丹皮酚对去卵巢骨质疏松大鼠叉头框蛋白O3a/Wnt信号通路及椎骨密度的影响

doi:10.12307/2021.209

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

骨质疏松：是好发于高龄人群及绝经后女性的骨退行性疾病，患者骨代谢平衡被破坏，骨吸收大于骨形成，导致骨密度降低、骨生物力学受损，造成周身疼痛、脆性骨折等临床特征，严重影响患者的生活质量。
丹皮酚：是中药牡丹皮的主要有效成分，可抗氧化、抗炎、抗癌、降脂及促进微循环，具有抑制炎症反应、减轻慢性骨关节炎临床症状的疗效，还可通过减轻炎症抑制破骨细胞生成，缓解结缔组织诱导的大鼠牙周炎症状。作为一种中药活性成分，药效温和持久、不良反应少，应用前景广阔。

背景：丹皮酚可抑制炎症，减轻慢性骨关节炎临床症状，作为一种不良反应小、更为安全的天然药物成分，探讨其对骨质疏松症的治疗作用具有重要的临床意义。
目的：探究丹皮酚对去卵巢骨质疏松大鼠叉头框蛋白O3a(forkhead box O3a，FoxO3a)/Wnt信号通路及椎骨密度的影响。
方法：雌性SD大鼠随机分为6组，每组10只。假手术组仅切除卵巢旁部分脂肪组织；其余50只大鼠均采用双侧卵巢摘除法制备去卵巢骨质疏松大鼠模型，模型制备成功后分为模型组、雌激素组[炔雌醇10 μg/(kg•d)]、丹皮酚低、中、高剂量组[丹皮酚125，250，500 mg/(kg•d)]，每组10只，灌胃给药；假手术组、模型组灌胃等量生理盐水，持续干预12周。ELISA法测定血清雌激素、骨保护素、骨钙素水平；采用双能X射线动物骨密度测定仪检测大鼠股骨及椎骨骨密度；采用骨科生物力学测试仪检测大鼠股骨及椎骨生物力学指标：弹性模量、最大载荷、屈服载荷；实时荧光定量PCR检测椎骨组织FoxO3a、Wnt2 mRNA表达水平；免疫印迹法检测椎骨组织FoxO3a、Wnt2及核内β-catenin蛋白表达。
结果与结论：①治疗后，与假手术组比较，模型组L4，5骨密度、弹性模量、最大载荷、屈服载荷、血清雌二醇、骨保护素水平、椎骨组织Wnt2 mRNA及蛋白水平、核内β-catenin蛋白水平均显著降低(P < 0.05)，骨钙素水平、椎骨组织FoxO3a mRNA及蛋白水平显著增加(P < 0.05)；②与模型组比较，丹皮酚低、中、高剂量组大鼠L4，5骨密度、弹性模量、最大载荷、屈服载荷、血清雌二醇、骨保护素水平、椎骨组织Wnt2 mRNA及蛋白水平、核内β-catenin蛋白水平依次增加(P < 0.05)，血清骨钙素水平、椎骨组织FoxO3a mRNA及蛋白水平依次降低(P < 0.05)，且丹皮酚高剂量组均优于雌激素组(P < 0.05)；③提示丹皮酚可增加去卵巢骨质疏松大鼠椎骨骨密度，改善其骨生物力学状况，减轻骨质疏松，该作用可能与抑制FoxO3a、促进Wnt2/β-catenin通路激活有关。

https://orcid.org/0000-0002-7185-5925 (张富财)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 丹皮酚, 骨质疏松, 去卵巢大鼠, 叉头框蛋白O3a/Wnt信号通路, 椎骨密度

