黄芩苷对脂多糖联合三磷酸腺苷刺激BEAS-2B细胞氧化应激的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2962

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (2): 286-291.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2962

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黄芩苷对脂多糖联合三磷酸腺苷刺激BEAS-2B细胞氧化应激的影响

从人愿，袁静，夏金婵，孙颖

河南中医药大学基础医学院，河南省郑州市 450046

收稿日期:2020-03-17 修回日期:2020-03-21 接受日期:2020-04-21 出版日期:2021-01-18 发布日期:2020-11-21
通讯作者: 夏金婵，博士，副教授，河南中医药大学基础医学院，河南省郑州市 450046
作者简介:从人愿，女，1992年生，河南省平舆县人，汉族，河南中医药大学基础医学院在读硕士，主要从事中医药治疗感染性疾病相关研究
基金资助:
国家自然科学青年基金项目(81803863)；河南省科技厅科技研发专项(192102310163)；河南省高等学校青年骨干教师培养计划(2017GGJS080)；河南中医药大学2019年度研究生科研创新类项目(2019KYCX018)

Effects of baicalin on oxidative stress in BEAS-2B cells stimulated by lipopolysaccharide combined with adenosine triphosphate

Cong Renyuan, Yuan Jing, Xia Jinchan, Sun Ying

Basic Medical College of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, Henan Province, China

Received:2020-03-17 Revised:2020-03-21 Accepted:2020-04-21 Online:2021-01-18 Published:2020-11-21
Contact: Xia Jinchan, MD, Associate professor, Basic Medical College of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, Henan Province, China
About author:Cong Renyuan, Master candidate, Basic Medical College of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, Henan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China (Youth Project), No. 81803863; Special Research and Development Project of Henan Provincial Department of Science and Technology Department, No. 192102310163; Henan Provincial Young Teacher Training Program for High Educations, No. 2017GGJS080; 2019 Graduate Research and Innovation Project of Henan University of Chinese Medicine, No. 2019KYCX018

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
黄芩苷：是从传统中药黄芩的根部提取分离出的一种黄酮类化合物，具有较强的抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用。研究发现，黄芩苷可通过降低炎症因子的水平、抑制 NF-κB 信号通路的激活进而降低脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠模型的炎症反应，为临床治疗急性肺损伤提供了有力的实验依据。
氧化应激：当机体受到刺激时，自由基过度产生，氧化/抗氧化失衡，机体就会处于氧化应激状态。氧化应激被认为和机体炎症反应密切相关。研究发现，在急性肺损伤的发病机制中，脂多糖作为内毒素的主要成分，可诱导气道和肺组织中产生氧化应激反应，释放大量活性氧，进而激活TXNIP/NLRP3炎症信号通路，促进疾病的发生发展。

背景：氧化应激及炎症反应在急性肺损伤的发生发展过程中发挥了重要的作用，研究表明黄芩苷具有抗氧化、抗炎等生物活性。
目的：探讨黄芩苷对脂多糖联合三磷酸腺苷刺激人正常支气管上皮细胞BEAS-2B氧化应激和TXNIP/NLRP3通路的影响。
方法：采用脂多糖/三磷酸腺苷联合刺激BEAS-2B细胞建立炎症模型，将细胞随机分为空白对照组、模型组和黄芩苷低、中、高剂量组(2.5，5，10 mg/L)；采用MTT法检测细胞活力，ELISA法检测细胞因子白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素18和肿瘤坏死因子ɑ水平，荧光探针DCFH-DA法检测各组细胞内活性氧水平，酶标仪检测超氧化物歧化酶和丙二醛水平，实时荧光半定量PCR检测TXNIP、NLRP3、ASC、Caspase-1、白细胞介素1β和白细胞介素18 mRNA的表达水平，Western blot检测细胞中TXNIP、Caspase-1、NLRP3蛋白表达量。
结果与结论：与空白对照组相比，模型组细胞内活性氧和丙二醛水平升高，超氧化物歧化酶活性降低，细胞活力下降，细胞因子白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素18、肿瘤坏死因子ɑ的分泌量和TXNIP、NLRP3、ASC、Caspase-1、白细胞介素1β、白细胞介素18的基因表达量以及TXNIP、Caspase-1、NLRP3蛋白表达量均显著升高。与模型组比较，黄芩苷组可显著逆转上述指标，且呈浓度依赖性。结果表明，黄芩苷可通过减轻氧化应激反应，进而抑制TXNIP/NLRP3炎症通路的激活，来发挥其对脂多糖/三磷酸腺苷联合诱导BEAS-2B细胞损伤的保护作用。

