2.1  骨髓间充质干细胞的形态及鉴定  原代细胞在接种24 h左右即贴壁生长，经培养、传代至第3代生长情况良好，呈长梭形、鱼群样生长，见图1A；按前述方法诱导分化至3周后行茜素红染色，可见大量矿化结节，部分结节中央可见棕黑色钙结节，见图1B；成脂诱导2周后行油红O染色并观察，可见棕红色圆形脂滴呈串珠状排列，见图1C。以上结果说明所分离到的细胞为骨髓间充质干细胞。流式细胞仪检查证实绝大部分细胞CD29、CD90为阳性，CD31、CD45为阴性，见图2，说明分离得到的细胞均一性良好。

2.2  细胞黏附、增殖行为的检测  骨髓间充质干细胞在3种支架中培养后，在2 h时三者细胞黏附情况无显著差异，随时间延长，细胞的黏附效率均增加，4，8 h后AFS、AYS组细胞黏附效率仍无显著差异，而3-DPS组黏附率更高，可以认为3种材料中骨髓间充质干细胞均可良好黏附，但随时间延长，3-DPS的黏附效率高于其余两组，见图3A。继续延长培养时间，在1，3，7 d时以CCK-8法评估细胞在3种支架中的增殖情况，可以看出骨髓间充质干细胞在3种支架中均可良好增殖，在1 d时3-DPS组增殖情况差于另外两组，而在7 d时则明显优于其他两组，而AFS、AYS组在1，3，7 d时增殖情况均无明显差异，见图3B。

2.3  细胞分化行为检测  共培养3周后，骨髓间充质干细胞在3种材料表面均贴附牢固，生长状态良好。其中在AFS、AYS支架表面呈长梭形，伸展充分，见图4A，B；在3-DPS表面呈圆形，细胞与纤维之间、细胞与细胞之间均有较多树枝状的突起相互交连，还可以观察到细胞向支架材料内部长入的现象，见图4C。可见骨髓间充质干细胞在AFS、AYS材料上呈类成纤维细胞样生长，在3DPS材料上呈类软骨细胞样生长。

骨髓间充质干细胞接种到不同支架上向成软骨方向诱导3周后，相应软骨细胞表型分子的表达呈现出明显的差异；AYS、AFS组细胞中Ⅰ型胶原α1 mRNA表达水平均高于3DPS组(P < 0.05)；3DPS组Ⅱ型胶原α1、蛋白聚糖、Sox9 mRNA表达水平高于AFS、AYS组(P < 0.05)；AFS、AYS组中Ⅱ型胶原α1、蛋白聚糖、Sox9 mRNA表达水平无明显差异(P > 0.05)，见图5。

2.4  相关通路关键分子表达水平的检测  细胞接种至支架后向成软骨方向诱导3周后，3-DPS支架上骨髓间充质干细胞细胞磷酸化AKT相对表达量为1.73±0.25，磷酸化P38相对表达量为1.44±0.16，均显著高于AYS、AFS组(P < 0.05)，可见3DPS材料中骨髓间充质干细胞分化与P38和AKT磷酸化有明显相关性，见图6，7；各组ERK1/2、JNK蛋白表达水平无显著差异。

脊柱椎间盘的退变可表现为纤维环撕裂，进而出现髓核突出、椎间隙高度下降等情况^[1-3]，如此一系列解剖结构的变化会导致神经根受压、相应节段椎管狭窄等异常，并引起颈、腰腿痛及对应部位神经功能的变化^[4]。一部分椎间盘病变的患者行保守治疗不能获得理想的缓解，或病情逐渐演进，最终需行手术治疗，手术目的是摘除病变的椎间盘以完成神经根减压，现有的手术技术已可实现理想的减压，但椎间盘的修复仍不能实现。近年来随着微创技术的进步，内镜等手术方式已可通过微创方法摘除突出髓核，减压效果完全可满足临床需要，但椎间盘尤其是纤维环的修复仍无理想方法，也在一定程度上制约了微创技术的效果。

