芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞氧化应激损伤的保护作用

doi:10.12307/2025.059

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (13): 2669-2674.doi: 10.12307/2025.059

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 上一篇下一篇

芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞氧化应激损伤的保护作用

李晓峰，赵朵，欧阳钦，庞子翔，李育泉，陈前芬

广西医科大学第二附属医院脊柱骨病科，广西壮族自治区南宁市 530007

收稿日期:2024-01-12 接受日期:2024-04-13 出版日期:2025-05-08 发布日期:2024-09-11
通讯作者: 陈前芬，博士，主任医师，广西医科大学第二附属医院脊柱骨病科，广西壮族自治区南宁市 530007
作者简介:李晓峰，男，1974年生，湖北省黄石市人，汉族，2011年广西医科大学毕业，博士，副主任医师，主要从事脊柱骨病研究。
基金资助:
广西自然科学基金区域高发疾病研究联合专项资助(2024GXNSFAA010029)，项目负责人: 陈前芬；广西自然科学基金区域高发疾病研究联合专项资助(2024GXNSFAA010010)，项目负责人: 李晓峰；广西再生医学重点实验室开放课题(桂再重开202205)，项目负责人：李晓峰；广西自治区卫生健康委自筹经费科研课题(Z-A20230699)，项目负责人：李晓峰

Protective effect of mangiferin on oxidative stress injury in rat bone marrow mesenchymal stem cells

Li Xiaofeng, Zhao Duo, Ouyang Qin, Pang Zixiang, Li Yuquan, Chen Qianfen

Department of Spine and Osteopathy Surgery, Second Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530007, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2024-01-12 Accepted:2024-04-13 Online:2025-05-08 Published:2024-09-11
Contact: Chen Qianfen, PhD, Chief physician, Department of Spine and Osteopathy Surgery, Second Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530007, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Li Xiaofeng, PhD, Associate chief physician, Department of Spine and Osteopathy Surgery, Second Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530007, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
Regional High-Incidence Disease Research Joint Special Foundation of Guangxi Natural Science Foundation, No. 2024GXNSFAA010029 (to CQF); Regional High-Incidence Disease Research Joint Special Foundation of Guangxi Natural Science Foundation, No. 2024GXNSFAA010010 (to LXF); Open Project of Guangxi Key Laboratory of Regenerative Medicine, No. 202205 (to LXF); Guangxi Autonomous Region Health Commission Self-Financing Research Project, No. Z-A20230699 (to LXF)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

骨髓间充质干细胞：从骨髓腔获取的多能干细胞，具有多向分化潜能，是组织损伤修复、再生医学和细胞移植治疗的常用种子细胞。
氧化应激：是指体内氧化与抗氧化作用失衡的一种状态，倾向于氧化，导致产生大量氧化中间产物，被认为是发生衰老和疾病的一个重要因素。

摘要
背景：间充质干细胞移植治疗脊髓损伤有一定效果，但仍存在局部氧化应激环境导致移植细胞存活率低、细胞移植效率不佳等问题。
目的：探究芒果苷在氧化应激状态下对骨髓间充质干细胞的保护作用。
方法：取第3代大鼠骨髓间充质干细胞，按浓度梯度0，20，40，80，160 µmol/L加入芒果苷孵育2 h，然后加入含400 µmol/L H2O2的无血清L-DMEM培养基及相应浓度的芒果苷继续培养12 h及24 h，以常规培养的大鼠骨髓间充质干细胞为正常对照组。MTT法检测各组细胞存活情况，按照试剂盒操作方法检测细胞培养液中超氧化物歧化酶、丙二醛及过氧化氢酶水平。
结果与结论：与正常对照组相比，H2O2组细胞的存活能力显著降低(P < 0.01)，超氧化物歧化酶、过氧化氢酶水平显著降低(P < 0.01)，丙二醛水平显著升高(P < 0.01)；与H2O2组相比，芒果苷组细胞的存活能力显著升高(P < 0.01)，超氧化物歧化酶、过氧化氢酶水平显著升高(P < 0.01)，丙二醛水平显著降低(P < 0.01)。芒果苷在20 µmol/L浓度以上表现出浓度依赖性的抗氧化应激保护活性，且在160 µmol/L以下无细胞毒性。结果表明，抗氧化剂芒果苷可增加骨髓间充质干细胞的抗氧化活性，为骨髓间充质干细胞移植提供一种新的预处理策略。