https//orcid.org/0000-0002-1310-6213(从人愿)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 黄芩苷, 支气管, 上皮细胞, BEAS-2B细胞, 氧化应激, 炎症, 通路, 因子

Abstract: BACKGROUND: Oxidative stress and inflammatory reaction play important roles in the occurrence and development of acute lung injury. Studies have shown that baicalin has biological activities such as antioxidant and anti-inflammatory.
OBJECTIVE: To investigate the effects of baicalin on oxidative stress and TXNIP/NLRP3 pathway in BEAS-2B cells induced by lipopolysaccharide combined with adenosine triphosphate.
METHODS: The inflammatory model of BEAS-2B cells was established by lipopolysaccharide combined with adenosine triphosphate stimulation. The cells were randomly divided into blank control group, model group and baicalin group (2.5, 5, and 10 mg/L). MTT method was used to detect the cell vitality. ELISA was used to detect the levels of interleukin-1β, interleukin-6, interleukin-18 and tumor necrosis factor-ɑ. The changes of intracellular reactive oxygen species, superoxide dismutase and malondialdehyde were measured by fluorescent probe DCFH-DA and microplate reader, respectively. qRT-PCR was used to detect the mRNA expression levels of TXNIP, NLRP3, ASC, Caspase-1, interleukin-1β and interleukin-18. Western blot was used to detect the protein expression of TXNIP, Caspase-1 and NLRP3 in the cells.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the blank control group, intracellular reactive oxygen species and malondialdehyde levels were significantly increased in the model group, while the activity of superoxide dismutase and cell viability were significantly decreased. There was a significant increase in the secretion levels of interleukin-1β, interleukin-6, interleukin-18, tumor necrosis factor-ɑ as well as the gene expression levels of TXNIP, NLRP3, ASC, Caspase-1, interleukin-1β, interleukin-18 and the protein expression levels of TXNIP, Caspase-1 and NLRP3 in the model group compared with the blank control group. Baicalin could considerably reverse the above indicators in a concentration-dependent manner. To conclude, baicalin has a protective effect on the damage in BEAS-2B cells stimulated by lipopolysaccharide combined with adenosine triphosphate, by reducing oxidative stress and inhibiting the activation of the TXNIP/NLRP3 signaling pathway.

Key words: baicalin, bronchus, epithelial cell, BEAS-2B cell, oxidative stress, inflammation, pathway, factor

中图分类号:

从人愿, 袁静, 夏金婵, 孙颖. 黄芩苷对脂多糖联合三磷酸腺苷刺激BEAS-2B细胞氧化应激的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 286-291.

Cong Renyuan, Yuan Jing, Xia Jinchan, Sun Ying . Effects of baicalin on oxidative stress in BEAS-2B cells stimulated by lipopolysaccharide combined with adenosine triphosphate[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(2): 286-291.

图/表（结果） 6

2.1 不同质量浓度黄芩苷对BEAS-2B细胞活力的影响不同质量浓度黄芩苷溶液处理细胞24 h，MTT法检测各组细胞活力，见图1。与空白对照组相比，黄芩苷在给药质量浓度为0-10 mg/L时对细胞活力无明显抑制作用，因此后续实验选取黄芩苷质量浓度分别为2.5，5，10 mg/L作为受试质量浓度进行下一步实验研究。

2.2 黄芩苷对脂多糖/三磷酸腺苷刺激下BEAS-2B细胞活力的影响 MTT法检测各组不同处理后细胞的活力，见图2。与空白对照组比较，模型组细胞活力有所下降；与模型组比较，黄芩苷低、中、高剂量组均可有效增加细胞活力，且呈剂量依赖性，其中黄芩苷高剂量组对细胞活力的影响最为明显。

