体外胚胎培养是胚胎工程技术的关键环节

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1781

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (29): 4735-4742.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1781

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体外胚胎培养是胚胎工程技术的关键环节

李楠，林忠

柳州市妇幼保健院生殖医学中心，广西壮族自治区柳州市 545001

修回日期:2019-04-02 出版日期:2019-10-18 发布日期:2019-10-18
通讯作者: 林忠，博士，主任医师，柳州市妇幼保健院生殖医学中心，广西壮族自治区柳州市 545001
作者简介:李楠，男，1984年生，河南省沁阳市人，汉族，2012年广西大学毕业，博士，副研究员，主要从事胚胎工程研究。
基金资助:
广西壮族自治区自然科学基金项目(2015GXNSFBA139177)，项目负责人：李楠；广西壮族自治区自然科学基金项目(2017 GXNSFAA198193)，项目负责人：林忠；广西壮族自治区自然科学基金项目(2017 GXNSFAA198199)，项目负责人：李楠；广西壮族自治区卫生和计划生育委员会自筹经费科研课题(Z20180027)，项目负责人：李楠；柳州市科学研究与技术开发计划(2016G020217)，项目负责人：李楠

In vitro embryo culture is the core of embryo engineering technology

Li Nan, Lin Zhong

Reproductive Medicine Center, Maternal and Child Health Hospital of Liuzhou City, Liuzhou 545001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Revised:2019-04-02 Online:2019-10-18 Published:2019-10-18
Contact: Lin Zhong, MD, Chief physician, Reproductive Medicine Center, Maternal and Child Health Hospital of Liuzhou City, Liuzhou 545001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Li Nan, MD, Associate researcher, Reproductive Medicine Center, Maternal and Child Health Hospital of Liuzhou City, Liuzhou 545001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 2015GXNSFBA139177 (to LN), 2017GXNSFAA198193 (to LZ) and 2017GXNSFAA198199 (to LN); the Self-Financing Research Project of the Health and Family Planning Commission of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. Z20180027 (to LN); Liuzhou Science and Technology Development Plan, No. 2016G020217 (to LN)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
体外胚胎培养：是指经过体外受精或者体细胞核移植技术等生产的胚胎，放在胚胎培养箱内，设置在37 ℃(加入人工混合气体：5%CO₂、5%O₂、90%N₂或5%CO₂、95%空气)，使胚胎在体外可以持续发育，目前使用的培养液和无菌等条件要求比较严格。
胚胎工程：指对经过体外获得配子或早期胚胎所进行的多种显微操作和处理技术。包括体外受精、胚胎移植、胚胎分割移植、胚胎干细胞培养等技术。胚胎工程的许多技术，实际是在体外条件下，对动物自然受精和早期胚胎发育过程进行的体外操作，最终还会移植到母体内，可以获得新生胎儿，也可以不进行体外胚胎移植，进行胚胎相关的科学研究。

摘要
背景：体外早期胚胎的培养是胚胎工程技术的主要环节之一。
目的：近年来，随着科学家的研究对胚胎发育和体外胚胎培养有了新认识和进展。
方法：由第一作者检索1990年1月至2018年10月PubMed数据库相关文献，检索词为“Embryo Engineering；Pre-implantation Embryo；In vitro embryo culture；Assisted Reproductive Technology；ART”，文献语言限制在英文。根据纳入排除标准，最终纳入76条进行分析探讨。
结果与结论：在严格遵循医学伦理学原则条件下开展的胚胎体外培养体系是动物胚胎工程的一项关键技术，是保证运用胚胎生物技术顺利生产体外胚胎的基础，通过改良体外胚胎培养体系，可以使体外培养环境更加接近体内环境，提高体外胚胎质量。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-4661-306X(林忠)

关键词: 胚胎工程, 体外胚胎培养, 辅助生殖技术, 植入前胚胎, 培养体系, 营养物质, 发育阻滞, 生长因子

Abstract:

BACKGROUND: In vitro embryo culture is one of the key links to animal embryo engineering technology.
OBJECTIVE: To review the recent progress in embryonic development and embryo culture in vitro.
METHODS: PubMed database was searched for relevant articles published from January 1990 to October 2018. The keywords were “embryo engineering; pre-implantation embryo; in vitro embryo culture; assisted reproductive technology, ART” in English. Finally, 76 eligible articles were included in result analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: In vitro embryo culture system is a key technology of animal embryo engineering that is used in strict accordance with the medical ethical requirements. This culture system is essential for the smooth production of in vitro embryos using embryonic biotechnology. An improved in vitro embryo culture system is conductive to establishing an in vitro culture environment being closer to the internal environment, thereby enhancing the quality of embryos.

Key words: embryo engineering, in vitro embryo culture, assisted reproductive technology, pre-implantation embryo, culture system, nutrients, developmental block, growth factor

中图分类号:

李楠，林忠. 体外胚胎培养是胚胎工程技术的关键环节[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(29): 4735-4742.

Li Nan, Lin Zhong . In vitro embryo culture is the core of embryo engineering technology [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(29): 4735-4742.

图/表（结果） 1

2.1 早期胚胎体外培养系统 目前，胚胎体外培养系统仍无法完全模拟哺乳动物雌性生殖道的物理及环境条件。早期胚胎体外发育的最佳体系不仅受到培养基组成成分的影响，同时还受到多种物理参数的影响(胚胎发育至孵化的环境、饲养细胞层的有无等)。最早在1970年，Bowman等^[6]在研究中就发现体外培养的早期胚胎会发生发育阻断现象。体外培养的胚胎经过移植后，会出现大量的胚胎吸收、死亡、流产、死胎、出生后死亡、胎儿过大综合征等问题^[7]。目前序贯培养系统的体外胚胎生产的新技术已有了较大的进步，但是仍然无法满足生产及科研的需要，仍然有待进一步完善、优化^[8]。体外胚胎培养系统的分类如下：