https://orcid.org/0009-0006-7950-3672 (李晓峰)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 骨髓间充质干细胞, 芒果苷, 预处理, 氧化应激, 超氧化物歧化酶, 过氧化氢酶, 丙二醛

Abstract: BACKGROUND: Mesenchymal stem cell transplantation has a certain effect on spinal cord injury, but there are still some problems such as low survival rate and poor efficiency of cell transplantation caused by local oxidative stress environment.
OBJECTIVE: To explore the protective effect of mangiferin on oxidative stress of bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: Rat bone marrow mesenchymal stem cells at passage 3 were added to mangiferin and incubated for 2 hours according to the gradient of concentration (0, 20, 40, 80, and 160 µmol/L). A serum-free medium containing 400 µmol/L H2O2 was added, and a gradient concentration of mangiferin was added again and cultured for 12 and 24 hours. Rat bone marrow mesenchymal stem cells were cultured as normal control group. Cell survival was detected by MTT assay in each group. The superoxide dismutase, malondialdehyde, and catalase in the culture medium were detected in accordance with the instruction of the kit.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with normal control group, cell viability in the H2O2 group was significantly decreased (P < 0.01), and the levels of superoxide dismutase and catalase were significantly decreased (P < 0.01), while the level of malondialdehyde was significantly increased (P < 0.01). Compared with H2O2 group, the survival rate of cells was significantly increased (P < 0.01), and the levels of superoxide dismutase and catalase were significantly increased (P < 0.01), while the level of malondialdehyde was significantly decreased (P < 0.01) in the mangiferin group. Mangiferin showed concentration-dependent antioxidant stress protective activity above 20 µmol/L, and no cytotoxicity below 160 µmol/L. These findings indicate that antioxidant mangiferin can increase the antioxidant activity of bone marrow mesenchymal stem cells and provide a new preconditioning strategy for bone marrow mesenchymal stem cell transplantation.

Key words: bone marrow mesenchymal stem cell, mangiferin, pretreatment, oxidative stress, superoxide dismutase, catalase, malondialdehyde

中图分类号:

李晓峰, 赵朵, 欧阳钦, 庞子翔, 李育泉, 陈前芬. 芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞氧化应激损伤的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(13): 2669-2674.

Li Xiaofeng, Zhao Duo, Ouyang Qin, Pang Zixiang, Li Yuquan, Chen Qianfen. Protective effect of mangiferin on oxidative stress injury in rat bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(13): 2669-2674.