2.3 黄芩苷对脂多糖/三磷酸腺苷刺激下BEAS-2B细胞上清中炎症因子水平的影响与空白对照组比较，模型组细胞上清中的炎症因子白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和白细胞介素18的分泌量明显增高；与模型组比较，黄芩苷低、中、高剂量组均可显著降低细胞上清液中的炎症因子分泌量(P < 0.01)，且黄芩苷的质量浓度越高，炎症因子分泌量越低，见表2。

2.4 黄芩苷对脂多糖/三磷酸腺苷刺激下BEAS-2B细胞中活性氧、丙二醛水平和超氧化物歧化酶活性的影响与空白对照组比较，模型组细胞中活性氧和丙二醛水平增高，超氧化物歧化酶活性降低；与模型组比较，黄芩苷低、中、高剂量组均可显著降低细胞中活性氧和丙二醛水平，提升超氧化物歧化酶活性，且呈剂量依赖性，见表3。

2.5 黄芩苷对脂多糖/三磷酸腺苷刺激下BEAS-2B细胞中TXNIP、NLRP3、ASC、Caspase-1、白细胞介素1β和白细胞介素18 mRNA表达的影响与空白对照组比较，脂多糖/三磷酸腺苷联合刺激后细胞中的TXNIP、NLRP3、ASC、Caspase-1、白细胞介素1β和白细胞介素18的基因表达水平均显著升高；用不同质量浓度黄芩苷干预后，黄芩苷低、中、高剂量组均可显著下调TXNIP、NLRP3、ASC、Caspase-1、白细胞介素1β和白细胞介素18基因的表达水平，且下调程度与黄芩苷质量浓度呈剂量依赖性，见图3。

2.6 黄芩苷对脂多糖/三磷酸腺苷刺激下BEAS-2B细胞中TXNIP、Caspase-1、NLRP3蛋白表达的影响与空白对照组相比，模型组细胞中TXNIP、Caspase-1、NLRP3蛋白表达均升高；与模型组相比，黄芩苷低、中、高剂量组细胞TXNIP、Caspase-1、NLRP3的蛋白表达均显著降低，且呈剂量依赖性，见图4。

