慢性根尖周炎模型大鼠表观遗传分子：溴结构域蛋白4的表达变化

doi:10.12307/2022.478

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (14): 2167-2171.doi: 10.12307/2022.478

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慢性根尖周炎模型大鼠表观遗传分子：溴结构域蛋白4的表达变化

许颖华1，姜龙2，史春3

1上海市浦东新区眼病牙病防治所，上海市 200120；2大连医科大学中山学院，辽宁省大连市 116044；3大连医科大学口腔医学院，辽宁省大连市 116044

收稿日期:2021-06-09 修回日期:2021-06-10 接受日期:2021-07-28 出版日期:2022-05-18 发布日期:2021-12-21
通讯作者: 史春，硕士，讲师，大连医科大学口腔医学院口腔内科教研室，辽宁省大连市 116044
作者简介:许颖华，男，1980年生，上海市人，汉族，2007年大连医科大学毕业，硕士，副主任医师，主要从事口腔临床和基础研究。
基金资助:
浦东新区卫生系统学科带头人培养计划(PWRd2017-13)，项目负责人，许颖华;辽宁省自然科学基金(20180550564)，项目负责人，史春

Changes in the expression of bromodomain-containing protein 4, an epigenetic molecule, in a rat model of chronic periapical periodontitis

Xu Yinghua1, Jiang Long2, Shi Chun3

1Pudong New Area Eye Disease and Dental Disease Prevention & Treatment Center, Shanghai 200120, China; 2Zhongshan College of Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China; 3School of Stomatology, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China

Received:2021-06-09 Revised:2021-06-10 Accepted:2021-07-28 Online:2022-05-18 Published:2021-12-21
Contact: Shi Chun, Master, Lecturer, School of Stomatology, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China
About author:Xu Yinghua, Master, Associate chief physician, Pudong New Area Eye Disease and Dental Disease Prevention & Treatment Center, Shanghai 200120, China
Supported by:
Discipline Leader Training Program of the Health System in Pudong New Area, No. PWRd2017-13 (to XYH); the Natural Science Foundation of Liaoning Province, No. 20180550564 (to SC)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
根尖周炎：是一种由感染牙髓引起的根尖周组织的感染性炎性疾病。牙髓系统中的感染，包括龋齿、修复缺陷、创伤或失败根管治疗都会导致根尖周炎的发生。
溴结构域蛋白4：是溴结构域和末端外结构域的双溴结构域蛋白，溴结构域蛋白4被视为许多炎性疾病的潜在治疗靶点，还可以调节破骨细胞分化并参与骨质疏松症的发生。

背景：根尖周炎是一种由感染牙髓内的细菌引起的根尖周组织的炎性疾病。溴结构域蛋白4在表观遗传的传递中起核心作用，研究表明溴结构域蛋白4在炎症及骨破坏中起到了重要的作用，但是其在慢性根尖周炎中的作用尚未见报道。
目的：通过建立根尖周炎大鼠模型，探究溴结构域蛋白4在根尖周炎发展中的作用。
方法：选取30只SD大鼠，随机分为5组，分别为0周组、1周组、2周组、3周组以及4周组，每组各6只。于左侧下颌第一磨牙行开髓术，暴露牙髓，分别于术后0，1，2，3，4周麻醉处死。多聚甲醛固定后取下颌骨，拍摄Micro-CT鉴定根尖周炎动物模型是否构建成功。脱钙1个月后制作冰冻切片，免疫组化法检测溴结构域蛋白4在慢性根尖周炎发展中的作用。
结果与结论：①Micro-CT结果显示，大鼠根尖周炎动物模型在术后一两周出现牙周膜增宽及根尖阴影，根尖阴影面积随时间推移而增加；3周组和4周组阴影面积增加明显，差异有显著性意义(P < 0.05)；1周组、2周组、3周组以及4周组根尖阴影面积均高于0周组，差异有显著性意义(P < 0.05)，3周组及4周组相比差异无显著性意义(P > 0.05)；②免疫组化结果显示，1周组、2周组、3周组以及4周组的溴结构域蛋白4表达水平均高于0周组，差异有显著性意义(P < 0.05)；溴结构域蛋白4在2周组表达最高，差异有显著性意义(P < 0.05)；溴结构域蛋白4在1周组和4周组表达无明显差异(P > 0.05)；③提示溴结构域蛋白4在根尖周炎发生发展中起到了一定的作用，溴结构域蛋白4参与了慢性根尖炎的发展。
缩略语：溴结构域蛋白4：bromodomain-containing protein 4，BRD4

https://orcid.org/0000-0001-9479-999X (许颖华)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 溴结构域蛋白4, 慢性根尖周炎, 动物模型, 口腔, 牙周膜, 大鼠

