2.1  人骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞的培养与鉴定  人骨髓间充质干细胞培养7 d后，在倒置显微镜下观察贴壁细胞呈集落状分布，呈涡旋状排列，细胞体为较细窄的均一长梭形，排列有规律性和方向性，增殖迅速，见图1A。人脐静脉内皮细胞为贴壁单层生长，成卵圆形或铺路石样排列，边界清楚，包浆丰富，胞核清晰可见，见图1D。

流式细胞仪鉴定结果表明人骨髓间充质干细胞表达CD90、CD105和CD34，阳性率分别为5.87%，44.13%和12.65%；低表达CD14、CD31、CD45、CD144、VEGFR2、vWF，分别为0.2%，0.98%，0.24%，0.16%，0.3%，0.83%，见图2。人脐静脉内皮细胞高表达CD105和CD144，分别为99.54%和99.55%，中等表达CD31、CD34、VEGFR2、vWF，分别为70.71%，14.92%，29.94%和46.28%，低表达CD14和CD45，分别为0.68%和0.29%，见图3。

2.2  诱导后人骨髓间充质干细胞形态与免疫表型表达  共培养诱导14 d后，人骨髓间充质干细胞在镜下的形态发生改变，失去细长的梭形和漩涡状的形状，接近铺路石样改变，但较内皮细胞形态仍有不同，见图1C。

流式细胞仪鉴定细胞免疫表型结果显示，CD31表达为0.78%，基本未见明显变化。然而CD144、VEGFR2和vWF的表达变化明显，其中CD144表达增加明显，为66.31%，VEGFR2阳性率增加，为8.17%，vWF阳性率稍有增加，为4.13%，见图4。

2.3  诱导后人骨髓间充质干细胞免疫荧光检测结果  通过细胞免疫荧光和荧光强度分析，诱导14 d后血管内皮特异性抗原CD31和CD144表达明显高于对照组(P < 0.05)，见图5；VEGFR2和vWF表达高于对照组(P < 0.05)，见图6，该结果和流式结果具有一致性；凝集素UEA-1表达同样高于对照组(P < 0.05)，见图7。

2.4  Matrigel 体外成管实验结果  在倒置显微镜下对照组细胞呈散在分布，未形成明显管状和条索状结构，见图8A，诱导14 d的细胞可见少量独立条索状结构，但管状形成能力并不完全，见图8B，不及人脐静脉内皮细胞管状形成能力和数量，见图8C。

2.5  体内成血管移植物苏木精-伊红染色结果  对照组细胞呈弥散分布，未见明显管状结构，诱导后人骨髓间充质干细胞具有一定血管形成能力，但血管结构不完整，未见红细胞灌注，见图9。

缺血性疾病(如冠状动脉粥样硬化性心脏病、骨科缺血性疾病等)是一类严重影响人们生活质量甚至威胁生命的疾病，血管再生是治疗此类疾病的关键^[1-2]。此外，血管再生也是组织修复、组织移植、外科修复重建成功的关键因素之一。间充质干细胞属于多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，包括多向分化和自我更新能力^[2-5]，由于其可分化的组织种类广泛多样，低免疫原性，因此具有相当高的临床应用价值^[6]。研究中诱导间充质干细胞向骨组织、软骨组织和脂肪组织分化较为多见，但也有研究表明间充质干细胞在适当情况下能向内皮细胞转化，并有形成血管的可能^[7]。  

间充质干细胞向内皮细胞分化的过程受多种因素影响，目前其机制仍有待深入研究。除了生长因子诱导分化外，有文献表明在非接触共培养方式下，两种细胞可进行信号分子的联系与信息交换，内皮细胞可以诱导间充质干细胞在一定程度上向内皮细胞分化^[8-9]。研究表明，细胞热休克方法可以促进细胞共培养下的分化能力^[10-12]。间充质干细胞作为未分化的干细胞，在利用内皮细胞诱导其分化过程中，内皮细胞具有双向作用，一种作用是内皮细胞为间充质干细胞成骨分化提供营养^[13-15]，另一种作用是内皮细胞分泌的血管内皮生长因子等细胞因子可以影响间充质干细胞的骨向分化^[16-17]。该研究探讨诱导人骨髓来源间充质干细胞分化为内皮细胞的可行性，为临床治疗缺血性疾病提供可行性依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1  设计  体外细胞学观察实验。

1.2  时间及地点  2018年3月至2019年3月在广西医科大学科技楼和实验动物中心完成。

1.3  材料  4-6周龄BALB/c裸鼠12只，体质量18-22 g，雌雄不限，由广西医科大学实验动物中心提供。实验过程中对实验动物处理符合动物伦理学标准。

人骨髓来源间充质干细胞(丰晖公司)；人脐静脉内皮细胞(Sciencell公司)；DMEM培养基、胎牛血清、Dulbecco's磷酸缓冲盐溶液(Gibco公司)、0.05%含EDTA的胰蛋白酶(索来宝公司)；内皮细胞培养基(Sciencell公司)；PE标记的CD31、CD144、VEGFR2、vWF抗体(Abcam公司)；FITC标记的CD105、CD90、CD34、CD45、CD14抗体(CST公司)；Anti-CD31抗体、CD144抗体、vWF抗体、FITC-UEA-1抗体(赛默飞公司)；VEGFR2、山羊抗兔IgG抗体(CST公司)；DAPI染液(索来宝公司)；Matrigel基质胶(美国BD公司)。