近来的研究表明，组织工程技术可构建符合纤维环力学特性的支架^[5-7]，以其为载体可以搭载种子细胞，经体外培养后再植入体内。此种方法可在纤维环缺损部位形成物理屏障，再借助种子细胞的增殖、生长与周围组织紧密连接，最终实现纤维环的生物学修复。纤维环细胞所处的生物学环境有其自身特点，如血供少、受力情况复杂等，因此其细胞表型在不同部位呈不同特点，纤维环外层的细胞类似于成纤维细胞，而内层细胞则近似于软骨细胞，两者间逐渐过渡，并无明显分界，因此在支架上搭载具有各向分化潜能的干细胞，使其在体内感受周围环境的理化性质并根据受力特点发生差异分化，形成符合所处区域结构特点的细胞，成为较为理想的修复方式。以往研究表明多种材料可用于组织工程支架的构建，支架表面拓扑结构特征对干细胞的增殖、分化等生物学行为有调节作用，但其具体机制尚不明确^[8-10]。

实验将骨髓间充质干细胞接种至3种不同结构的纳米支架中，在成软骨条件下诱导培养，通过检测相关指标证实3种支架中的干细胞确实呈现出分化差异，进一步检测Integrin-FAK信号通路下游关键分子如ERK1/2、JNK、P38、AKT等，为支架表面形貌对干细胞差异分化的调节机制提供了证据，为今后通过干预分子通路引导干细胞定向分化提供了参考依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1.1   设计  体外细胞学实验。

1.2  时间及地点  实验于2016年9月至2017年9月于解放军第二军医大学解剖学教研室再生医学研究中心实验室完成。

1.3  材料  用于构建静电纺丝支架的材料聚左旋乳酸购于迈普再生医学科技有限公司(广州，中国)，聚己内酯购于GUNZE公司(Kyoto，Japan)；明胶购于MP Biomedicals公司(CA，USA)；六氟异丙醇购于达瑞精细化学品有限公司(上海，中国)。

实验动物：雄性SD大鼠，体质量约50 g，由解放军第二军医大学动物中心提供。动物实验获得解放军第二军医大学伦理委员会批准。

实验用主要试剂和仪器：LG-DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清(Gibco，美国)；Cell counting Kit-8检测盒(Dojindo，日本)；BCA蛋白质测定试剂盒(A53225，ThermoFisher scientific，USA)；RNAiso Plus(9109，Takara，日本)；PrimeScript One Step RT试剂盒(RR037B，Takara，日本)；CO₂恒温恒湿培养箱(Thermo，美国)；超净工作台(苏州净化，中国)；倒置显微镜(Olympus，日本)；扫描电子显微镜(飞利浦，荷兰)；荧光酶标仪(Bio-Rad，美国)；电印迹设备(Tanon，中国)。

1.4  实验方法 

1.4.1  静电纺丝支架的构建  参照相关文献报道及课题组前期研究^[11]，将聚左旋乳酸/聚己内酯(质量比为75∶25)与明胶按1∶4的质量比溶于10%六氟异丙醇获得混合溶液做为原料，密封、室温条件下搅拌24 h至完全透明：①将混合液置入20 mL注射器，选取9号注射器针头并使其连接12 kV的直流电压，微量注射泵控制溶液推注速度为    2.0 mL/h，针头置于15 cm高处，以直径为5 cm的金属滚筒(转速为3 200 r/min)做为接受装置，约4 h可获得厚度约250 μm的取向纳米纤维支架(aligned nanofibrous scaffold，AFS)；②将上述混合溶液分别置入2个20 mL注射器，两注射器均选用9号针头，分别连接+12 kV和-12 kV的直流电压，两注射器针头在距离接收装置15 cm高处相对而置；溶液推注速度保持在2.0 mL/h，接收装置为直径15 cm、转速300 r/min的金属滚筒，连续纺制约2.5 h可获得厚约250 μm的取向纳米纱支架(aligned nanoyarn scaffold，AYS)；③将聚左旋乳酸溶于六氟异丙醇制成质量体积分数为8%的溶液，将其与明胶溶液混合并搅拌均匀，将混合液置入20 mL注射器，保持5 mL/h推进速度，从连接12 kV直流电压的9号针头中喷出，在15 cm高度处以无纺布作为接收装置获得明胶/聚左旋乳酸纳米纤维支架。将3 g明胶/聚左旋乳酸纳米纤维支架剪碎，置入100 mL叔丁醇溶液，以高速匀浆机12 000 r/min匀浆15 min，使其完全被打碎并均匀分布于溶液中，将溶液导入模具后于-80 ℃冷冻2 h，再转入冷冻干燥机中放置48 h，此时获得的是未交联的三维多孔支架，为增强其稳定性，将其置入5%戊二醛溶液中交联10 min，滤纸吸干戊二醛溶液后用去离子水浸泡清洗5 min，重复5次，最后将支架放入-80 ℃冰箱中冷冻2 h，转入冷冻干燥机冷冻干燥48 h，获得最终的三维多孔纳米纤维支架(three-dimensional porous nanofibrous scaffold，3-DPS)。