离体器官培养系统：1949年，Hammond等^[9]将生理盐水中加入卵黄，在体外将8-细胞期的BALB/C小鼠胚胎成功培养到囊胚阶段，这打开了早期胚胎体外培养的大门。1962年，Biggers等^[10]首次利用离体BALB/C小鼠输卵管膨大部来培养BALB/C小鼠早期胚胎，并且成功获得了囊胚。4年后，Papaioannou等^[11]利用离体小鼠输卵管培养系统将小鼠的单细胞胚胎培养至桑椹胚\囊胚阶段，其后采用同样的方法获得大鼠、仓鼠、猪、牛的桑椹胚\囊胚，表明输卵管上皮细胞分泌某些特殊物质能够支持早期胚胎的发育^[12-13]。曾经有研究将母兔输卵管作为临时“培养箱”，并获得桑椹胚\囊胚阶段胚胎^[14-15]，所获得的囊胚经过选择，由胚胎学家装入到移植管中移植到子宫，剩余的囊胚进行冷冻保存，但是要进行输卵管结扎从而避免胚胎的丢失，程序比较繁琐，效率也不是很高。后来随着体外胚胎培养技术的提高而逐渐放弃了该方法。

离体小鼠输卵管培养系统系统在使用CZB基础培养液作为基础培养基时，胚胎发育效果较好。但是更换为其他基础培养基如培养基199、碳酸盐缓冲液、重碳酸盐缓冲液的时候，效果却不尽人意^[16]。

简单微滴培养系统：常规培养系统是将胚胎单独在培养液中进行培养，而不添加其他细胞及其分泌因子的一种培养方法，分为微滴法和培养板法^[6]。前者是在塑料培养皿中制作30-100 μL的微滴，上面覆石蜡油，将胚胎置于其中培养，一般用于数量较少的胚胎培养；后者是直接将胚胎置于含500-800 μL 培养液的四孔培养板中培养，一般用于数量较多的胚胎培养^[11]。经过胚胎培养液的不断改进和培养条件的逐步完善，该方法的效率和质量有了很大的提高，因此，成为目前胚胎体外培养的主要方法。

简单微滴培养系统根据所使用的器械的不同分为微滴培养法、平板培养法、微穴培养法。该系统将体外生产的早期胚胎与简单的培养液共同培养。微滴培养法主要针对培养胚胎数量较少的情况，其可创造一个更有利于早期胚胎发育的环境。平板培养法则主要用于培养比较多的胚胎，其操作简单，但效果欠佳，与体内雌性生殖道中的环境相差甚远^[17]。近年来随着无透明带核移植技术的发展，在徒手克隆中出现了培养板单孔内进行微穴培养法培养^[4]。

细胞共培养系统：体外共培养系统是随着对胚胎发育阻断问题的研究而产生的，该系统主要是指将早期胚胎与辅助细胞或者体细胞在简单培养体系的基础上一起培养，使早期胚胎完成发育。目前用于共培养体系统使用的细胞有卵丘细胞、输卵管上皮细胞、卵泡颗粒细胞、子宫内膜细胞、BRL细胞、非洲绿猴肾细胞等^[18]。共培养系统可以提高体外胚胎的囊胚率和胚胎质量，有利于胚胎移植后妊娠。Minami等^[12]使用了输卵管上皮细胞与早期羊胚进行共培养。Krisher等^[13]将小鼠囊胚与人宫颈癌细胞共培养，发现孵化率有显著提高。目前对共培养的作用机制仍然不是很清楚。Allen等^[18]认为胚胎与体细胞的直接接触是主要原因。但是McCaffrey等^[19]的试验结果却否定了这个观点。还有研究者认为体细胞主要通过分泌一些有益的细胞因子，如生长因子等，并去除培养液中的重金属物质、细胞毒性物质等，减少过氧化物的产生而发挥作用^[20]。研究表明，共培养对克服小鼠早期胚胎发育阻滞作用较为明显，且输卵管上皮细胞共培养的效果优于卵丘细胞^[12]。有研究者建立了小鼠早期胚胎与肿瘤细胞体外共培养模型，结果显示，早期胚胎与肿瘤细胞共培养可显著提高小鼠2-细胞胚胎的体外发育效率^[18]。但共培养系统的具体机制仍待研究。而输卵管离体培养因较为烦琐和胚胎发育率不高等原因较少被使用。与体细胞共培养法可以利用体细胞生长过程中产生的有益因子克服发育阻断，从而促进胚胎发育，但随着培养液的不断改良，实验室更倾向于使用常规培养系统。

序贯培养系统：序贯培养系统是指在对早期胚胎发育特点研究的基础上，针对早期胚胎发育的不同时期对各种物质的不同需求而添加不同的物质到培养基中的连续培养系统^[21]。序贯培养系统是在对早期胚胎发育代谢的特点和雌性生殖道中各种物质的认识基础上逐渐发展起来的，其发展对共培养系统等也起到了促进作用。1997年Gardner等^[22]利用G1、G2序贯培养基成功地培养了人类的早期胚胎。随着其他科学家的研究及推广，成分确定的序贯培养系统已开始受到了学者们的重视^[23]。其他商品化的序贯培养基也得到了开发，如S1、S2；Q1、Q2；P1、P2等序贯培养基^[24]。近年来，虽然胚胎培养体系已从静置的微滴法逐渐发展为效果更好的动态微流体培养，这促进了人类辅助生殖技术等的应用和发展^[25]，但动态培养体系操作较为复杂，限制了其广泛应用，而静置培养体系则因培养效果稳定、易操作而一直占据主导地位，其中微滴法是目前最常用的培养方法。

各种早期胚胎体外培养系统差异见表1。

2.2 早期胚胎体外培养系统的组成

2.2.1 能量物质 能量物质是维持早期胚胎发育新陈代谢所必不可少的成分，主要为葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸、丙酮酸盐等。小鼠卵母细胞成熟和受精时，葡萄糖是主要的能量物质，而丙酮酸则为辅助能源物质。致密化后葡萄糖则逐渐成为胚胎的主要能量物质^[5]。人早期胚胎的能量物质的利用模式与小鼠相似。1965年，Brinster^[26]发现当丙酮酸盐处于最适浓度的情况下，葡萄糖的添加对Swiss小鼠胚胎2-细胞期的发育具有轻微的毒害作用。1988年，Schini等^[27]发现在磷酸盐存在也会引起黄金仓鼠2-细胞胚胎的发育阻断。研究发现，葡萄糖作为惟一能量底物时，小鼠早期胚胎发育阻滞于4-细胞晚期或者8-细胞早期^[28]；且葡萄糖对牛、猪等早期胚胎发育也存在抑制作用^[29-30]。在对牛早期胚胎的研究中发现，其2-细胞期就可以代谢葡萄糖，但葡萄糖的代谢在8-细胞晚期和桑椹胚后才会呈现急剧的增加^[29]。在小鼠、仓鼠、绵羊、牛的胚胎致密化前，葡萄糖并不是主要的能量物质，丙酮酸和乳酸才是其主要的能量代谢物质，只有胚胎致密化后，其对葡萄糖的利用才大幅度增加^[30]。