1.4  实验方法

1.4.1  人骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞的培养和鉴定  人骨髓来源间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞镜下观察生长至90%后加入胰酶消化，DPBS洗两三次，加入DPBS吹打成细胞悬液，控制细胞密度为1×10¹⁰ L^-1，在100 μL体系下加入10-20 μL的FITC-CD105，FITC-CD90，FITC-CD34，FITC-CD45，FITC-CD14，PE-CD31，PE-VEGFR2，PE-CD144，PE-vWF，冰上避光孵育     30 min，1 000 r/min离心后弃上清，DPBS清洗2次，最后用PBS配成500 μL的细胞悬液，过滤去除细胞团块后上流式细胞仪检测，用IgG1-FITC和IgG1-PE做同型对照。

1.4.2  热休克人脐静脉内皮细胞与人骨髓间充质干细胞体外共培养  人脐静脉内皮细胞培养至70%-80%融合后，用0.05%胰蛋白酶消化，离心，PBS清洗，加入内皮细胞完全培养基吹打成细胞悬液，将离心管置于42 ℃水浴中 1 h，造成内皮细胞体外热休克状态，然后以1×10⁵的密度接种于6孔Transwell上层培养室。人骨髓来源间充质干细胞培养至80%融合时用胰蛋白酶消化，以5×10⁴的密度接种于6孔培养板底部培养，形成非接触共培养模式，放入37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱内培养，于7 d和14 d后观察细胞形态。

1.4.3  诱导的人骨髓间充质干细胞表型鉴定  收集诱导14 d后的人骨髓间充质干细胞，用流式细胞仪检测细胞免疫表型抗原CD31、CD144、VEGFR2、vWF的表达情况。

1.4.4  细胞免疫荧光鉴定诱导的人骨髓间充质干细胞表型表达  诱导14 d后，PBS清洗细胞，向孔内加入40 g/L多聚甲醛1 mL固定20 min，吸去多聚甲醛并用PBS洗3次，在孔内加入0.5%Triton X-100(PBS配制)，室温下通透   20 min；用5%BSA封闭2 h，吸去封闭液，向每孔滴加CD31、CD144、VEGFR2、vWF一抗，4 ℃湿盒内孵育过夜，吸去一抗，PBS洗细胞3次；向孔内滴加稀释后的二抗，室温避光孵育1 h，吸去二抗，PBS洗3次；滴加DAPI，避光孵育5-10 min；荧光显微镜下观察结果，用Image J软件分析累计吸光度值(IOD值)。

1.4.5  体外Matrigel成血管实验  在预冷的96孔板中每孔加入50 μL Matrigel，置37 ℃孵育30 min，对照组细胞(未诱导的人骨髓间充质干细胞)、诱导后14 d的人骨髓间充质干细胞、人脐静脉内皮细胞按1×10⁴密度接种，24 h后在倒置显微镜下观察血管形成情况，Image J软件分析血管长度。

1.4.6  体内成血管实验  取诱导14 d的人骨髓间充质干细胞、未诱导的人骨髓间充质干细胞(对照组)分别重悬在Matrigel中，以300 μL(含3×10⁶细胞)移植到裸鼠背部皮下。14 d后，取出移植物并用40 g/L多聚甲醛固定1 h，继续用4 g/L多聚甲醛固定过夜，石蜡包埋，行组织切片和苏木  精-伊红染色，在显微镜下观察结果。

1.5  主要观察指标  ①诱导后骨髓间充质干细胞的形态变化和结构变化；②分化细胞的免疫表型表达；③分化细胞的体外血管形成能力；④分化细胞的体内血管形成能力。

1.6  统计学分析  采用SPSS 22.0软件进行统计分析，计量数据以x(_)±s表示，两组间均数的比较用独立样本t 检验，多组间均数比较用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

间充质干细胞起源于中胚层发育早期，广泛存在于各结缔组织和器官间质，血管内皮细胞是胚胎发育早期最早分化的组织之一，理论上间充质干细胞具有分化为血管内皮细胞的能力^[9]。血管生成的过程很复杂，涉及内皮祖细胞的迁移、增殖、分化等过程^[18]。运用间充质干细胞向内皮细胞分化作为血管生成的来源是目前研究的热点，既可以促进组织工程器官坏死血管的再生，又可为组织工程器官提供血液供应，这在临床上对治疗缺血性疾病有十分重要的意义^[19]。例如对预防和治疗动脉粥样硬化、糖尿病足、下肢动脉硬化闭塞症等提供新的解决方案。