Abstract: BACKGROUND: Apical periodontitis is an infectious inflammatory disease of the periapical tissue caused by bacterial infection. Bromodomain-containing protein 4 (BRD4) plays a central role in epigenetic transmission. Studies have shown that BRD4 exerts an important role in inflammation and bone destruction; however, its role in chronic apical periodontitis has not yet been reported.
OBJECTIVE: To establish a rat model of apical periodontitis to detect the role of BRD4 in the development of apical periodontitis.
METHODS: Thirty Sprague-Dawley rats were selected and randomly divided into five groups, 0-week group, 1-week group, 2-week group, 3-week group, and 4-week group, with six rats in each group. Dental pulp of the left mandibular first molar was exposed by pulpectomy, and they were sacrificed at 0, 1, 2, 3, and 4 weeks postoperatively. After paraformaldehyde fixation, the mandible was removed, and Micro-CT was taken to identify whether the animal model of periapical periodontitis was successfully constructed. Frozen sections were made 1 month after decalcification, and the role of BRD4 in the development of chronic apical periodontitis was detected by immunohistochemistry.
RESULTS AND CONCLUSION: The results of Micro-CT showed that widened periodontal ligament and a certain apical shadow appeared in the rat apical periodontitis model at 1-2 weeks postoperatively. The shadow area increased over time and increased significantly at 3 and 4 weeks (P < 0.05). The apical shadow area in the 1-, 2-, 3-, and 4-week groups was significantly higher than that of the 0-week group P < 0.05). However, there was no statistical difference between the 3- and 4-week groups (P > 0.05). Immunohistochemical results showed that the expression of BRD4 in the 1-, 2-, 3-, and 4-week groups was significantly higher than that of the 0-week group (P < 0.05). Highest BRD4 expression appeared in the 2-week group (P < 0.05), but there was no significant difference between the 1- and 4-week groups (P > 0.05). To conclude, BRD4 plays a certain role in the occurrence and development of apical periodontitis, suggesting that BRD4 participates in the development of chronic apical periodontitis.

Key words: bromodomain-containing protein 4, chronic apical periodontitis, animal model, oral cavity, periodontal ligament, rat

中图分类号:

许颖华, 姜龙, 史春. 慢性根尖周炎模型大鼠表观遗传分子：溴结构域蛋白4的表达变化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(14): 2167-2171.

Xu Yinghua, Jiang Long, Shi Chun. Changes in the expression of bromodomain-containing protein 4, an epigenetic molecule, in a rat model of chronic periapical periodontitis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(14): 2167-2171.

图/表（结果） 2

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，比较不同时间点下颌第一磨牙根尖阴影面积以及BRD4阳性细胞表达量的差异，采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2019年6-12月在上海市浦东新区眼病牙病防治所完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级SD大鼠，雄性，体质量180-220 g，由大连医科大学SPF实验动物中心提供，许可证号：SCXK (辽) 2020-0001。实验方案经上海市浦东新区眼病牙病防治所动物伦理委员会批准，批准号：2020-009。
1.3.2 实验仪器台式电动牙钻YKD-Ⅰ型(DENTSPLY，日本)，冰冻切片机CM1860(徕卡，德国)，紧凑型台式切片扫描仪Aperio CS2(徕卡，德国)，Micro-CT(Xradia，USA)。
1.3.3 实验试剂苏木精-伊红染色试剂盒(碧云天，中国)，BRD4多克隆抗体(Abcam，美国)，二抗试剂盒PV-9001(中杉金桥，中国)。
1.4 实验方法

1.4.1 根尖周炎动物模型建立选取30只SD大鼠，常规饲养，按照简单随机化方法分为5组，分别为0周组、1周组、2周组、3周组以及4周组，每组各6只。使用1%戊巴比妥钠(30 mg/kg) 对大鼠进行腹腔注射麻醉，于左侧下颌第一磨牙行开髓术，暴露牙髓，术后禁食24 h[26]。