Abstract: BACKGROUND: Paeonol can inhibit inflammation and relieve the clinical symptoms of chronic osteoarthritis. As a natural drug component with less side effects and more safety, it is of great clinical significance to explore the treatment of osteoporosis.
OBJECTIVE: To investigate the effects of paeonol on the signal pathway of forkhead box O3a/Wnt and the density of vertebrae in ovariectomized osteoporosis (OVX-OP) rats.
METHODS: Female Sprague-Dawley rats were randomly divided six groups (n=10 per group). Rats in the sham operation only underwent removal of adipose tissue adjacent to the ovary, and the other 50 rats were used to make OVX-OP rat models by bilateral ovariectomy. The rat models were randomly divided into OVX-OP group, estrogen group (ethinylestradiol 10 μg/kg/d), low- (paeonol 125 mg/kg/d), medium- (paeonol 250 mg/kg/d), and high-dose (paeonol 500 mg/kg/d) groups. The rats were administered by gavage. Sham operation group and OVX-OP group were given the same amount of normal saline. The intervention lasted for 12 weeks. The levels of serum estrogen, osteoprotegerin and osteocalcin were measured by enzyme-linked immunosorbent assay. Bone mineral density of the femur and vertebrae was measured by dual energy X-ray animal bone mineral density meter. The biomechanical indexes of the femur and vertebrae, elastic modulus, maximum load and yield load, were measured by orthopedic biomechanical tester. The expression levels of forkhead box O3a and Wnt2 mRNA were detected by real-time fluorescence quantitative PCR. The expression levels of forkhead box O3a, Wnt2 and nucleus β-catenin proteins were detected by western blot.
RESULTS AND CONCLUSION: After the treatment, the bone mineral density, elastic modulus, maximum load, and yield load in the 4th and 5th lumbar vertebrae, serum estradiol and osteoprotegerin levels, Wnt2 mRNA and protein levels, and nucleus β-catenin protein level were significantly lower in the OVX-OP group than the sham operation group (P < 0.05), while serum osteocalcin and vertebral forkhead box O3a mRNA and protein levels were significantly higher in the OVX-OP group (P < 0.05). Compared with the OVX-OP group, low-, medium, and high-dose paeonol significantly increased the bone mineral density, elastic modulus, maximum load, and yield load in the 4th and 5th lumbar vertebrae, serum estradiol and osteoprotegerin levels, Wnt2 mRNA and protein levels in the vertebrae (P < 0.05), and decreased the levels of serum osteocalcin and vertebral FOXO3a mRNA and protein (P < 0.05). Moreover, the above-mentioned indexes were better in the high-dose paeonol group than the estrogen group (P < 0.05). To conclude, paeonol can increase bone mineral density of the vertebrae, improve the biomechanical condition, and relieve osteoporosis in OVX-OP rats, which may be related to the inhibition of forkhead box O3a and the promotion of Wnt2/β-catenin pathway activation.

Key words: paeonol, osteoporosis, ovariectomized rats, forkhead box O3a/Wnt signal pathway, vertebral bone mineral density

中图分类号:

张富财, 郑峰, 王福荣, 陈刚. 丹皮酚对去卵巢骨质疏松大鼠叉头框蛋白O3a/Wnt信号通路及椎骨密度的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(32): 5091-5096.

Zhang Fucai, Zheng Feng, Wang Furong, Chen Gang . Effects of paeonol on forkhead box O3a/Wnt signal pathway and vertebral bone mineral density in ovariectomized osteoporosis rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(32): 5091-5096.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析建模63只，术后创口感染致死2只，麻醉致死1只，造模成功60只，其中假手术组10只， OVX-OP模型组50只。
2.2 假手术组与模型组大鼠骨密度水平比较造模12周后，与假手术组比较，OVX-OP 模型组大鼠L4，5及左、右股骨骨密度水平均显著降低(P < 0.05)，见表2。

2.3 各组大鼠L4，5骨密度水平及生物力学比较治疗12周后，与假手术组比较，模型对照组L4，5骨密度、弹性模量、最大载荷、屈服载荷显著降低(P < 0.05)；与模型对照组比较，丹皮酚低、中、高剂量组大鼠L4，5骨密度、弹性模量、最大载荷、屈服载荷依次增加(P < 0.05)，且丹皮酚高剂量组高于雌激素组(P < 0.05)，见表3。

2.4 各组大鼠血清雌二醇、骨保护素、骨钙素水平比较治疗12周后，与假手术组比较，模型对照组血清雌二醇、骨保护素水平显著降低，骨钙素水平显著增加(P < 0.05)；与模型对照组比较，丹皮酚低、中、高剂量组大鼠血清雌二醇、骨保护素水平依次增加，且丹皮酚高剂量组高于雌激素组 (P < 0.05)；丹皮酚低、中、高剂量组大鼠血清骨钙素水平依次降低，且丹皮酚高剂量组低于雌激素组(P < 0.05)，见表4。