参考文献

[1] LI L, ZHANG YG, TAN YF, et al. Tanshinone II is a potent candidate for treatment of lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rat model. Oncol Lett. 2018;15(2):2550-2554.
[2] TANG B, LI X, REN Y, et al. MicroRNA-29a regulates lipopolysaccharide (lps)-induced inflammatory responses in murine macrophages through the Akt1/ NF-κb pathway. Exp Cell Res. 2017; 360(2):74-80.
[3] PENG LY, YUAN M, SONG K, et al. Baicalin alleviated APEC-induced acute lung injury in chicken by inhibiting NF-κB pathway activation. Int Immunopharmacol. 2019; 72:467-472.
[4] ZHI HJ, ZHU HY, ZHANG YY, et al. In vivo effect of quantified flavonoids-enriched extract of Scutellaria baicalensis root on acute lung injury induced by influenza A virus. Phytomedicine. 2019; 57:105-116.
[5] CHEN XB, SU HW, LIU HX, et al. Anti-inflammatory and analgesic effects of Bi-yuan-ling granules. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 2016; 36(3): 456-462.
[6] DING XM, PAN L, WANG Y, et al. Baicalin exerts protective effects against lipopolysaccharide-induced acute lung injury by regulating the crosstalk between the CX3CL1-CX3CR1 axis and NF-kappaB pathway in CX3CL1-knockout mice. Int J Mol Med. 2016; 37(3):703-715.
[7] ZHANG X, SUN CY, ZHANG YB, et al. Kegan Liyan oral liquid ameliorates lipopolysaccharide-induced acute lung injury through inhibition of TLR4-mediated NF-kappaB signaling pathway and MMP-9 expression. J Ethnopharmacol. 2016; 186: 91-102.
[8] SHU S, XU Y, XIE L, et al. The role of C/EBPbeta phosphorylation in modulating membrane phospholipids repairing in LPS-induced human lung/bronchial epithelial cells. Gene. 2017; 629:76-85.
[9] CABRERA-BENITEZ NE, PÉREZ-ROTH E, CASULA M, et al. Anti-inflammatory activity of a novel family of aryl ureas compounds in an endotoxin-induced airway epithelial cell injury model. PLoS One. 2012; 7(11): e48468.
[10] KOYAMA S, SATO E, NOMURA H, et al. The potential of various lipopolysaccharides to release monocyte chemotactic activity from lung epithelial cells and fibroblasts. Eur Respir J. 1999; 14(3): 545-552.
[11] YEH CH, CHO W, SO EC, et al. Propofol inhibits lipopolysaccharide-induced lung epithelial cell injury by reducing hypoxia-inducible factor-1alpha expression. Br J Anaesth. 2011; 106(4): 590-599.
[12] FANG XZ, GE YL, CHEN ZY, et al. NecroX-5 alleviate lipopolysaccharide-induced acute respiratory distress syndrome by inhibiting TXNIP/NLRP3 and NF-kappaB. Int Immunopharmacol. 2020; 81: 106257.
[13] JIANG L, FEI D, GONG R, et al. CORM-2 inhibits TXNIP/NLRP3 inflammasome pathway in LPS-induced acute lung injury. Inflamm Res. 2016; 65(11): 905-915.
[14] REN Y, YANG Z, SUN Z, et al. Curcumin relieves paraquatinduced lung injury through inhibiting the thioredoxin interacting protein/NLR pyrin domain containing 3mediated inflammatory pathway. Mol Med Rep. 2019; 20(6): 5032-5040.
[15] ZHOU R, YAZDI AS, MENU P, et al. A role for mitochondria in NLRP3 inflammasome activation. Nature. 2011; 469(7329):221-225.
[16] BROZ P, DIXIT VM. Inflammasomes: mechanism of assembly, regulation and signalling. Nat Rev Immunol. 2016; 16(7): 407-420.
[17] MAO X, YU CR, LI WH, et al. Induction of apoptosis by shikonin through a ROS/JNK-mediated process in Bcr/Abl-positive chronic myelogenous leukemia (CML) cells. Cell Res. 2008;18(8):879-888.
[18] QIU H, LIU W, LAN T, et al. Salvianolate reduces atrial fibrillation through suppressing atrial interstitial fibrosis by inhibiting TGF-beta1/Smad2/3 and TXNIP/NLRP3 inflammasome signaling pathways in post-MI rats. Phytomedicine. 2018; 51:255-265.
[19] ZHAI H, KANG Z, ZHANG H, et al. Baicalin attenuated substantia nigra neuronal apoptosis in Parkinson’s disease rats via the mTOR/AKT/GSK-3β pathway. J Integr Neurosci. 2019; 18(4):423-429.
[20] HUANG Y, SUN M, YANG X, et al. Baicalin relieves inflammation stimulated by lipopolysaccharide via upregulating TUG1 in liver cells. J Physiol Biochem. 2019;75(4):463-473.
[21] 潘聪,李占东,苑鹏.高核苷酸酵母水解物对脂多糖诱导RAW264.7细胞免疫调节的影响[J].食品与发酵工业, 2019, 45(7): 8-14.
[22] LIU X, MENG J. Tanshinone IIA ameliorates lipopolysaccharide-induced inflammatory response in bronchial epithelium cell line BEAS-2B by down-regulating miR-27a. Biomed Pharmacother. 2018;104:158-164.

