧化苦参碱在骨关节炎临床治疗中具有潜在的引用前景。
Nrf2/HO-1通路是目前发现的最为重要的内源性抗氧化应激通路之一，其在骨关节炎软骨保护中也具有重要的作用[32-33]。Nrf2是有效的抗氧化与抗炎因子，在生理状态下以非活性状态与Keap1相结合，当与Keap1分离后Nrf2发生核转位并进一步促进HO-1、NQO1等下游抗氧化基因的转录激活，进而发挥抗氧化应激作用[34-36]。因此，激活Nrf2/HO-1通路可有效抑制氧化应激反应。此次实验结果已证实氧化苦参碱具有抗炎与抗氧化应激作用，因此进一步分析了该作用是否与Nrf2/HO-1通路有关，实验结果显示骨关节炎组软骨组织中Nrf2、HO-1蛋白显著降低，提示抗氧化能力显著降低；氧化苦参碱可提升Nrf2、HO-1蛋白的表达，提示氧化苦参碱可能通过激活Nrf2/HO-1通路发挥抗氧化应激作用。
综合以上实验结果可得，膝关节腔内联合注射脱细胞软骨细胞外基质与氧化苦参碱可促进细胞外基质的合成、抑制炎症与氧化应激反应、抑制软骨细胞凋亡进而促进关节软骨损伤的修复，在骨关节炎治疗中取得明显的效果，该治疗作用可能与激活Nrf2/HO-1通路有关。但研究还存在许多不足，例如：实验中氧化苦参碱剂量可能并非最适宜剂量，有关氧化苦参碱的最佳治疗剂量还不清楚；实验治疗周期较短，更长期的治疗效果有待进一步观察；还需要增加通路激活剂或抑制剂进一步验证氧化苦参碱的治疗作用是否与Nrf2/HO-1通路有关等。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

脱细胞软骨细胞外基质匀浆联合氧化苦参碱治疗大鼠骨关节炎

Acellular cartilage extracellular matrix homogenate combined with oxymatrine on treatment of osteoarthritis in rats

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