2.5 各组大鼠椎骨组织FoxO3a及Wnt2 mRNA表达水平比较治疗12周后，与假手术组比较，模型对照组椎骨组织FoxO3a mRNA表达水平显著增加，Wnt2 mRNA表达水平显著降低(P < 0.05)；与模型对照组比较，丹皮酚低、中、高剂量组大鼠椎骨组织FoxO3a mRNA表达水平依次降低，且丹皮酚高剂量组低于雌激素组(P < 0.05)；丹皮酚低、中、高剂量组大鼠椎骨组织Wnt2 mRNA表达水平显著增加，且丹皮酚高剂量组高于雌激素组(P < 0.05)，见表5。

2.6 各组大鼠椎骨组织FoxO3a、Wnt2及核内β-catenin蛋白表达量比较治疗12周后，与假手术组比较，模型对照组椎骨组织FoxO3a蛋白水平显著增加，Wnt2、核内β-catenin蛋白表达水平显著降低(P < 0.05)；与模型对照组比较，丹皮酚低、中、高剂量组大鼠组椎骨组织FoxO3a蛋白水平依次降低，且丹皮酚高剂量组低于雌激素组(P < 0.05)，Wnt2、核内β-catenin蛋白水平显著增加，且丹皮酚高剂量组高于雌激素组(P < 0.05)，见图1及表6。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点于2020年1至10月在青海省高原医学应用基础重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 6月龄、SPF级未孕雌性SD大鼠63只，体质量(300±10) g，购自兰州大学实验动物中心，生产许可证号：SCXK(甘)2018-0002，使用许可证号：SYXK(甘)2018-0002。饲养条件：室温(24±2) ℃、湿度(50±10)%，12 h/12 h光照/黑暗，自由饮水饮食。此次动物实验经青海省人民医院动物实验伦理委员会批准(伦理批号：201904037)，实验遵循3R原则，减少不必要的浪费。
1.3.2 主要试剂及仪器丹皮酚(货号：552-41-0，纯度99%，规格：1 kg/袋)购自陕西畅想制药有限公司，批号：20150123；炔雌醇(批准文号：国药准字H20073627)购自秦皇岛紫竹药业有限公司，批号：20140421；戊巴比妥钠(批准文号：国药准字H31021724)购自上海上药新亚药业有限公司，批号：20150506；雌二醇检测试剂盒(货号：H102)购自南京建成生物工程研究所，批号：20160716；大鼠骨保护素ELISA试剂盒及骨钙素均购自上海信帆生物科技有限公司，批号：20160826；RNA提取试剂盒(货号：R0011)购自上海碧云天有限公司，批号：20140218；PrimeScript™ RT reagent Kit (Perfect Real Time)(货号：RR037A)、TB Green® Premix Ex Taq™ Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(货号：RR820A)均购自TaKaRa生物公司；引物由上海吉玛生物科技有限公司合成；兔源一抗anti-FOXO3a(货号：ab70314)、anti-Wnt2(货号：ab27794)、anti-β-catenin(货号：ab32572)、anti-PCNA(货号：ab92552)、anti-β-actin(货号：ab8227)、二抗羊抗兔IgG(货号：ab6721)抗体购自英国Abcam公司；FC酶标仪、7500定量PCR仪购自美国Thermo Fisher公司；双能X射线实验动物骨密度测定仪(型号：InAlyzer，韩国)购自佰泰科技有限公司；骨科生物力学测试仪(型号MX-0580)购自江苏摩信工业系统有限公司；半自动图像数字化分析仪购自日本尼康公司等。
1.4 方法
1.4.1 OVX-OP大鼠模型制备及分组给药 63只SD大鼠按照随机数表法分为假手术组11只及OVX-OP模型组52只。所有大鼠均用2%戊巴比妥钠2 mL/kg腹腔注射麻醉后，严格无菌条件下取腰背椎后侧正中切口，钝性分离肌肉组织，模型组大鼠采用双侧卵巢摘除法制备OVX-OP模型，假手术组仅切除卵巢旁部分脂肪组织，逐层关闭腹腔，术后连续注射青霉素3 d，以防止感染。术后创口感染致死2只，麻醉致死1只，假手术组剩余10只，OVX-OP模型组剩余50只。造模12周后，检测大鼠左右股骨及L4，5骨密度，以骨密度显著降低为OVX-OP模型制备成功标准。将成模大鼠随机分为模型对照组、雌激素组、丹皮酚低、中、高剂量组，雌激素组采用炔雌醇10 μg/(kg•d)灌胃；丹皮酚低、中、高剂量组分别给予丹皮酚125，250，500 mg/(kg•d)灌胃[13]；假手术组、模型对照组灌胃等量生理盐水，连续干预12周。给药结束后，采集血液，分离血清，麻醉处死大鼠，分离L4，5及左右股骨。