引言

材料方法

1.1 设计细胞学实验观察。
1.2 时间及地点实验于2018年11月至2019年11月在河南中医药大学基础医学院科研实验中心和中医内科重点开放实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞株人正常支气管上皮细胞株BEAS-2B购于中国科学院上海生命科学院研究院细胞资源中心。在37 ℃、体积分数为5%CO2条件下，用含体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM高糖培养基培养，用0.25%胰酶消化液(含EDTA)消化、传代。实验所用细胞均处于对数生长期。
1.3.2 药物和试剂黄芩苷(上海麦克林公司，纯度95%，批号B802696)；DMEM高糖培养基(Solarbio公司，批号20190905)；胎牛血清(BI公司，批号04-001-1A)；胰蛋白酶(Solarbio公司，批号T1350)；脂多糖(来源于大肠杆菌，批号L2880，Sigma公司)；三磷酸腺苷溶液(Solarbio公司，批号20191101)；噻唑蓝(Solarbio公司，批号M8180)；PBS(Solarbio公司，批号20191125)；二甲基亚砜(批号D8371，Sigma公司)；肿瘤坏死因子α检测试剂盒(批号EHC103a)、白细胞介素1β检测试剂盒(批号EHC002b)、白细胞介素6检测试剂盒(批号EHC007)均购自欣博盛生物科技有限公司；活性氧检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；超氧化物歧化酶活性检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；丙二醛检测试剂盒(苏州科铭生物科技有限公司)。药物黄芩苷、脂多糖在临用前用细胞培养液稀释至所需浓度，过滤除菌备用。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞培养人正常支气管上皮细胞系BEAS-2B用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM高糖培养基置于37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱中静置培养，隔天用无菌PBS对细胞润洗2遍后更换新鲜培养液，待细胞生长至对数期时，用0.25%胰酶消化液(含EDTA)消化，每3 d按1∶3比例传代。将细胞传至3代，观察细胞状态稳定后用于实验研究，所有操作均按照无菌操作标准执行。
1.4.2 实验分组取生长至对数期且状态良好的细胞，倒掉上清液，用PBS轻轻润洗2遍，加入0.25%胰酶消化液(含EDTA)消化，观察细胞变圆漂浮时加入新鲜培养基终止消化，重悬离心后对细胞进行计数。MTT实验中细胞以5×103个/孔接种于96孔板中；ELISA、qRT-PCR、蛋白质印迹实验以及氧化相关指标检测实验中细胞以1×105个/孔接种于6孔板中。待细胞贴壁后继续培养12 h，将细胞随机分成5组：空白对照组(含体积分数为10%胎牛血清的培养基)、模型组(10 mg/L脂多糖+5 mmol/L三磷酸腺苷)、黄芩苷低剂量组(黄芩苷2.5 mg/L)、黄芩苷中剂量组(黄芩苷5 mg/L)和黄芩苷高剂量组(黄芩苷10 mg/L)。黄芩苷低、中、高剂量组先加入不同质量浓度的黄芩苷溶液预处理，空白对照组和模型组细胞均加入等体积的含血清培养基，培养3 h后，除空白对照组外，其他组均加入脂多糖使终质量浓度达到10 mg/L，继续培养24 h后再加入三磷酸腺苷溶液使终浓度达到5 mmol/L，空白对照组加入等体积的含血清培养基，在37 ℃，体积分数为5%CO2恒温箱中共同培养30 min，取细胞或细胞上清检测相关指标。
1.4.3 MTT法检测不同质量浓度黄芩苷对各组细胞活力的影响取生长状态良好的对数期细胞，吸弃上清液，用PBS润洗2遍，尽量去除孔内液体，制成细胞浓度为5×107 L-1的细胞悬液，接种至96孔板，每孔100 μL，每组设6个复孔。检测不同质量浓度黄芩苷对细胞活力的影响时，待细胞贴壁后弃去上清液，分别加入不同质量浓度的黄芩苷溶液(0，2.5，5，7.5，10，12.5，15，17.5，20 mg/L)处理细胞24 h；检测脂多糖/三磷酸腺苷刺激后黄芩苷对细胞活力的影响时，按1.4.2对细胞进行分组处理。将处理后的细胞每孔加入 5 g/L的MTT溶液20 μL，避光操作，继续培养4 h后吸弃上清，尽量去除孔内液体，每孔加入150 μL二甲基亚砜振荡10 min，使结晶物充分溶解。采用酶联免疫检测仪在波长570 nm和参比波长630 nm下检测各孔吸光度值，记录结果。细胞活力(%)=实验组细胞吸光度值/空白组细胞吸光度值×100%。
1.4.4 酶联免疫吸附法测定细胞上清中肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素1β、白细胞介素18水平取生长状态良好的对数期细胞，按1.4.2对细胞进行处理后，收集细胞上清液，4 ℃，2 000 r/min离心5 min后吸取上清液转移至新的EP管中，具体方法严格按照试剂盒说明书进行操作，包被液稀释抗原，封板膜封板后于37 ℃恒温孵育1.5 h；每孔加入100 μL生物素化抗体，封板膜封板后于37 ℃恒温孵育1 h；每孔加入100 μL酶结合物，封板膜封板后于37 ℃恒温避光孵育30 min；接着每孔加入100 μL显色底物继续孵育15 min，加入终止液，充分混匀，待颜色由蓝色变为黄色，于酶标仪450 nm处进行检测，绘制标准曲线并计算各炎症因子水平。
1.4.5 细胞内活性氧水平测定实验采用DCFH-DA作为活性氧探针，按1.4.2对细胞进行分组处理后，吸弃培养液，温PBS润洗2次，加入1 mL稀释过的DCFH-DA(1∶1 000)，37 ℃避光孵育20 min，细胞用0.25%胰酶消化1 min，加入含血清培养基终止消化，制成细胞悬液，1 000 r/min离心5 min收集细胞。将收集好的细胞沉淀物重悬，用荧光酶标仪检测荧光强度(激发光波长500 nm，发射光波长525 nm)，重复6次。
1.4.6 细胞中超氧化物歧化酶、丙二醛水平测定取生长状态良好的对数期细胞，按1.4.2进行分组处理后，PBS润洗2次，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，将细胞混悬于裂解液，冰上放置30 min，4 ℃、12 000×g离心10 min，收集细胞裂解液。按照试剂盒说明书所述步骤操作后检测吸光度值，并绘制标准曲线，根据标准曲线计算超氧化物歧化酶、丙二醛水平。
1.4.7 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞内TXNIP、NLRP3、ASC、Caspase-1、白细胞介素1β和白细胞介素18 mRNA的表达量按照Trizol试剂说明书提取各组细胞总RNA，于紫外分光光度计检测所提RNA浓度及纯度，确保A260 nm/A280 nm在1.8-2.0为合格。按照反转录试剂盒说明，以42 ℃，60 min/80 ℃，10 min为反应条件将RNA为模版反转录成cDNA，反转录体系总体积为20 μL。以cDNA为模版扩增目的基因，反应体系总体积为5 μL(引物3 μL，cDNA 2 μL)。扩增结束后，由电脑自动生成标准曲线、熔解曲线及荧光扩增曲线，分析数据。各基因的引物及长度，见表1。