1.4.2 Micro-CT鉴定根尖周炎动物模型分别于术后0，1，2，3，4周，使用1%戊巴比妥钠(30 mg/kg)对大鼠进行腹腔注射麻醉，40 g/L多聚甲醛心脏灌流固定，修整下颌骨。拍摄Micro-CT鉴定根尖周炎动物模型是否构建成功。扫描条件为：9 W，110 kV，5 s，扫描后将所有数据导入Mimics 16.0软件，计算左侧下颌第一磨牙根尖阴影面积。
1.4.3 免疫组化染色将40 g/L多聚甲醛固定下颌骨组织，采用EDTA(pH=7.4，4.13%，百分比代表0.1 mol/L PB)脱钙 42 d，液氮冷冻OCT包埋，制作冰冻切片(厚度为10 μm)，低温冷冻保存。切片于37 ℃恒温培养1 h，放入甲醇(80%)及H2O2(3%)的去离子水中60 min；山羊血清封闭60 min；加入BRD4多克隆抗体(1∶200)，低温孵育 24 h；PBST漂洗3次后加入二抗(1∶500)，孵育2 h，DAB发色10 min，中性树胶封固，紧凑型台式切片扫描仪Aperio CS2检测BRD4阳性细胞表达量。选择大鼠根尖炎模型大鼠中左侧下颌第一磨牙近中根的牙槽骨区域为计数对象，采用扫描仪Aperio CS2计数此区域中BRD4阳性细胞表达量(物镜40倍，单位：个/3×104 μm 2)，每个组织随机选取3张非连续切片[26]。
1.5 主要观察指标术后0，1，2，3，4周处死SD大鼠，多聚甲醛固定后取下颌骨，拍摄Micro-CT鉴定根尖周炎动物模型是否构建成功。脱钙1个月后制作冰冻切片，免疫组化检测BRD4在慢性根尖周炎发展中的作用。
1.6 统计学分析用IBM SPSS 19.0软件进行统计学分析，采用单因素方差分析，分析不同时间点下颌第一磨牙根尖阴影面积以及BRD4阳性细胞表达量的差异，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