通过对早期胚胎的代谢研究证明丙酮酸和乳酸支持早期胚胎的发育，是早期胚胎优先利用的能量代谢物质^[29]。其在早期胚胎发育中的作用根据动物胚胎的不同而有所差异。牛胚胎对乳酸浓度的增加比丙酮酸有较强的承受能力^[28]。2000年，Khurana等^[31]通过研究牛体内胚胎和体外受精胚胎的代谢过程发现，体外受精囊胚阶段产生的乳酸量是同期体内胚胎的2倍。乳酸主要是维持胞内氧化还原物质的稳定。丙酮酸和乳酸的比例与维持胚胎胞内的NAD:NADH比例有关，在胚胎的抗氧化中起平衡作用^[31]。8-细胞后，高浓度的乳酸能减少丙酮酸的吸收。绵羊在早期胚胎发育阶段对葡萄糖的利用较低，对丙酮酸的吸收量较高；致密化后则刚好相反^[32]。减小丙酮酸和乳酸的比例可提高牛胚胎的发育，却抑制仓鼠胚胎的发育。同时，丙酮酸具有抗氧化作用，降低胚胎对氧化应激的不良反应^[33]。

谷氨酰胺是一种生糖氨基酸，故可作为能量底物。研究证明，在早期胚胎培养液中添加谷氨酰胺有助于仓鼠、小鼠、猪胚胎克服早期胚胎发育阻滞^[30^，^34-35]。葡萄糖可以替代谷氨酰胺满足猪胚胎发育的需要。Lane等^[36]研究发现，当小鼠的培养液中同时存在谷氨酰胺和必需氨基酸时，对其囊胚的孵化率和滋养层的细胞数量有显著的提高作用。同时发现，牛早期胚胎消耗谷氨酰胺的能力比桑椹胚和囊胚高，说明谷氨酰胺可以作为牛早期胚胎的能量来源^[29]。葡萄糖与磷酸盐可以降低呼吸，同时破坏线粒体的结构^[37]。对牛和仓鼠中研究表明，在葡萄糖与磷酸盐同时存在的情况下，对胚胎发育有抑制作用^[38]。而在无磷酸盐的情况下，葡萄糖对胚胎的发育无抑制作用^[37]。故在研究各种动物各阶段胚胎代谢特点的基础上，合理的增加葡萄糖和其他各种能量底物，并且适时的增加葡萄糖，以满足胚胎发育后期的需要，某些代谢产物还可以作为胚胎发育潜能的标记物^[39]。

2.2.2 氨基酸 氨基酸是动物生殖道中比较常见的一种成分，在胚胎发育过程起到广泛的作用，作为能量底物，参与到早期胚胎的能量代谢中、调节pH值的稳定、调节渗透压的稳定等，进而促进早期胚胎的发育，抑制囊胚的凋亡。氨基酸参与到早期胚胎的能量代谢的过程中，提供能量和营养，促进胚胎的发育，同时抑制糖酵解作用，降低因糖酵解而对胚胎产生的有害作用。胚胎发育早期，葡萄糖并不是其主要的能力物质。由于早期胚胎缺乏氧化葡萄糖所需要的相关酶类，通过糖酵解会产生抑制胚胎发育的物质，不利于早期胚胎的发育。Rose-Hellekant等^[40]研究发现，谷氨酰胺可为小鼠、猪、仓鼠等桑椹胚前提供胚胎发育的能量，同时也作为胚胎代谢的主要氮源，促进体外胚胎的发育能力，还可与乳酸钠协同促进卵母细胞的体外成熟和胚胎发育。

使用无氨基酸的培养基培养人和小鼠的早期受精卵，没有成功培育囊胚，这证明了氨基酸在胚胎发育过程中的重要性。Bavsiter等^[41]对发现单个的自由氨基酸经过混合添加到小鼠胚胎培养液中形成氨基酸池，尤其是非必需氨基酸，这有利于克服早期胚胎的发育阻滞，增强小鼠囊胚的孵化率，促进胚胎的早期发育以及增强胚胎植入后的发育能力。一些相关的研究也得到了相类似的结果^[42]，也证实氨基酸可以增强小鼠早期胚胎的孵化率。在早期胚胎培养过程中，部分自由氨基酸在湿热环境下的降解所产生的氨对胚胎的发育是有害的。在培养过程中，胚胎对氨非常敏感，如果不及时去除，可能会诱发“胎儿过大综合征”^[7]。胚胎致密化前，必需氨基酸没有作用，但对后期囊胚的形成及孵化有明显的促进作用，主要表现在增加内细胞团分裂率，提高胚胎向囊胚的发育和囊胚的孵化能力，增加滋养层细胞的数量和提高植入后胎儿的发育能力^[8]。

2.2.3 维生素 目前所使用的复杂培养液中均含有一定比例的维生素，但是对维生素在胚胎发育过程中的作用机制仍在进一步的研究。维生素并不影响胚胎形态，只作为糖类和氨基酸的辅助因子而参与到代谢过程中，改善相关代谢过程中酶类的活性，是其代谢过程中必不可少的成分。维生素可以促进糖类的摄取、乳糖的合成以及相关的代谢进程，进而影响到胚胎的代谢和发育^[43]。人和小鼠受精卵在不含维生素的胚胎液中可以形成囊胚，且维生素能促进绵羊早期胚胎对葡萄糖的利用率，进而促进胚胎的孵化。同样，兔囊胚的扩张也需要维生素的参与。由于维生素E与维生素C在抗氧化方面具有协同作用，保护细胞免受氧化损伤；B族维生素则是碳水化合物和氨基酸代谢重要组成部分，推测这些维生素都可能在胚胎发育中起到重要作用。Olson等^[44]研究了维生素E、维生素C和EDTA对牛早期胚胎的作用，发现单独添加维生素E有助于囊胚的发育，但是不与维生素C具有协同作用，且添加EDTA并不增加维生素E和维生素C的作用。添加维生素E、维生素C可以对抗和逆转小鼠胚胎长期在活性氧培养中所产生的胚胎毒性。Kane等^[45]在Ham’s F-10培养基中添加维生素B12，发现囊胚孵化率的下降。因而维生素可能不仅在早期胚胎培养液中发挥促进作用，但具体机制仍有待进一步研究。