图/表（结果） 1

2.1 大鼠骨髓间充质干细胞的形态及鉴定结果 倒置显微镜下观察，第3代大鼠骨髓间充质干细胞贴壁生长，排列紧密，部分呈漩涡状生长，细胞饱满，见图1A。第3代大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导14 d后进行碱性磷酸酶染色，倒置显微镜下观察部分细胞形态呈多角形，胞膜及胞浆蓝染，染色呈阳性反应，见图1B。第3代大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导14 d后进行茜素红染色，倒置显微镜下观察可见大量红染的矿化结节形成，见图1C。
2.2 H2O2对骨髓间充质干细胞的细胞毒性实验 通过MTT实验证实，H2O2能显著抑制骨髓间充质干细胞的生长，并且随着H2O2浓度的增加，抑制作用显著增强，呈明显的剂量相关性，见图2。与对照组相比，H2O2浓度在200 μmol/L时开始出现显著性差异(P < 0.05)，400 μmol/L时开始出现非常显著差异(P < 0.000 1)。400 μmol/L H2O2对细胞伤害接近细胞半数中毒浓度(CC50)，因此，后续研究应用400 μmol/L H2O2用于氧化应激损伤造模。
2.3 氧化应激模型下芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞的保护作用 MTT实验结果证实，在H2O2构建的氧化应激模型基础上，随着加入芒果苷浓度升高，骨髓间充质干细胞的增殖能力逐渐升高，以80 μmol/L芒果苷组细胞增殖能力最强，见图3。
2.4 各组骨髓间充质干细胞培养上清液中超氧化物歧化酶活性 在氧化应激状态下，细胞上清液中总超氧化物歧化酶活性和铜锌-超氧化物歧化酶活性下降。随着芒果苷浓度的升高，细胞上清液中总超氧化物歧化酶活性和铜锌-超氧化物歧化酶活性逐渐升高，以80 μmol/L芒果苷组超氧化物歧化酶活性最强，见图4，5。
2.5 各组骨髓间充质干细胞培养上清液中微量丙二醛水平 在氧化应激状态下，细胞培养上清液中丙二醛水平上升，随着芒果苷浓度的升高，丙二醛水平逐渐降低，以80 μmol/L芒果苷组丙二醛水平最低，见图6。
2.6 各组骨髓间充质干细胞培养上清液中过氧化氢酶活性 在氧化应激状态下，细胞培养上清液中过氧化氢酶活性下降。随着芒果苷浓度的升高，上清液中过氧化氢酶活性逐渐升高，以80 μmol/L芒果苷组过氧化氢酶活性最强，见图7。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞生物学特性实验。
1.2 时间及地点 实验于2023年4-11月在广西医科大学临床教学大楼中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠22只，4周龄，体质量(92±8) g，由广西医科大学动物实验中心提供，合格证号：SCXK(桂)2020-0003。该研究的实施符合广西医科大学第二附属医院的相关伦理要求，医院伦理批件号：伦审2023-KY(0907)；2023-KY(0094)。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在全身麻醉下进行所有的手术，并尽努力最大限度地减少其疼痛、痛苦。