1.4.8 Western blot法检测细胞内TXNIP、Caspase-1、NLRP3蛋白表达量细胞按1.4.2处理后，PBS润洗2遍，用0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞，加入RIPA裂解液4 ℃ 12 000 r/min离心15 min提取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。制备聚丙烯酰氨凝胶，每个样本取50 μg至对应上样孔中，75 V/120 V恒压电泳后转至PVDF膜；300 mA恒流转膜30 min，5%脱脂奶粉溶液封闭1 h；加入一抗4 ℃孵育过夜，1×TBST洗涤3次，每次10 min；加入二抗孵育1 h，1×TBST洗涤3次，每次10 min；超敏发光液显影曝光摄取，Bio-Rad软件分析蛋白条带灰度值。
1.5 主要观察指标 ①黄芩苷干预细胞炎症模型的最佳质量浓度；②荧光探针DCFH-DA法检测各组细胞内活性氧水平，酶标仪检测超氧化物歧化酶和丙二醛水平；③qRT-PCR法检测通路相关基因的表达水平；④ELISA法检测各组细胞炎症因子水平；⑤Western blot 检测各组TXNIP、NLRP3和Caspase-1蛋白的表达。
1.6 统计学分析采用SPSS 15.0软件，计量资料以x±s表示，进行单因素方差分析(ONE-WAYANOVA)，组间比较采用Dunnett检验，用GraphPad Prism 8.0软件作图，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