2.2.4 蛋白质 蛋白质是早期胚胎培养液中的重要物质，对胚胎的发育具有重要的作用。胚胎内蛋白质的代谢与胚胎发育阻断和胚胎基因组的激活等都有密切的关系，故培养液中所含的蛋白质不足、过量或者比例不当均对早期胚胎的发育产生严重的影响。

目前，早期胚胎培养液中的蛋白质来源主要是血清和牛血清白蛋白。血清又根据其来源的不同分为人血清、阉公牛血清、发情母牛血清、胎牛血清、新生牛血清等。研究认为，胚胎培养液中添加普通牛血清优于牛血清白蛋白。但是由于血清的组成相当复杂，含有激素、生长因子、维生素、矿物质、氨基酸、脂肪酸、细胞因子、鳌合金属离子、多肽以及一些仍未被确定的物质，这些物质共同作用于胚胎，很难具体分析每种成分的作用机制。同时仍然不能去除血清中所含有的对胚胎发育有害的物质。因此，人们通过使用无血清或者成分明确的血清白蛋白对胚胎进行培养，进一步研究血清在胚胎发育中的作用。血清成分的多样性决定了其在早期胚胎发育过程中作用的多元性。Carolan等^[46]研究认为，在卵裂前期的培养液中不加血清，而在胚胎发育后期加入高浓度的血清，可提高胚胎质量，其作用机制目前尚不清楚。

牛血清白蛋白是培养液中比较常用的一种蛋白质来源，可与培养液中的一些胚胎毒性相结合并能减弱其毒性，因而在培养液中起到保护作用，同时也能参与到胚胎代谢，促进胚胎的发育，增加早期胚胎细胞的数量。但是，牛血清白蛋白不能完全取代血清的作用，因为血清中包含一些在牛血清白蛋白中没有的因子。将透明质酸和牛血清白蛋白共同添加到培养液中，能增加牛胚胎细胞数量和囊胚的孵化能力。也有研究尝试使用大分子物质如聚乙烯醇来部分代替牛血清白蛋白在胚胎培养液中的作用，虽然也能够使胚胎发育，但是胚胎的发育率显著低于添加牛血清白蛋白的培养基，且代谢活性也有所降低^[47]。

2.2.5 核酸前体物 通常在培养液中不需要添加核酸前体物，因为卵母细胞在成熟过程中已经完成了早期胚胎发育所需要的部分蛋白质和mRNA的积累，这些产物有可能作为胚胎发育潜能的标记物^[48]。在胚胎早期卵裂时期，利用卵母细胞所携带的母源物质，完成胚胎蛋白质合成在质和量上的变化^[49]。进一步激活胚胎自身的基因组，完成有母源基因组控制到胚胎自身基因组控制的转变，产生控制转录的母本/胚胎转换。胚胎基因组激活后，胚胎将由母源调控转入胚胎调控，完成遗传信息翻译成蛋白质，参与胚胎的各项功能活动^[50]。

小鼠和人的培养液中不需要添加核酸前体。同时，利用放射性物质标准核苷酸，发现小鼠胚胎会吸收外源核苷酸到其RNA和DNA中去。Nureddin等^[51]研究发现，在小鼠培养液中添加腺苷和肌苷不利于第1次分裂后的发育。相似的结果在Loutradis等^[52]的实验中也出现，其发现，在Ham’s F-10培养液中添加次黄嘌呤会使小鼠胚胎发育阻断在2-细胞期^[53]。

2.2.6 生长因子 对生长因子的研究主要是伴随着对胚胎发育阻断及相关问题的解决而产生的。生长因子主要是作为调节细胞信号传导功能的物质参与到早期胚胎发育中，虽然含量微小，但参与到胚胎发育的重要信号通路，促进胚胎的生长发育，促进胚胎的发育和分化^[54]。Flood等^[55]利用牛的体外受精胚胎研究证明，生长因子促进卵母细胞的成熟和体外早期胚胎的发育。目前主要研究认为与早期胚胎发育相关的生长因子有胰岛素、表皮生长因子、类胰岛素生长因子Ⅰ，Ⅱ、转化生长因子α、集落刺激因子Ⅰ、白小板衍生生长因子、激活素A、碱性成纤维细胞生长因子、可溶性白细胞抗原G、血小板样生长因子、白血病抑制因子等。类胰岛素生长因子Ⅰ、Ⅱ及其受体基因在早期胚胎中可以检测到，其表达产物在输卵管及子宫分泌物中存在，可溶性白细胞抗原G、血小板样生长因子因子有可能作为胚胎发育潜能的标记物^[56]。

生长因子来自胚胎本身的自分泌或者母体生殖道的旁分泌，参与调控胚胎的发育；同时通过对胚胎细胞信号传导的研究发现，各种生长因子的受体存在于胚胎发育的不同阶段^[57]，说明不同发育阶段对生长因子的需求是动态存在的。因此，选择在早期胚胎培养液中添加生长因子时，应该注意胚胎不同发育阶段对不同的生长因子的选择^[58]。比如在小鼠胚胎发育过程中，2-细胞需要转化生长因子β1，8-细胞需要表皮生长因子，桑堪胚和囊胚期则需要血小板生长因子A及转化生长因子α^[41]。

目前对小鼠胚胎体外发育阻滞机制以及克服阻滞现象方法的研究己经取得了长足的进步，但还需要进一步完善^[59]。早期胚胎发育阻滞一般都发生在最初4个细胞周期中的某个长G2相阶段，主要原因是在胚胎细胞中母源mRNA消失，其自身基因组尚未被激活，同时对环境压力敏感，最终导致发育阻滞发生。培养液中加入超氧化物岐化酶、EDTA、半胱氨酸和铁传递蛋白等相关的抗氧化剂可以减轻应激，降低阻滞发生。体外培养液中添加谷胱甘肽对小鼠、牛、山羊胚胎发育的促进作用都有报道^[60]。生殖道上皮细胞的信号可以提供某些生长因子，或清除胚胎发育的微环境中有害物质等都将有助于胚胎的正常发育，动态培养技术的优点也在于此^[61]。同时，胚胎间的协同作用也引起人们的重视。利用子宫内膜上皮细胞和成纤维细胞等作为胚胎培养的饲养层细胞，也可以使早期胚胎突破发育阻滞，降低阻滞发生。饲养层细胞可以促进胚胎的发育, 其作用机制在于能清除培养基中对早期胚胎发育有害的物质，还能分泌促进胚胎发育的因子^[62]。