1.3.2 主要试剂与仪器 倒置相差显微镜(Olympus，型号CKX53SF-R)；CO2培养箱(Shellab，型号SCO5W-2)；SW-CJ型生物洁净工作台(苏净集团安泰公司，型号SW-CJ-2F)；酶标仪(Thermo公司，型号Multiskan FC)；过氧化氢酶检测试剂盒(南京建成，货号A003-1-2)；丙二醛检测试剂盒(南京建成，货号A003-1-2)；超氧化物歧化酶检测试剂盒(南京建成，货号A001-3-2)；H2O2(Sigma，No.7722-84-1)；L-DMEM培养基(Gibco，No.11965118)；芒果苷(Sigma，No.4773-96-0)；MTT(Amresco，No.298-93-1)。
1.4 实验方法
1.4.1 大鼠骨髓间充质干细胞的培养及鉴定 参见作者前期研究进行大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养[11]。取第3代骨髓间充质干细胞，用含10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μmol/L 2-磷酸抗坏血酸、0.1 μmol/L地塞米松、体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基进行成骨诱导培养。成骨诱导14 d后进行碱性磷酸酶染色和茜素红染色。
1.4.2 H2O2对骨髓间充质干细胞氧化应激损伤的细胞毒性实验 将第3代骨髓间充质干细胞以每孔1×104 的细胞数量加入96孔板第2-11列各孔中，第1列和第12列孔中不加细胞，仅加入L-DMEM培养基，第3-10列孔中依次加入含0，50，100，200，400，600，800，1 000 μmol/L H2O2的无血清L-DMEM培养基，第2，11列加入L-DMEM培养基为正常对照，孵育24 h，移除培养基，换液继续培养48 h，各孔加入50 μL MTT，避光孵育4 h，移除各孔中液体，加200 μL L-DMEM培养基，以第1列各孔吸光度均值调零，酶标仪检测492 nm处吸光度值。
1.4.3 氧化应激损伤下芒果苷对骨髓间充质干细胞保护的MTT实验 将第3代骨髓间充质干细胞以每孔1×104 的细胞数量加入2块96孔板中的第4-8列各孔中，每孔200 μL，第3列和第9列孔中不加细胞，仅加入L-DMEM培养基200 μL，在第4-8列各孔依次加入0，20，40，80，160 μmol/L芒果苷，培养2 h，移除培养基，每孔加入含400 μmol/L H2O2的无血清L-DMEM培养基200 μL及原浓度的芒果苷，分别培养12 h和24 h，各孔加入50 μL MTT，避光孵育4 h，移除各孔液体，加入200 μL L-DMEM培养基，以第3列各孔吸光度均值调零，酶标仪检测492 nm处吸光度值。
1.4.4 氧化应激损伤下芒果苷对骨髓间充质干细胞的抗氧化作用 将骨髓间充质干细胞以每孔5×105的细胞数量加入6孔板内，培养24 h，第2-6列孔中依次加入0，20，40，80，160 µmol/L芒果苷，培养2 h，弃上清，加入含400 µmol/L H2O2、体积分数10%胎牛血清的L-DMEM培养基及原浓度的芒果苷，分别培养12 h及24 h，第1列加入L-DMEM培养基为正常对照。收集上述各组细胞培养的上清液，根据试剂盒操作步骤检测上清液中超氧化物歧化酶、丙二醛、过氧化氢酶水平。
1.5 主要观察指标 ①H2O2对骨髓间充质干细胞的毒性作用；②芒果苷对骨髓间充质干细胞氧化应激损伤的保护作用。