1.4.2 骨密度及生物力学指标测定造模12周及治疗结束后，各组大鼠采用2%戊巴比妥钠2 mL/kg腹腔注射麻醉后置于双能X射线实验动物骨密度测定仪平台上，分别测定左、右肱骨及L4，5骨密度。治疗结束后以骨科生物力学测试仪测定大鼠股骨生物力学指标：弹性模量、最大载荷、屈服载荷。
1.4.3 血清雌激素、骨保护素、骨钙素水平测定采用ELLSA法检测大鼠血清雌激素、骨保护素、骨钙素水平，具体步骤严格按照试剂盒说明书进行。
1.4.4 椎骨组织FoxO3a及Wnt2mRNA表达水平检测提取椎骨组织总RNA，用紫外分光光度计检测其浓度及纯度，反转录得到cDNA，置于-20 ℃保存备用。采用实时荧光定量PCR检测FoxO3a、Wnt2及β-catenin mRNA表达水平；反应体系(20 µL)：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2×)10 µL，ROX Reference DyeⅡ(50×)0.4 µL，cDNA(50 mg/L)2 µL，上下游引物(10 µmol/L)各0.8 µL，ddH2O 6.0 µL；反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃34 s，40个循环。FoxO3a、Wnt2 mRNA及内参GAPDH的引物序列见表1。采用2-∆∆CT法定量分析FoxO3a、Wnt2 mRNA相对表达水平。

1.4.5 椎骨组织FoxO3a、Wnt2及核内β-catenin蛋白表达量检测免疫印迹检测椎骨组织FoxO3a、Wnt2及核内β-连环蛋白(β-catenin)蛋白表达。采用蛋白抽提试剂盒提取椎骨组织总蛋白及核蛋白(每只大鼠一半椎骨组织提取总蛋白，另一半提取核蛋白)，BCA试剂盒检测蛋白浓度，置于-80 ℃保存备用。取50 mg蛋白样品，进行SDS-PAGE电泳，PVDF膜转膜。室温封闭，分别添加一抗anti-FOXO3a(稀释比
1∶10 000)、anti-Wnt2(稀释比1∶1 000)、anti-β-catenin(稀
释比1∶5 000)、anti-PCNA(稀释比1∶5 000)、anti-β-actin (稀释比1∶5 000) 4 ℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜，添加二抗IgG(稀释比1∶5 000)室温孵育1.5 h，洗膜，显色，曝片，拍照并分析各蛋白灰度值。
1.5 主要观察指标给药结束24 h后，ELISA法测定血清雌激素、骨保护素、骨钙素水平；采用双能X射线动物骨密度测定仪检测大鼠股骨及椎骨骨密度；采用骨科生物力学测试仪检测大鼠股骨及椎骨生物力学指标：弹性模量、最大载荷、屈服载荷；实时荧光定量PCR检测椎骨组织FoxO3a、Wnt2 mRNA表达水平；免疫印迹法检测椎骨组织FoxO3a、Wnt2及核内β-catenin蛋白表达。
1.6 统计学分析采用SPSS 25.0软件对实验数据进行统计学分析。数据以x±s形式表示，两组比较采用t检验，多组比较行单因素方差分析，任意两组相比行SNK-q检验。P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