2.3 物理因素

2.3.1 渗透压 哺乳动物的输卵管液是以高浓度的K⁺和Cl^-构成的。目前常用培养液中大概包括Na⁺，Cl^-，K⁺，Zn²⁺，Mg²⁺，PO₄³^-，SO₄²^-，HCO₃^-和H₂PO₄^-等无机离子^[63]。这些离子还起到共同维持培养液渗透压的作用，渗透压的剧烈改变对胚胎的发育存在影响^[64]。目前大多数胚胎培养液所使用的渗透压为250-300 mOsm。但也有实验结果显示，降低渗透压可提高小鼠的囊胚发育率^[65]。每种无机离子都有自身所特有的功能。如Na⁺的主要功能是参与调节培养液的渗透压。K⁺的主要功能是参与调节桑椹胚期的胚胎发育。此外，培养液中的Na⁺/K⁺比值会显著影响胚胎的发育^[60]。研究显示最适宜的Na⁺/K⁺比值为11.4∶3.2。同时，Na⁺/K⁺泵、Na⁺/K⁺-ATP酶还参与到囊胚腔的形成^[60]。Ca²⁺主要参与维持细胞膜的稳定和通透性，Ca²⁺的缺乏会显著降低牛胚胎囊胚的发育率^[61]。Mg²⁺是糖酵解和三羧酸循环的辅酶，Mg²⁺的缺乏会显著抑制牛胚胎的发育过程。0.5 mmol/L PO₄^3-会显著促进牛受精胚胎的体外发育，然而，PO₄^3-对猪胚胎的体外发育无促进作用，会引起仓鼠体外胚胎发育的发育^[66]。培养液中Zn²⁺可以显著提高牛早期胚胎的发育率^[67]。在一个培养体系中，多种离子对早期胚胎发育起到重要作用；同时无机离子之间都存在非常微妙的相互协同和拮抗作用。所以所有无机离子之间必须浓度、种类据需要进行充分协调才能达到良好的培养效果。

2.3.2 pH值 大多数早期胚胎培养液所用的缓冲体系为NaHCO₃/CO₂体系，pH值维持在保持生理活性的7.2-7.4之间，与体液的pH值一致。培养液中NaHCO₃/CO₂缓冲体系的稳定需要培养箱内CO₂必须保持在5%的气体浓度进行维持^[68]。当胚胎在体外操作时，如果胚胎在体外操作太久，培养液长期放置于空气中，此时CO₂的挥发会引起培养液pH值升高，导致胚胎损伤甚至引起胚胎死亡。因此，空气易使液体pH升高，常用磷酸盐缓冲体系替代NaHCO₃/CO₂缓冲体系，避免胚胎的损伤，也有使用HEPES缓冲体系如M2液。

2.3.3 气相及温度系统 CO₂、N₂和O₂是与胚胎密切相关的3种气体。普通的早期胚胎体外培养体系中大多采用这些气体作为气相环境。主要是5%CO₂、95%空气、100%的空气饱和湿度或三气培养体系(5-7%O₂、5% CO₂、88%-90%N₂）的饱和湿度气相环境。这个环境是目前在人、牛、羊等动物胚胎培养中一致认为较为理想的气相环境^[69]。但也有研究结果显示，致密期后，氧浓度降低至2%认为可以促进早期胚胎的发育，原因可能是低氧的环境与雌性生殖道中的氧浓度相似^[66]。CO₂除参与到NaHCO₃/CO₂缓冲体系中维持胚胎培养体系的pH值稳定，也在小鼠胚胎植入前参与到核酸和蛋白质的形成^[70]。胚胎内外的pH稳定对细胞的分裂、分化以及代谢的稳定都具有重要的意义。pH值小范围的波动(约1/10的变化)均会对其呼吸、糖酵解、蛋白的合成产生显着的影响。某些特殊的氨基酸可以作为pH的缓冲剂，如甘氨酸在雌性生殖道中含量高达2 mmol/L，可作为细胞内缓冲剂，减小pH值的波动对胚胎发育的不利影响。

在早期胚胎的体外培养过程中，温度对胚胎也有很大的影响，牛、羊等胚胎培养以38.5 ℃为宜。温度过高，胚胎发育会受到热应激影响，发育能力下降。温度过低会发生冷休克^[65]。1998年，Azambuja等^[71]将卵母细胞置于不同温度5-20 min，结果发现随着温度下降，卵裂率和早期胚胎的发育能力均有所下降。

体外胚胎培养系统中除以上所述物质外，还有其他一些重要的成分如激素^[72]。有研究显示，300 μg/L的催乳素可以显著提高小鼠囊胚的发育率^[73]。虽然对早期胚胎发育的代谢机制和营养需求经过多年的研究^[74]，已经有了很大的进步，但仍然有许多问题未得到解决，如体内胚胎发育的过程是处于输卵管的内膜上皮细胞不断的振动和输卵管内液体不断变化的状态下^[75]。目前仍然无法模拟的还有随着人体的运动，输卵管纤毛上皮细胞摆动和输卵管肌层的收缩运动增强，细胞因子分泌增多，胚胎生活在动态的物理和化学变化体等，相关问题有待更为深入的研究^[76]。

参考文献

[1]Le Gac S, Nordhoff V. Microfluidics for mammalian embryo culture and selection: where do we stand now? Mol Hum Reprod. 2017;23(4): 213-226.

[2]Day BN. Reproductive biotechnologies: current status in porcine reproduction. Anim Reprod Sci. 2000;60-61:161-72.

[3]Simopoulou M, Sfakianoudis K, Rapani A, et al. Considerations Regarding Embryo Culture Conditions: From Media to Epigenetics. In Vivo. 2018;32(3):451-460.

[4]Wale PL, Gardner DK. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Hum Reprod Update. 2016;22(1):2-22.