1.4.2  骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定  取SD大鼠，按LI等^[12]总结的方法提取骨髓间充质干细胞并培养。取第3代骨髓间充质干细胞，以流式细胞仪检测细胞表面标记物水平，同时以诱导培养基诱导骨髓间充质干细胞向骨、脂肪方向分化，分别以茜素红染色和油红O染色判断成骨、成脂肪分化的效果。

1.4.3  细胞-支架复合体的构建和培养  将制备好的3种支架消毒后置于24孔板内，在室温下培养基孵育过夜后接种传代至第3代的骨髓间充质干细胞，接种密度为1×10⁵/孔，接种后将细胞支架复合体在培育箱内静置1 h，加入含体积分数10%胎牛血清的成软骨诱导培养基(10 µg/L转化生长因子β3、100 mg/L丙酮酸钠、50 U/mL胰岛素、10^-7 mol/L地塞米松、40 mg/L脯氨酸、ITS+Premix)后继续培养，根据培养基情况每二三天换液1次，根据需要在各时间节点取出支架进行检测。

1.5  主要观察指标

1.5.1  细胞形态学观察  细胞-支架复合体成软骨条件下诱导培养7 d后取出，进行固定、脱水、喷金，再以扫描电镜进行观察，以确定细胞在支架表面的生长情况。

1.5.2  细胞黏附、增殖行为检测  细胞-支架复合体成软骨条件下诱导共培养后，由加入含体积分数10%胎牛血清起开始计时，在培养至2，4，8 h后，以CCK-8法测定细胞黏附情况，每时间点平行测定3个样本。在共培养至1，3，7 d时以CCK-8细胞增殖试剂盒评估细胞在支架上的增殖情况。

1.5.3  细胞分化行为检测  成软骨条件下诱导共培养3周后提取细胞内RNA，设计特异性引物，见表1，行qRT-PCR检测，以评估细胞外基质表达情况，以及转录因子Ⅱ型胶原α1、Ⅰ型胶原α1、蛋白聚糖、Sox-9的mRNA表达水平。

1.5.4  相关通路关键分子表达水平的检测  行Western blot检测部分关键分子的表达情况。细胞-支架复合体在成软骨条件下诱导培养3周后提取蛋白，以BCA蛋白浓度测定法测定蛋白浓度，以SDS-PAGE行电泳分离，分离后转移至PVDF膜，加入5%BSA室温封闭2 h后TBST洗膜3次，分别加入抗ERK(1∶1 000)、抗磷酸化ERK(1∶1 000)、抗P38(1∶1 000)、抗磷酸化P38(1∶1 000)、抗AKT(1∶1 000)、抗磷酸化AKT(1∶1 000)、抗JNK(1∶1 000)、抗磷酸化JNK(1∶1 000)、抗GAPDH(1∶2 000)抗体，于4 ℃条件下孵育过夜。完成孵育后TBST洗膜3次，以   1∶2 000的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗和辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗室温孵育2 h。再次以TBST洗膜3次后与化学发光检测试剂反应2 min，吸尽多余液体后将膜于暗室中感光、显影、定影。

1.6  统计学分析  以SPSS 17.0统计软件包进行分析，计量数据以x(_)±s表示，以单因素方差分析法比较组组间差异，两两比较采用独立样本t 检验法进行，P < 0.05时为差异有显著性意义。

3.1  纤维环解剖结构及细胞构成特点  脊柱的椎间盘有复杂的解剖结构，其由位于中心的髓核和环绕其外的纤维环组成，纤维环主要发挥限制髓核突出的屏障作用。结构完整的纤维环还可维持椎间盘内的压力，保证椎间盘结构和功能完整。纤维环由高度取向的胶原纤维组成，这些纤维形成薄层样结构，各层纤维在本层内互相平行排列，而相邻层间的纤维互呈一定角度。纤维环的结构也可视为边界不清的内外两部分，两部分的细胞组成、细胞外基质等特性各不相同，但无明显分界，呈渐进性变化。一般来说从外至内，Ⅰ型胶原的含量逐渐降低，而Ⅱ型胶原和蛋白多糖的含量则逐渐升高，同时细胞数目也不断降低。从细胞组成方面分析，纤维环外层的细胞特性更近似于成纤维细胞，而位于内层的细胞则与髓核或软骨细胞更为近似^[13]。这些差异与外层纤维环主要对抗张力和剪切力、内层纤维环主要对抗压力的受力特点相对应^[14]。