急性肺损伤是临床危急重症，病死率极高，且目前治疗手段有限。因此深入认识该疾病的发生发展过程并探讨其发病机制至关重要。在急性肺损伤的发病机制中，革兰阴性菌细胞壁外膜来源的脂多糖作为内毒素的主要成分，可诱导气道和肺组织中产生氧化胁迫，释放大量活性氧，过度积累的活性氧会引起TXNIP释放[12]。TXNIP是机体内重要的氧化应激因子，主要表达于肺泡上皮细胞和肺间质细胞[13]。有报道称三磷酸腺苷等炎性小体激活剂可诱导TXNIP从硫氧还蛋白中解离，使其与NLRP3结合，两者相互作用形成高度活化的炎性体复合物[14]，进一步活化半胱氨酸蛋白酶1前体(Pro-Caspase-1)，被激活的Caspase-1可以对细胞因子前体Pro-IL-1β和Pro-IL-18进行切割，产生成熟的白细胞介素1β和白细胞介素18，继而分泌到胞外，引发强烈的炎症反应，促进急性肺损伤的发生发展[15-18]。
黄芩苷是中药黄芩的主要活性成分，具有较强的抗炎、抗氧化等作用[19-20]。研究发现黄芩苷可通过降低炎症因子水平、抑制NF-κB信号通路的激活进而降低脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠模型的炎症反应[6]。但目前黄芩苷对人支气管上皮细胞BEAS-2B中由氧化应激引起的TXNIP/NLRP3信号通路活化的研究尚未见报道，因此该实验采用脂多糖/三磷酸腺苷联合诱导BEAS-2B细胞建立体外炎症模型，研究黄芩苷对其氧化应激和炎症损伤的影响。首先采用MTT法检测了不同质量浓度黄芩苷(0，2.5，5，7.5，10，12.5，15，17.5，20 mg/L)对BEAS-2B细胞活力的影响，结果显示当质量浓度小于10 mg/L时，黄芩苷对BEAS-2B细胞几乎无毒性作用，为排除黄芩苷对BEAS-2B细胞释放炎症因子的作用与其对细胞毒性作用有关，故选择对细胞活力无显著性影响的3个质量浓度(2.5，5，10 mg/L)进行后续实验。通过检测细胞活力、促炎细胞因子的产生以及通路相关蛋白的表达来评估脂多糖/三磷酸腺苷联合诱导BEAS-2B细胞建立的炎症模型[21-22]，结果显示：与空白对照组比较，脂多糖/三磷酸腺苷联合刺激后细胞活力下降了近30%，细胞上清中炎症因子白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和白细胞介素18水平均显著增加，通路相关蛋白TXNIP、NLRP3、Caspase-1的表达量也显著升高，这表明体外炎症模型构建成功。活性氧是一种自由基，正常情况下机体产生和清除自由基的动态平衡是一种有效的抗氧化防御体系，它可以生理性的将自由基的浓度稳定在低水平状态。当自由基过度产生时氧化/抗氧化失衡，机体就会处于氧化应激状态；丙二醛是一种脂质过氧化产物，当机体不能及时清除过量的活性氧时，质膜发生脂质过氧化会产生丙二醛，损伤细胞结构和功能，活性氧和丙二醛水平可反映细胞受氧化损伤的程度。为探究黄芩苷对细胞模型氧化损伤的影响，检测了细胞内活性氧和丙二醛水平。研究结果显示：与空白对照组相比，脂多糖联合三磷酸腺苷刺激后细胞内活性氧和丙二醛水平均升高，而黄芩苷低、中、高剂量组均可显著降低活性氧和丙二醛水平，且降低程度与黄芩苷的剂量呈依赖性。超氧化物歧化酶是一种抗氧化酶，可清除自由基，降低氧化损伤对细胞的危害，从而发挥对细胞的保护作用，实验结果也表明脂多糖联合三磷酸腺苷刺激后细胞内超氧化物歧化酶活性较空白对照组细胞降低了近50%，而黄芩苷低、中、高剂量组均可显著增加细胞中超氧化物歧化酶活性，所以黄芩苷可以减少炎症细胞中的氧化应激反应。与模型组比较，黄芩苷预处理组的细胞活力上升，且高剂量的黄芩苷对细胞活力的影响最大。细胞上清液中炎症因子水平均下降，这说明黄芩苷对脂多糖/三磷酸腺苷联合刺激BEAS-2B细胞造成的炎症反应有保护作用，可能是通过增加细胞活力，抑制炎症因子的释放来实现的。细胞中的活性氧可以通过TXNIP激活NLRP3炎症小体，影响炎症因子白细胞介素1β、白细胞介素18的分泌，通过Western Blot、RT-qPCR检测了通路相关蛋白和基因的表达，结果发现：与空白对照组比较，模型组细胞中TXNIP、NLRP3、ASC、Caspase-1、白细胞介素1β、白细胞介素18的基因表达量和TXNIP、NLRP3、Caspase-1的蛋白表达量均明显升高，而黄芩苷组可显著逆转上述指标。
综上所述，脂多糖/三磷酸腺苷共同作用于BEAS-2B细胞可引起氧化应激反应和炎症损伤，激活TXNIP/NLRP3信号通路，促进炎症因子释放。黄芩苷对炎症细胞模型的保护作用与其降低细胞中氧化应激反应，抑制TXNIP/NLRP3信号通路的激活，从而减少白细胞介素1β等细胞因子的释放有关。黄芩苷调控TXNIP/NLRP3这一信号通路在急性肺损伤中的具体作用机制及对肺组织的影响还需通过动物模型进一步研究，但是该实验从细胞学角度丰富了黄芩苷的抗炎、抗氧化机制，为黄芩苷通过调控TXNIP/NLRP3信号通路治疗急性肺损伤提供了新的实验依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