根尖周炎的“骨骼重塑”过程，是一种骨形成与骨吸收之间的动态平衡机制[27-28]。这个重塑过程取决于骨细胞的活性，即成骨细胞和破骨细胞的活性。宿主在细菌的作用下，破骨细胞的活性增强，成骨细胞的活性降低，在根尖部位出现了实质性的骨缺损[29-32]。最近的研究表明，靶向表观遗传调控因子，如溴结构域和末端外结构域阅读器在治疗炎性骨缺损中起到了重要的作用[33]。表观遗传机制包括基因的所有可遗传变化，这种机制发生在基因转录之前或之后。通过这种方式，DNA 甲基化和组蛋白的翻译后修饰直接调节染色质的结构，进一步影响染色质的转录因子和聚合酶[34]。基因表达的改变受表观遗传机制控制，例如非编码 RNA、DNA甲基化和组蛋白的翻译后修饰。组蛋白尾部修饰是动态的，可以被表观遗传调节器读取、写入和擦除，由此产生的表观基因组是复杂的，并且已被证明可以调节骨形成以及炎性基因表达，溴结构域和末端外结构域蛋白不仅能够结合乙酰化赖氨酸残基，但可以与其他转录因子和表观遗传调节因子相互作用[35]。特别是BRD4是目前研究的热点，因为它与转录子的启动相关，BRD4参与许多疾病中的生物学过程，研究表明，BRD4可以参与炎症的发生，与骨组织的形成也密切相关，然而BRD4是否参与慢性根尖周炎的发病过程尚无报道指出。
大鼠磨牙的牙髓暴露导致牙髓坏死和根尖周病变，随着时间的推移导致牙槽骨破坏和根尖周脓肿形成，这是典型根尖周炎的进展表现[36-37]。之前的文献通过放射学和组织学染色确定了如何建立根尖周炎动物模型[37-38]。此次实验在前人的基础上，通过建立了SD大鼠根尖周炎动物模型，采用Micro-CT检测大鼠根尖周炎动物模型的建立是否成功，结果表明在1周根尖周组织出现了牙周膜增宽；而在2周时，从横切面、冠状面以及矢状面三维观察根尖周骨组织出现了骨缺损，伴随时间的推移；在3周到4周的过程中，骨缺损虽然增大，但是统计学无差异。通过Micro-CT结果，证实了大鼠根尖周炎动物模型构建的成功。研究表明大鼠根尖周炎模型在牙髓暴露(活动期)后三四周后，根尖周病灶主动扩张并显示此后进展缓慢(慢性阶段)，此次实验结果表明1周组、2周组、3周组以及4周组根尖阴影面积都高于对照组，根尖阴影随着时间递增而增大，但是3周组与4周组无统计学差异，说明此时根尖周病灶进入了慢性阶段。
此次实验结果证实，在大鼠根尖周炎中BRD4的表达在2周达到高峰，在三四周时出现降低的趋势。BRD4的阳性细胞主要表达于中性粒细胞以及单核-巨噬细胞中，研究表明在大鼠根尖周炎建模2周后，中性粒细胞表达最多，说明此时处于根尖周炎的急性期，而此次实验结果也证明在2周时BRD4的表达量最高，说明BRD4参与了慢性根尖周炎的炎性过程。在大鼠根尖周炎建模三四周后，淋巴细胞表达最高，说明此时根尖炎进入了慢性进展期。上述的结果表明BRD4参与了慢性根尖周炎的炎症发展过程。DEY等[39]表明BRD4是必不可少的诱导人气道上皮细胞炎症发生的重要蛋白。ZHU等[40]证明 BRD4的表达对Toll 样受体4介导的炎性信号通路至关重要。REN等[41]研究表明BRD4在种植体周围炎中表达增多，钛粒子诱导的小鼠巨噬细胞中炎性因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和白细胞介素1表达增高，而抑制BRD4后，这些炎性因子表达降低，说明BRD4在种植体周围炎中参与了促炎因子的产生。以上结果与此次实验结果都证明了BRD4在炎性疾病的发展过程中至关重要。
研究表明BRD4在破骨细胞的分化中起到了重要的作用，过表达BRD4后，破骨细胞的增殖能力提高[42]。有研究报道在慢性牙周炎患者的血液中检测出了BRD4的表达增高，通过体外实验证明，抑制BRD4可以抑制破骨前体细胞的增殖[43]。BADRELDIN等[44]通过体内实验证实了肿瘤坏死因子诱导的颅上骨溶解模型，采用BRD4抑制剂后，骨表面的破骨细胞数量显著减少。BRD4缺失的骨质疏松动物模型中骨小梁的结构改善，骨质缺损减少[45]。上述结果说明BRD4可以促进破骨细胞的分化，而此次实验结果表明在大鼠慢性根尖周炎动物模型中，BRD4的阳性细胞不仅表达在中性粒细胞中，亦表达在单核-巨噬细胞中，单核-巨噬细胞是破骨细胞的前体细胞，研究表明破骨细胞的表达量在2周达到了高峰，三四周时由于机体的防御机制，破骨细胞的量出现了降低[38]。此次实验也表明BRD4在单核-巨噬细胞中的表达趋势与破骨细胞的表达趋势一致，因此作者推测BRD4可能参与慢性根尖周炎中破骨细胞的增殖与分化。此外，BRD4抑制剂JQ1已经成为了治疗骨缺损的重要靶向药物，研究表明JQ1可以减少体内破骨细胞的数量，而不会影响成骨细胞的数量，而且这种化合物不会显著影响生理条件下的骨形成[41]。作为一种副反应极少的治疗骨缺损的靶向药物，BRD4抑制剂可以降低破骨细胞分化和活性的2个重要标记物——抗酒石酸酸性磷酸酶和组织蛋白酶K[46-47]。因此在接下来的实验中，希望将BRD4抑制剂应用于慢性根尖周炎的动物模型中，进而寻找治疗慢性根尖周炎骨破坏的靶向药物。
此次实验结果只是证明了BRD4参与了慢性根尖周炎的炎症发展过程，BRD4在慢性根尖周炎的表达于中性粒细胞以及单核-巨噬细胞中，因此推测BRD4参与了慢性根尖周炎的炎性过程以及骨破坏过程，但是此次实验尚未研究其在慢性根尖周炎中的作用机制，有待以后进一步开展。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

慢性根尖周炎模型大鼠表观遗传分子：溴结构域蛋白4的表达变化

Changes in the expression of bromodomain-containing protein 4, an epigenetic molecule, in a rat model of chronic periapical periodontitis

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