[5]Chronopoulou E, Harper JC. IVF culture media: past, present and future. Hum Reprod Update. 2015;21(1):39-55.

[6]Bowman P, McLaren A. Cleavage rate of mouse embryos in vivo and in vitro. J Embryol Exp Morphol. 1970;24(1):203-207.

[7]Sinclair KD, Young LE, Wilmut I, et al. In-utero overgrowth in ruminants following embryo culture: lessons from mice and a warning to men. Hum Reprod. 2000;15 Suppl 5:68-86.

[8]Otsuki J, Nagai Y, Matsuyama Y, et al. The redox state of recombinant human serum albumin and its optimal concentration for mouse embryo culture. Syst Biol Reprod Med. 2013;59(1):48-52.

[9]Hammond J Jr. Recovery and culture of tubal mouse ova. Nature. 1949;163(4131):28.

[10]Biggers JD, Gwatkin RB, Brinster RL. Development of mouse embryos in organ cultures of fallopian tubes on a chemically defined medium. Nature. 1962;194:747-749.

[11]Papaioannou VE, Ebert KM. Development of fertilized embryos transferred to oviducts of immature mice. J Reprod Fertil. 1986;76(2): 603-608.

[12]Minami N, Bavister BD, Iritani A. Development of hamster two-cell embryos in the isolated mouse oviduct in organ culture system. Gamete Res. 1988;19(3):235-240.

[13]Krisher RL, Petters RM, Johnson BH, et al. Development of porcine embryos from the one-cell stage to blastocyst in mouse oviducts maintained in organ culture. J Exp Zool. 1989;249(2):235-239.

[14]Sirard MA, Lambert RD, Guay P, et al. In vivo and in vitro development of in vitro fertilized bovie follicular oocytes obtained by laparoscopy. Theriogenology. 1985;23(1):230.

[15]Ueda SKM, Shioya Y, Hanada A. Culture of in vitro fertilized bovine embyros in a chemically defined medium(BO-medium). Jpn J Anim Reprod. 1988;34:5.

[16]Sharif HVE. Development of early bovine embyros in mouse oviducts maintained in organ culture. Theriogenology. 1991;35:270.

[17]Leese HJ. The formation and function of oviduct fluid. J Reprod Fertil. 1988;82(2):843-856.

[18]Allen RL, Wright RW Jr. In vitro development of porcine embryos in coculture with endometrial cell monolayers or culture supernatants. J Anim Sci. 1984;59(6):1657-1661.

[19]McCaffrey C, McEvoy TG, Diskin MG, et al. Successful co-culture of 1-4-cell cattle ova to the morula or blastocyst stage. J Reprod Fertil. 1991;92(1):119-124.

[20]Batista M, Torres A, Diniz P, et al. Development of a bovine luteal cell in vitro culture system suitable for co-culture with early embryos. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2012;48(9):583-592.

[21]Lin S, Li R, Zheng X, et al. Influence of embryo culture medium on incidence of ectopic pregnancy in in vitro fertilization. Fertil Steril. 2015;104(6):1442-1445.

[22]Gardner DK, Lane M. Culture and selection of viable blastocysts: a feasible proposition for human IVF? Hum Reprod Update. 1997;3(4): 367-382.

[23]Sirard MA. The influence of in vitro fertilization and embryo culture on the embryo epigenetic constituents and the possible consequences in the bovine model. J Dev Orig Health Dis. 2017;8(4):411-417.

[24]López-Pelayo I, Gutiérrez-Romero JM, Armada AIM, et al. Comparison of two commercial embryo culture media (SAGE-1 step single medium vs. G1-PLUSTM/G2-PLUSTM sequential media): Influence on in vitro fertilization outcomes and human embryo quality. JBRA Assist Reprod. 2018;22(2):128-133.

[25]Kamath MS, Mascarenhas M, Kirubakaran R, et al. Use of embryo culture supernatant to improve clinical outcomes in assisted reproductive technology: a systematic review and meta-analysis. Hum Fertil (Camb). 2018;21(2):90-97.

[26]Brinster RL. Studies on the development of mouse embryos in vitro. IV. Interaction of energy sources. J Reprod Fertil. 1965;10(2):227-240.

[27]Schini SA, Bavister BD. Two-cell block to development of cultured hamster embryos is caused by phosphate and glucose. Biol Reprod. 1988;39(5):1183-1192.

[28]Brown JJ, Whittingham DG. The dynamic provision of different energy substrates improves development of one-cell random-bred mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil. 1992;95(2):503-511.

[29]Brackett BG, Zuelke KA. Analysis of factors involved in the in vitro production of bovine embyros. Theriogenology. 1993;39(1):43-64.

[30]Petters RM, Johnson BH, Reed ML, et al. Glucose, glutamine and inorganic phosphate in early development of the pig embryo in vitro. J Reprod Fertil. 1990;89(1):269-275.

[31]Khurana NK, Niemann H. Energy metabolism in preimplantation bovine embryos derived in vitro or in vivo. Biol Reprod. 2000;62(4): 847-856.

[32]Lane M, Gardner DK. Lactate regulates pyruvate uptake and metabolism in the preimplantation mouse embryo. Biol Reprod. 2000;62(1):16-22.

[33]Johnson MH, Nasr-Esfahani MH. Radical solutions and cultural problems: could free oxygen radicals be responsible for the impaired development of preimplantation mammalian embryos in vitro? Bioessays.1994;16(1):31-38.

[34]Schini SA, Bavister BD. Two-cell block to development of cultured hamster embryos is caused by phosphate and glucose. Biol Reprod. 1988;39(5):1183-1192.

[35]Chatot CL, Ziomek CA, Bavister BD, et al. An improved culture medium supports development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil.1989;86(2):679-688.

[36]Lane M, Gardner DK. Increase in postimplantation development of cultured mouse embryos by amino acids and induction of fetal retardation and exencephaly by ammonium ions. J Reprod Fertil. 1994;102(2):305-312.

[37]Ludwig TE, Squirrell JM, Palmenberg AC, et al. Relationship between development, metabolism, and mitochondrial organization in 2-cell hamster embryos in the presence of low levels of phosphate. Biol Reprod. 2001;65(6):1648-1654.