正常情况下，骨组织骨形成及骨吸收处于动态平衡，绝经或卵巢切除后会打破骨代谢平衡，造成骨量丢失，导致骨质疏松症形成[14-15]。骨密度是评定骨脆性及骨折危险性的常用指标，骨密度降低可客观反映骨质疏松症发生[16]。此次研究采用去卵巢法制备骨质疏松症大鼠模型，结果发现，与假手术组比较，模型对照组大鼠L4，5及左、右股骨骨密度水平、弹性模量、最大载荷、屈服载荷均显著降低，提示OVX-OP模型制备成功，可用于后续实验。
丹皮酚是毛茛科植物牡丹根皮和萝藦科植物徐长卿全草的主要活性成分，具有解热、镇痛、抗炎、抗氧化、增强免疫力、抗肿瘤等多种药理活性，且作为一种中药，其药效温和持久、不良反应少，应用前景广阔[17-20]。李倩男等[21]的研究报道，丹皮酚可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制人卵巢癌A2780细胞增殖并促进其凋亡。Li等[22]的研究报道，丹皮酚可通过调节Nrf2/NF-κB/NFATc1信号通路抑制破骨细胞生成，减轻结缔组织诱导的大鼠牙周炎。骨钙素是骨转换和骨形成的特异性指标，与骨密度呈负相关；骨保护素是骨重建过程中连接骨形成及骨吸收的关键分子，与骨密度水平呈正相关。此次研究结果发现，治疗后与假手术组比较，模型对照组血清雌二醇、骨保护素水平显著降低，骨钙素水平显著增加；与模型对照组比较，丹皮酚可呈剂量依赖性增加血清雌二醇、骨保护素水平，降低骨钙素水平，且高剂量治疗效果优于阳性药物雌激素，提示丹皮酚可能通过调节OVX-OP大鼠骨形成、骨吸收平衡对骨质疏松症有一定的治疗作用。
Wnt/β-catenin信号通路与成骨细胞活化及功能密切相关，可促进成骨细胞分化，抑制破骨细胞吸收，在骨质疏松症发生机制中发挥重要作用。喻琴云等[23]研究报道，上调Wnt/β-catenin信号通路可显著改善OVX-OP大鼠骨密度值，减轻骨质疏松症。FoxO3a是PI3K/AKT信号通路下游作用靶点，是连接Wnt/β-catenin信号通路与PI3K/AKT信号通路的枢纽，FOXO3a激活可竞争性结合β-catenin，抑制β-catenin向核内转移，阻滞Wnt/β-catenin通路传导，进而降低成骨细胞形成、增殖与分化，促进骨质疏松症发生发展[24]。成鹏等[25]研究报道，抑制FOXO3a激活，可上调Wnt/β-catenin信号通路，促使β-catenin核转移，有效缓解取卵巢大鼠的骨质疏松症，提高其骨密度。LIU等[26]研究报道，丹皮酚可通过抑制miR-155表达上调FOXO3a，防止肿瘤坏死因子α诱导类风湿性关节炎成纤维细胞样滑膜细胞的增殖和细胞因子的释放。此次研究结果发现，治疗后与假手术组比较，模型对照组椎骨组织FoxO3a mRNA及蛋白表达水平显著增加，Wnt2 mRNA及蛋白表达水平显著降低；与模型对照组比较，丹皮酚可呈剂量依赖性降低大鼠椎骨组织FoxO3a mRNA及蛋白表达水平，增加Wnt2 mRNA及蛋白表达水平，且高剂量作用效果显著优于阳性药物雌激素治疗组，提示丹皮酚抗OVX-OP大鼠骨质疏松作用可能与抑制FoxO3a表达、促进β-catenin核转移、激活Wnt2/β-catenin通路有关，相关模式图见图2。
综上所述，丹皮酚可增加OVX-OP大鼠椎骨骨密度，减轻骨质疏松，可能与抑制FoxO3a、促进Wnt2/β-catenin通路激活有关，上述研究为骨质疏松症的临床治疗提供了新的参考，具有重要的临床意义。但关于丹皮酚对临床抗骨质疏松作用的安全及最佳剂量有待进一步实验验证；另关于丹皮酚对FoxO3a/Wnt2/β-catenin信号通路上下游信号分子的作用及详细机制也将是下一步的研究重点。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程