基于纤维环的这些特点，利用组织工程技术修复纤维环时可考虑利用干细胞具有多向分化潜能的特点，以其作为种子细胞，使其在特定条件下根据需要分化，形成符合内、外层纤维环特点的细胞。因此，研究细胞如何感应微环境并继发一系列响应的机制将成为研究纤维环修复工程的关键。

3.2  纳米支架构建及目前研究进展  以往有研究表明，支架表面拓扑结构对细胞的增殖、分化等行为可产生影响^[15-16]，如诱导黏附于其表面的细胞发生形态改变等。细胞种植到支架材料后，首先黏附于其表面，继而发生迁徙、生长等一系列行为，并同时分泌细胞外基质，其后再逐渐出现增殖、分化等变化。TIAN等^[17]发现在结构相近的材料中，纳米级材料比微米级材料更易于黏附细胞，这与以往研究中发现的纳米纤维对细胞的选择性吸附的现象相一致^[18]。另外，纳米级纤维材料也对细胞形态和细胞骨架有调控作用。AHMED等^[19]将小鼠胚胎纤维细胞种植在二维及三维支架上，发现细胞更易黏附在三维纳米支架表面。LI等^[20]在电纺聚左旋乳酸纳米及微米材料上种植同一种软骨细胞，发现在纳米纤维支架表面的软骨细胞呈圆型，而在微米纤维表面则呈现明显不同的结构。此次实验结果也表明：AFS和AYS支架表面黏附的细胞随纤维走向伸展，细胞形态呈长梭形；而3-DPS支架表面的细胞则呈圆形。其后对于细胞表型分子的检测也表明：干细胞接种于AFS、AYS后的分化方向倾向于类成纤维细胞，而在3-DPS支架则更类似于软骨细胞，即不同支架的表面形态对细胞的差异分化发挥了调控作用。而此种调控的作用机制正是此次研究拟进行的讨论。

在组织工程研究中，外源性生长因子的加入、支架表面拓扑结构的改变、支架组成成分的调整是常用的调节骨髓间充质干细胞定向分化的方法。这些方法中，改变支架表面拓扑结构被认为是有效的手段之一，也是近年来的研究热点。一般认为纳米级拓扑结构可通过非直接力的传导来诱导间充质干细胞向成骨方向分化^[21-22]，其中应力转导首先将物理刺激转换为生物信号，从而激活继发的细胞应答^[23]。在这一过程中发挥作用的具体机制尚未完全明了，目前较为公认的与这类细胞行为调控关系密切的信号通路主要包括Integrin介导的FAK信号通路及RhoA/Rho相关卷曲蛋白激酶信号通路。

3.3  骨髓间充质干细胞在纳米支架黏附、增殖的机制研究  对于骨髓间充质干细胞在纳米支架中的黏附、增殖等行为，目前认为与整合素相关通路密切相关。其中，FAK被认为是整合素信号转导通路的关键分子，其作为应力转导的启动信号及主要调节分子发挥作用^[24]。整合素与细胞外基质中的纤连蛋白或层粘连蛋白结合，其α、β亚基将信号级联放大，以此引导肌动蛋白的聚集，肌动蛋白继而重塑为应力纤维，这些应力纤维可促进细胞和细胞外基质的绑定^[25]。