目前不同来源间充质干细胞的生物学特性及向血管内皮细胞分化的研究已取得不少进展，但该领域仍处于探索研究阶段。间充质干细胞向内皮细胞分化多用添加物进行诱导，如碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因    子^[9，18]。在细胞因子的作用下，间充质干细胞可逐渐分化为CD31、CD34、vWF、Flk-1阳性的内皮细胞，具有在立体半固体培养基中形成血管网状结构的能力。此外，有文献表明血管内皮生长因子165在共培养的骨髓间充质干细胞中明显高表达，同时神经钙黏蛋白表达增加，伴随着细胞间黏附和信号转导^[8]。综合诸多研究和文献，目前间充质干细胞向血管内皮细胞分化的能力仍不足^[20-21]，形成血管的结构还不完整，与正常血管相比，容易发生血细胞渗漏等情况，血管功能也还不完善^[12]，是否具有正常血管内皮细胞完善的收缩、屏障、抗凝和免疫功能等，还有待深入探讨。

热休克方法作为组织工程中有效方法之一，可以改变细胞特性，提高特定蛋白表达，激活特定信号通路，增强或发挥细胞的诱导作用^[22]。国内学者研究表明，通过热休克培养(加热、光照等方法)能诱导弹性蛋白表达增加，能提高FGFRs蛋白表达水平^[11]。当内源性碱性成纤维细胞生长因子水平上升时，细胞培养时血管内皮生长因子水平升高，有助于促进血管形成^[22]。热休克后细胞信号通路激活情况现在还不明确，还需进一步研究探寻。

该实验细胞鉴定中，除了CD90、CD105等标记物外，尚需阴性标记物作为辅助鉴别，比如CD19、CD14、CD34、CD66b等，如只用单一特异性标记物可能造成其他间充质干细胞亚群丢失或鉴别错误。使用多种特异性标记物可以提高鉴别能力，但会显著提高研究成本^[9]。诱导后细胞特异性标记物VEGFR2、CD144和vWF表达增多，CD31表达也有所增加，其中CD31、vWF和VEGFR2属于内皮细胞特异性标记物，说明诱导成功。在该实验中，移植形成的血管结构不完整，也未见红细胞灌注。王斯琪等^[18]国内学者在间充质干细胞促进内皮祖细胞血管形成的研究中，在移植物苏木精-伊红染色后可见血细胞灌注，血管结构和功能更加完善。GRAINGER等^[23]将人脐静脉内皮细胞分别与骨髓间充质干细胞和人肺成纤维细胞在纤维蛋白原中共移植入裸鼠皮下，研究其形成血管的完整性。结果显示在移植后第7天和第14天，骨髓间充质干细胞与人脐静脉内皮细胞共移植组血管结构中有血流灌注，未见红细胞渗漏，提示骨髓间充质干细胞可能与周细胞有类似的表型及功能，或可能向周细胞分化发挥作用^[24]，同时也能促进血管生成，维持血管结构的稳定^[25]。

血管化在骨组织工程中具有重要意义，临床上骨缺损急需骨的再生和重建^[26]，如何在成骨过程中重建血运循环至关重要。血管再生可以为骨细胞增殖分化、骨痂生成、骨组织骨化和重建提供营养^[27-29]，有利于建立生理的动态平衡，可以促进骨的愈合。有文献报道内皮细胞具有增加成骨的作用^[30-31]，这提示利用间充质干细胞和内皮细胞结合的方法可能在未来会成为骨再生和重建并治疗骨缺损的新方法，同时也为后续研究提供新的思路。

结论：热休克处理的人脐静脉内皮细胞可以诱导骨髓间充质干细胞在一定程度上向内皮细胞分化，诱导后的细胞具有一定血管形成能力。该实验为血管生成提供了一种可能的组织工程方法，可以为临床治疗缺血性疾病提供种子细胞来源。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：

血管内皮细胞：研究中一般称内皮细胞，通常指衬于心、血管和淋巴管内表面的单层扁平上皮，它形成血管的内壁。它们具有吞噬异物、细菌、坏死和衰老组织的功能，还参与机体免疫活动功能。

热休克：组织工程中一种细胞处理方法，将细胞置于42 ℃(也有文献报道为47 ℃)中1 h，造成热休克状态。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

运用间充质干细胞进行快速再血管内皮化是目前的研究热点，此举既可促进工程化器官坏死血管的再生，又可为组织工程化器官提供血液供应，同时也为临床治疗缺血性疾病开辟了崭新的思路。

血管内皮生长因子是能特异性促内皮细胞迁移、增殖及形成管腔样结构的重要刺激因子。碱性成纤维细胞生长因子对血管内皮生长因子具有非特异性促增殖作用，二者产生协同效应，能够促进间充质干细胞分化为内皮细胞和形成小管样结构，对体外诱导间充质干细胞或胚胎干细胞分化为内皮细胞具有重要的作用。研究发现，血管内皮细胞可以产生许多生长因子和细胞因子，同时具有自发形成微毛细血管的功能。基于以上特性，在组织工程骨的血管化及血管组织工程中作为种子细胞得到广泛应用。长期以来，大部分对人自体血管内皮细胞的研究多是基于人脐静脉内皮细胞。因此，应用细胞共培养方法，尤其是将骨髓间充质干细胞与内皮细胞共培养来扩增骨髓间充质干细胞数量，同时促进血管生成，可能为骨组织工程和骨再生的应用提供了一个很有前景的方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程