1.6 统计学分析 由第一作者应用SPSS 22.0统计软件进行数据处理，实验数据用x±s表示。采用 t 检验进行两组间比较，采用单因素方差分析进行多组数据比较，P < 0.05为差异有显著性意义。实验均重复3次。文章统计学方法已经通过广西医科大学生物统计学专家审核。

讨论

3.1 骨髓间充质干细胞修复脊髓损伤的潜能 在脊髓损伤动物模型中，已被证明干细胞移植再生方法可以促进组织修复，通常伴有功能恢复，成为治疗脊髓损伤的一种有前途的新方法[12]。骨髓间充质干细胞作为塑性贴壁细胞，在适当条件下可以自我更新并分化为不同的间充质细胞群，包括成骨细胞[13]、脂肪细胞[14]、软骨细胞[15]。在一定的实验条件下，骨髓间充质干细胞还可以分化为非中胚层来源的细胞，如神经元和胶质细胞等[16]。由于间充质干细胞的免疫原性低，自体和异体间充质干细胞都能逃避宿主免疫系统的排斥反应[17]，具有独特的移植优势。多位学者发现骨髓或脂肪来源间充质干细胞治疗能降低糖尿病大鼠的胰腺、肝脏和肾脏组织的氧化应激反应[18-20]。在一项研究中，41例脊髓损伤患者的蛛网膜下腔内反复给予间充质干细胞可显著改善神经功能障碍和生活质量[21]。最近的一项荟萃分析表明，48.9%脊髓损伤患者的ASIA损伤量表得分至少可以提高一个等级，此外，它可以提高42.1%和52.0%脊髓损伤患者的泌尿和胃肠道系统功能[22]。因此，骨髓间充质干细胞移植为脊髓损伤提供了新的治疗策略[23]。
3.2 氧化应激对骨髓间充质干细胞移植的损伤机制 虽然骨髓间充质干细胞移植可用于治疗疾病，但是骨髓间充质干细胞一旦移植到缺血部位，生存率差是其临床应用的主要障碍[24]。研究表明，以氧化应激为特征的不良微环境可能导致移植后干细胞丢失[25]。因此，了解干细胞移植后的短期生存情况对于改善干细胞的临床应用效果至关重要。
体内外氧浓度和营养条件的差异可能使干细胞在体内移植后处于高氧化应激状态，降低定植率和存活率，并阻碍对受损部位的有效治疗[26-27]。氧代谢产生的抗氧化剂和活性氧水平的不平衡导致氧化应激，是发生间充质干细胞衰老的主要因素[28-31]。抗氧化剂等细胞保护分子对间充质干细胞进行预处理可以减少氧化应激并增强其再生潜力[32]。由于抗氧化剂可以促进间充质干细胞增殖，减少细胞凋亡，增加组织微环境中生长因子的分泌，抗氧化剂对间充质干细胞移植可能是有益的[33-35]。
3.3 芒果苷对氧化应激状态下骨髓间充质干细胞的保护作用 芒果苷具有抗骨质疏松[36]、降高脂血症[37]、抗糖尿病[38]、
抗肿瘤[39]、抗氧化等作用[40]。芒果苷在各种病理过程中具有拮抗氧化应激、保护线粒体功能和很强的自由基清除活性[41-43]。ATTIA等[40]发现芒果苷通过抑制炎症和氧化应激，对抗甲氨蝶呤诱导的肾毒性，对肾脏具有保护作用。NOH等[44]发现芒果苷通过抑制巨噬细胞介导的炎症反应和激活自噬，改善糖脂代谢，对代谢性疾病具有治疗作用。在神经修复方面，LUM等[45]发现芒果苷具有抗氧化和抗炎活性等作用，可保护大脑免受氧化损伤和神经炎症。另外，芒果苷可降低关节炎相关的细胞凋亡和细胞外基质的降解[46]。该研究通过MTT实验发现，用400 μmol/L H2O2分别处理骨髓间充质干细胞12 h和24 h后，芒果苷40 μmol/L组的保护作用开始出现显著性差异，芒果苷80 μmol/L组和160 μmol/L组有非常显著性差异。芒果苷80 μmol/L组的保护作用最强。随着芒果苷保护时间增加，24 h保护效果要优于12 h(80 μmol/L组和160 μmol/L组)。
超氧化物歧化酶是一种重要的抗氧化酶，具有清除自由基、抗氧化的作用。该研究发现：在氧化应激状态下，骨髓间充质干细胞的总超氧化物歧化酶和铜锌-超氧化物歧化酶活性下降，芒果苷处理后超氧化物歧化酶和铜锌-超氧化物歧化酶活性逐渐升高，以80 μmol/L芒果苷的保护作用最强。
丙二醛是多不饱和脂肪酸过氧化反应的主要产物，是评估氧化应激最常用的标志物之一，它是酶促和非酶促脂质过氧化过程的内源性基因毒性产物[47]。该研究发现：与氧化应激模型组相比，芒果苷处理12 h时，80 μmol/L芒果苷组丙二醛水平出现极其显著差异，其他芒果苷各浓度组未见显著差异。芒果苷处理24 h时，80，160 μmol/L芒果苷组丙二醛水平出现显著性差异，其他芒果苷各浓度组未见显著差异。
过氧化氢酶是一种天然存在的抗氧化酶，其主要功能是催化过氧化氢分解为水和分子氧，是哺乳动物细胞酶促抗氧化防御系统的重要成员，对保护细胞免受活性氧的侵害至关重要。该研究发现：随着芒果苷浓度的升高，上清液中过氧化氢酶活性逐渐升高，芒果苷的保护作用逐渐增强。与氧化应激模型组相比，在芒果苷处理12，24 h时，40，80，160 μmol/L芒果苷组的过氧化氢酶活性具有非常显著性差异，20 μmol/L芒果苷组的过氧化氢酶活性在处理12 h无显著差异，24 h出现非常显著差异。
综上所述，抗氧化剂芒果苷在20 µmol/L浓度以上表现出抗氧化能力，以80 μmol/L保护作用最强，这可能会是一种新的预处理策略，可以用来增强移植骨髓间充质干细胞的存活、增殖和再生潜力。但在氧化应激环境下，芒果苷通过何种机制和信号通路调节细胞功能，仍需进一步研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞氧化应激损伤的保护作用

Protective effect of mangiferin on oxidative stress injury in rat bone marrow mesenchymal stem cells

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