[38]Bedzhov I, Graham SJ, Leung CY, et al. Developmental plasticity, cell fate specification and morphogenesis in the early mouse embryo. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2014;369(1657):20130538.

[39]Kirkegaard K, Ahlström A, Ingerslev HJ, et al. Choosing the best embryo by time lapse versus standard morphology. Fertil Steril. 2015;103(2):323-332.

[40]Rose-Hellekant TA, Libersky-Williamson EA, Bavister BD. Energy substrates and amino acids provided during in vitro maturation of bovine oocytes alter acquisition of developmental competence. Zygote. 1998;6(4):285-294.

[41]Bavister BD, Arlotto T. Influence of single amino acids on the development of hamster one-cell embryos in vitro. Mol Reprod Dev. 1990;25(1):45-51.

[42]Spindle AI, Pedersen RA. Hatching, attachment, and outgrowth of mouse blastocysts in vitro: fixed nitrogen requirements. J Exp Zool. 1973;186(3):305-318.

[43]Swain JE, Carrell D, Cobo A, et al. Optimizing the culture environment and embryo manipulation to help maintain embryo developmental potential. Fertil Steril. 2016;105(3):571-587.

[44]Olson SE, Seidel GE Jr. Culture of in vitro-produced bovine embryos with vitamin E improves development in vitro and after transfer to recipients. Biol Reprod. 2000;62(2):248-252.

[45]Kane MT. The effects of water-soluble vitamins on the expansion of rabbit blastocysts in vitro. J Exp Zool. 1988;245(2):220-223.

[46]Carolan C, Lonergan P, Van Langendonckt A, et al. Factors affecting bovine embryo development in synthetic oviduct fluid following oocyte maturation and fertilization in vitro. Theriogenology.1995;43(6): 1115-1128.

[47]Sagirkaya H, Misirlioglu M, Kaya A, et al. Developmental potential of bovine oocytes cultured in different maturation and culture conditions. Anim Reprod Sci. 2007;101(3-4):225-240.

[48]Li XX, Cao PH, Han WX, et al. Non-invasive metabolomic profiling of culture media of ICSI- and IVF-derived early developmental cattle embryos via Raman spectroscopy. Anim Reprod Sci. 2018;196:99-110.

[49]Youssef MM, Mantikou E, van Wely M, et al. Culture media for human pre-implantation embryos in assisted reproductive technology cycles. Cochrane Database Syst Rev. 2015;(11):CD007876.

[50]Mattioli M, Galeati G, Barboni B, et al. Concentration of cyclic AMP during the maturation of pig oocytes in vivo and in vitro. J Reprod Fertil. 1994;100(2):403-409.

[51]Nureddin A, Epsaro E, Kiessling AA. Purines inhibit the development of mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil. 1990;90(2):455-464.

[52]Loutradis D, John D, Kiessling AA. Hypoxanthine causes a 2-cell block in random-bred mouse embryos. Biol Reprod. 1987;37(2):311-316.

[53]Bouillon C, Léandri R, Desch L, et al. Does Embryo Culture Medium Influence the Health and Development of Children Born after In Vitro Fertilization? PLoS One. 2016;11(3):e0150857.

[54]Kane MT, Carney EW, Ellington JE. The role of nutrients, peptide growth factors and co-culture cells in development of preimplantation embryos in vitro. Theriogenology. 1992;38(2):297-313.

[55]Flood MR, Gage TL, Bunch TD. Effect of various growth-promoting factors on preimplantation bovine embryo development in vitro. Theriogenology. 1993;39(4):823-833.

[56]Li X, Xu Y, Fu J, et al. Non-invasive metabolomic profiling of embryo culture media and morphology grading to predict implantation outcome in frozen-thawed embryo transfer cycles. J Assist Reprod Genet. 2015; 32(11):1597-1605.

[57]Rieger D, Luciano AM, Modina S, et al. The effects of epidermal growth factor and insulin-like growth factor I on the metabolic activity, nuclear maturation and subsequent development of cattle oocytes in vitro. J Reprod Fertil. 1998;112(1):123-130.

[58]Swain JE. Optimal human embryo culture. Semin Reprod Med. 2015; 33(2):103-117.

[59]Shi F, Li H, Wang E, et al. Melatonin reduces two-cell block via nonreceptor pathway in mice. J Cell Biochem. 2018;119(11):9380-9393.

[60]Mishra A, Reddy IJ, Gupta P, et al. Developmental regulation and modulation of apoptotic genes expression in sheep oocytes and embryos cultured in vitro with L-carnitine. Reprod Domest Anim. 2016;51(6):1020-1029.

[61]Takahashi M, Honda T, Hatoya S, et al. Efficacy of mechanical micro-vibration in the development of bovine embryos during in vitro maturation and culture. J Vet Med Sci. 2018;80(3):532-535.

[62]Highet AR, Bianco-Miotto T, Pringle KG, et al. A novel embryo culture media supplement that improves pregnancy rates in mice. Reproduction. 2017;153(3):327-340.

[63]Borland RM, Biggers JD, Lechene CP, et al. Elemental composition of fluid in the human Fallopian tube. J Reprod Fertil. 1980;58(2):479-482.

[64]Duan XG, Huang ZQ, Hao CG, et al. The role of propofol on mouse oocyte meiotic maturation and early embryo development. Zygote. 2018;26(4):261-269.

[65]Gardner DK, Lane M. Amino acids and ammonium regulate mouse embryo development in culture. Biol Reprod. 1993;48(2):377-385.

[66]Nakamura H, Hosono T, Kumasawa K, et al. Vaginal bioelectrical impedance determines uterine receptivity in mice. Hum Reprod. 2018;33(12):2241-2248.

[67]Roblero LS, Guadarrama A, Ortiz ME, et al. High potassium concentration and the cumulus corona oocyte complex stimulate the fertilizing capacity of human spermatozoa. Fertil Steril. 1990;54(2): 328-332.

[68]Swain JE. Optimizing the culture environment in the IVF laboratory: impact of pH and buffer capacity on gamete and embryo quality. Reprod Biomed Online. 2010;21(1):6-16.

[69]Amir AA, Kelly JM, Kleemann DO, et al. Phyto-oestrogens affect fertilisation and embryo development in vitro in sheep. Reprod Fertil Dev. 2018. doi: 10.1071/RD16481. [Epub ahead of print]

[70]Graves CN, Biggers JD. Carbon dioxide fixation by mouse embryos prior to implantation. Science. 1970;167(3924):1506-1508.