以上过程是细胞外的物理信号传导至细胞内部的途径，借此细胞内的信号通路被激活，产生细胞应答^[26]。通过FAK发生激活的下游通路主要为MAPKs信号通路，MAPK信号通路又包括丝原活化蛋白激酶p38 、ERK1/2、JNK等，其中最重要的是P38和ERK信号通路^[27]。ERK是MAPK的下游分子，在细胞行为如增殖、分化中发挥重要的调节作用。WANG等^[28]发现取向胶原纳米纤维可促进神经前体细胞增殖，其主要机制即整合素介导的细胞和胶原纤维激活内源性MAPK通路；CHEN等^[29]也证实了FAK-ERK/MAPK信号通路可促进神经干细胞分化。P38/MAPK是Integrin-FAK信号通路的重要下游分子。有研究表明骨髓间充质干细胞在P38/MAPK信号通路的调控下向成软骨细胞分化^[30-33]，尤其是在转化生长因子β介导条件下，干细胞向软骨细胞分化过程中P38可发挥重要的调控作用^[34]；OH等^[35]通过加入抑制剂的方法证实在干细胞向软骨分化过程中P38、MAPK抑制后软骨合成明显减少。此外，位于FAK下游的PI3-K/AKT信号通路也是细胞增殖、分化行为相关的重要信号通路^[36]，AKT为丝氨酸/苏氨酸激酶，在细胞增殖和新陈代谢的调节中发挥重要作用^[37-38]，其功能涉及大部分生长因子信号的转导^[39-40]。生长因子可激活PI3-K，进而产生磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸盐，该物质可募集蛋白激酶B，进而激活AKT，通过级联效应调控细胞增殖、凋亡、糖代谢等功能。LI等^[41]研究发现胃促生长素可通过激活AKT信号通路抑制髓核细胞的退变，PRATSINIS等^[42]亦发现血小板来源生长因子、间形成纤维细胞生长因子和胰岛素样生长因子可以通过激活ERK和AKT信号通路促进椎间盘细胞的分化。可见PI3-K/AKT信号通路在椎间盘、髓核、软骨细胞增殖、分化过程中都起到重要调控作用，该通路同样与FAK的活化相关。

研究将骨髓间充质干细胞接种至AFS、AYS和3-DPS三种材料中，以转化生长因子β3进行诱导分化培养后，证实细胞表型的表达存在明显差异，AFS、AYS材料中Ⅰ型胶原表达量高于3-DPS，而3-DPS材料中Ⅱ型胶原和促进软骨方向分化的转录因子蛋白聚糖、Sox-9表达呈高水平，这表明纳米结构支架对骨髓间充质干细胞的差异分化有调节作用，这同以往报道纳米纤维支架诱导黏附于其表面的细胞发生形态改变并通过非直接力传导诱导骨髓间充质干细胞分化相一致^[4-5，43]。对Integrin-FAK信号通路下游关键蛋白ERK1/2、JNK、P38、AKT的检测表明，接种至3-DPS材料的骨髓间充质干细胞高表达P38和AKT，且磷酸化的P38和AKT含量显著高于AFS、AYS组，而ERK1/2、JNK在此过程中无明显磷酸化表达，可见在分化过程中ERK1/2、JNK信号通路并未启动。结合3DPS材料中Ⅱ型胶原及蛋白聚糖、Sox-9高表达，可推测其向类软骨方向的定向分化受P38和AKT调节。可以认为在纳米结构静电纺丝支架中，Integrin-FAK通路通过其下游的P38和AKT信号通路对干细胞向类软骨细胞的定向分化发挥调节作用。

研究的不足之处包括以下方面：首先在细胞分化行为的检测方面仅检测了部分细胞表型分子，而未从蛋白或更深入层面加以验证；另外，仅对ERK、P38分子的表达差异进行了检测，而未通过施加干预进一步论证其作用。在进一步研究中除多层面论证细胞行为差异外，还将通过对关键分子进行干预的方法进一步明确干细胞在支架中生物学行为的具体机制，为今后构建理想的支架-细胞复合体提供依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

文题释义：
拓扑结构：泛指组织工程支架的一系列细微的结构差异，涵盖多方面因素，如支架质地、硬度等材料特性相关的属性；支架表面的光滑程度、支架内部的孔隙率等结构特性等；实验主要指静电纺丝纤维环支架中纤维排列方式。
差异分化：实验中用于描述骨髓间充质干细胞在不同条件下(主要指支架拓扑结构的不同)，接受外界信息后发生一系列变化，通过细胞通路等机制的调节分化为不同细胞的现象，如实验中骨髓间充质干细胞在不同支架中分别向成纤维细胞或成软骨细胞分化。对差异分化的机制进行研究，有助于今后通过改变条件诱导细胞向所需方向分化、发挥组织工程技术的优势更好修复组织的目的。

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实验首先构建了具有不同空间结构的静电纺丝纤维环支架，与骨髓间充质干细胞共培养后，通过观察细胞形态并测定表型相关的关键分子确定细胞发生了差异分化，分别呈现成纤维细胞和成软骨细胞的特性。在此基础上，通过对P38、AKT、ERK、JNK通过关键分子的检测和比较，发现磷酸化的P38、AKT分子表达存在差异。研究的意义在于从通过水平提出纳米纤维环支架对干细胞差异分化发挥调控作用的可能机制，为进一步研究提供了参考。

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