黄芩苷对脂多糖联合三磷酸腺苷刺激BEAS-2B细胞氧化应激的影响

Effects of baicalin on oxidative stress in BEAS-2B cells stimulated by lipopolysaccharide combined with adenosine triphosphate

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[1]	孔亚敏, 严隽陶, 马丙祥, 李华伟. 推拿振法干预坐骨神经损伤模型大鼠MyoD表达及肌卫星细胞的增殖与分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1160-1166.
[2]	吴聪, 贾全忠, 刘伦. 成年关节软骨碎块化后转化生长因子β1表达与软骨细胞迁移的关系[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1167-1172.
[3]	王宝娟, 郑曙光, 张琪, 李田洋. 苗药熏蒸治疗膝骨关节炎模型兔可延缓细胞外基质的破坏[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1180-1186.
[4]	王琴, 沈呈, 廖静, 杨烨. 达格列净干预改善糖尿病肾病模型大鼠的肾脏损伤[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1216-1222.
[5]	项鑫健, 柳芳, 吴亮亮, 贾大平, 陶越, 赵政男, 赵宇. 高剂量维生素C促进大鼠自体脂肪移植成活[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1242-1246.
[6]	肖阳, 龚立琼, 费静, 李雷激. 电针干预面神经损伤模型兔面神经核团中神经生长因子及其受体的表达[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1253-1259.
[7]	唐文静, 伍思源, 杨晨, 陶希. 炎症反应与卒中后抑郁[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1278-1285.
[8]	安维政, 何萧, 任帅, 刘建宇. 肌源干细胞在周围神经再生中的潜力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1130-1136.
[9]	高俞锦, 彭双麟, 马治超, 陆诗, 曹花月, 王浪, 肖金刚. 糖尿病骨质疏松症模型小鼠脂肪干细胞的成骨能力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 999-1004.
[10]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[11]	王继芳, 鲍祯, 乔亚红. miR-206调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因表达及细胞生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1027-1031.
[12]	刘峰, 彭宇环, 罗良平, 吴本清. 植物源性碱性成纤维细胞生长因子维持人胚胎干细胞的生长与分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1032-1037.
[13]	罗小玲, 张丽, 杨茂桦, 徐洁, 徐晓梅. 柚皮素干预人牙周膜干细胞的成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1051-1056.
[14]	张玉杰, 杨建东, 蔡俊, 朱守雷, 田原. 大蒜素抑制大鼠血管内皮细胞增殖并诱导其凋亡的机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1080-1084.
[15]	彭坤. 骨质疏松性骨折治疗效果的改善：研究现状及策略分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(6): 980-984.