[71]Azambuja RM, Kraemer DC, Westhusin ME. Effect of low temperatures on in-vitro matured bovine oocytes. Theriogenology. 1998;49(6):1155-1164.

[72]Latorre-Pellicer A, Moreno-Loshuertos R, Lechuga-Vieco AV, et al. Corrigendum: Mitochondrial and nuclear DNA matching shapes metabolism and healthy ageing. Nature. 2017;542(7639):124.

[73]Hu K, Yu Y. Metabolite availability as a window to view the early embryo microenvironment in vivo. Mol Reprod Dev. 2017;84(10):1027-1038.

[74]Wondimu SF, von der Ecken S, Ahrens R, et al. Integration of digital microfluidics with whispering-gallery mode sensors for label-free detection of biomolecules. Lab Chip. 2017;17(10):1740-1748.

[75]Lee YS, Thouas GA, Gardner DK. Developmental kinetics of cleavage stage mouse embryos are related to their subsequent carbohydrate and amino acid utilization at the blastocyst stage. Hum Reprod. 2015; 30(3):543-552.

[76]Wheeler MB, Rubessa M. Integration of microfluidics in animal in vitro embryo production. Mol Hum Reprod. 2017;23(4):269.

引言

胚胎工程是现代生物技术的一大亮点，是指在实验室人为地干预下，对胚胎进行改造操作。早期胚胎体外培养技术是胚胎工程的基础，也是其重要的环节之一。进入21世纪以后，胚胎工程技术在哺乳动物胚胎\配子超低温冷冻保存技术、超数排卵和胚胎移植技术、胚胎干细胞分离与培养技术等方面取得了令人瞩目的成就。

如何利用早期胚胎体外培养技术生产出一定数量高质量、发育潜力优良、抗冻性好的胚胎，特别是囊胚，已经成为动物胚胎工程的重大课题。许多研究者使用动物的输卵管作为早期胚胎的培养系统。通过体内实验的研究，发现多种有关胚胎发育的有益因子，这为体外培养系统的建立提供参考。早期胚胎是指未与子宫建立组织联系的游离阶段的胚胎，包括受精卵开始经过卵裂、2-细胞、8-细胞、桑椹胚、囊胚等阶段的胚胎^[1]。体细胞核移植技术自1997年成功问世以来，体细胞核移植技术在转基因动物的研究上得到了大量推广应用，先是成功制作了克隆羊“多利”，随后制备了转基因猪、鼠、牛动物^[2]。1978年，通过人类辅助生殖技术成功诞生的全世界第1例试管婴儿，预示着辅助生殖技术在未来临床研究的巨大潜力^[3]。

胚胎工程技术中的关键环节是对离体后的胚胎进行体外培养，因此体外胚胎培养越来越受到重视^[4]。早期胚胎体外培养体系主要是尽可能模拟母体输卵管的生理环境构建培养环境，虽然体外培养已经历几十年发展，但还存在胚胎质量差、囊胚率低等问题。随着改良培养液配方和胚胎培养体系以及静置培养体系逐渐发展为动态培养体系，体外培养技术已得到较大的提升^[5]，当然，这些技术一定要在严格遵循医学伦理学标准的前提下才可以研究和开展相关工作。因此，作者拟对目前胚胎体外培养系统中应用较多的胚胎体外培养相关的培养方法、培养环境及培养液成分等问题进行综述。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

体外胚胎培养是胚胎工程技术的关键环节

In vitro embryo culture is the core of embryo engineering technology

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[1]	吴训, 孟娟红, 张建运, 王亮. 浓缩生长因子修复兔髁突全层软骨损伤[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1166-1171.
[2]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[3]	李偲, 赵婷, 谭戈, 郑雨林, 张若男, 吴艳, 唐俊明. 血小板源生长因子BB可促进骨骼肌成肌细胞增殖、分化与迁移[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1050-1055.
[4]	罗选翔, 经历, 潘彬, 冯虎. 甲钴胺联合鼠神经生长因子促进脊髓型颈椎病术后神经功能的恢复[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 719-722.
[5]	聂慧娟, 黄织春. 转化生长因子β1诱导心肌成纤维细胞转分化过程中Hedgehog信号通路的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 754-760.
[6]	张振坤, 李喆, 李亚, 王莹莹, 王亚苹, 周馨魁, 马珊珊, 关方霞. 海藻酸盐基水凝胶/敷料在创面愈合中的应用：持续、动态与顺序释放[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 638-643.
[7]	姜涛, 马磊, 李志强, 寿玺, 段明军, 吴硕, 马创, 魏琴. 血小板衍生生长因子BB诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3937-3942.
[8]	郝晓娜, 张英杰, 李玉云, 许涛. 过表达脯氨酰寡肽酶的骨髓间充质干细胞修复肝纤维化模型大鼠[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3988-3993.
[9]	刘金伟, 陈允震, 万春友. 应力作用下骨不连断端组织中成骨因子的变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3619-3624.
[10]	周武, 王彬娉, 王雅雯, 程亚楠, 黄谢山. 转化生长因子β和骨形成蛋白2联合诱导小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞的增殖与分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3630-3635.
[11]	谢阳, 吕志宇, 张淑江, 龙婷, 李作孝. 重组腺病毒介导神经生长因子转染实验性自身免疫性脑脊髓炎模型小鼠少突胶质细胞的凋亡及髓鞘化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3678-3683.
[12]	杨莉, 李雪莉, 宋静卉, 禹卉千, 王伟霞. 隐丹参酮抑制模型兔耳增生性瘢痕的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(20): 3150-3155.
[13]	魏琴, 张雪, 马磊, 李志强, 寿玺, 段明军, 吴硕, 贾麒钰, 马创. 血小板衍生生长因子BB诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 2953-2957.
[14]	张圣敏, 曹长红, 刘超. 浓缩生长因子负载脂肪干细胞预防SD大鼠双膦酸盐类药物相关性颌骨骨坏死[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 2982-2987.
[15]	艾力麦尔旦•艾尼瓦尔, 王玲, 古丽, 迪丽达尔•塔西甫拉提, 王珊, 尹宏斌. 转化生长因子β3对成骨细胞增殖和成骨能力的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(17): 2664-2669.