包埋载音猬因子壳聚糖微球纤维蛋白支架对鼻黏膜来源外胚层间充质干细胞分化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1807

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (29): 4694-4700.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1807

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

包埋载音猬因子壳聚糖微球纤维蛋白支架对鼻黏膜来源外胚层间充质干细胞分化的影响

崔学文¹，杨开元¹，杨文静²，陆浩¹，史文涛¹，陈平波¹，毕士奇¹，沈元昊²，张志坚²

¹江苏大学附属医院骨科，江苏省镇江市 212001；²江苏大学医学院，江苏省镇江市 212013

修回日期:2019-05-04 出版日期:2019-10-18 发布日期:2019-10-18
通讯作者: 杨文静，博士，副教授，江苏大学医学院，江苏省镇江市 212013
作者简介:崔学文，男，1968年生，山东省泰安市人，汉族，2006年第二军医大学毕业，博士，主任医师，主要从事脊柱方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(51403086)，项目负责人：杨文静；江苏省自然科学基金(BK20140544)，项目负责人：杨文静；江苏大学高级人才启动基金(13JDG089)，项目负责人：杨文静

Effect of fibrin glue scaffolds embedded with sonic hedgehog-loaded chitosan microspheres on the differentiation of nasal mucosa-derived ectomesenchymal stem cells

Cui Xuewen¹, Yang Kaiyuan¹, Yang Wenjing², Lu Hao¹, Shi Wentao¹, Chen Pingbo¹, Bi Shiqi¹, Shen Yuanhao², Zhang Zhijian²

¹Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212001, Jiangsu Province, China; ²School of Medicine, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, Jiangsu Province, China

Revised:2019-05-04 Online:2019-10-18 Published:2019-10-18
Contact: Yang Wenjing, MD, Associate professor, School of Medicine, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 51403086 (to YWJ); the Natural Science Foundation of Jiangsu Province, No. BK20140544 (to YWJ); Top Talents Startup Fund of Jiangsu University, No. 13JDG089 (to YWJ)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
外胚层间充质干细胞：是来源于胚胎发育过程中外胚层神经嵴的成体干细胞，主要分布于鼻腔的嗅上皮、嗅神经及中枢神经系统的神经纤维层和小球层内，可从呼吸部黏膜中取材，包括中、下鼻甲及相应的鼻道及鼻中隔中下部分黏膜。与嗅黏膜相比，呼吸部黏膜的取材量较大，手术操作更方便，损伤小，且对嗅觉无损伤。外胚层间充质干细胞在一定条件下可以诱导分化为神经细胞，包括许旺细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞和神经元细胞，也可以分化为成骨细胞、成软骨细胞、骨骼肌细胞、角膜细胞和血管内皮细胞。
壳聚糖：是天然生物大分子甲壳素通过脱乙酰而得到的衍生物。它不仅具有优良的生物相容性、可降解性，而且还具有消炎、抗菌、止血及抑制癌细胞转移等大多数聚合物所不具有的功能。以壳聚糖为原料而制备的微胶囊，日益成为药物控释的新热点。将神经营养因子包埋于壳聚糖缓释微球内，为解决其在生物体内降解快、易变性、难以维持有效药物浓度等问题提供了可能。

摘要
背景：脊髓组织工程的基本思路是将体外分离培养的种子细胞种植到具有三维结构的生物材料支架上，并加入生物活性因子保持一定浓度，构成具有生物活性的细胞-支架复合物。然而如何构建合理的细胞生长微环境以及维持生物活性因子的最佳浓度一直面临诸多问题。该实验创新性地提出了双交联缓释体系，持续稳定地释放神经营养因子，以便更好地促进种子细胞的生长与分化。
目的：利用冷冻干燥法，将包载音猬因子的壳聚糖微球填充于纤维蛋白胶，构建具有三维结构的复合生物工程支架，探讨该支架对外胚层间充质干细胞向神经元样细胞分化的影响。
方法：①采用离子凝胶法制备包载音猬因子的壳聚糖微球，而后将其与纤维蛋白胶混合，冷冻干燥成型，即得到包埋载音猬因子壳聚糖微球的纤维蛋白支架，采用扫描电子显微镜观察支架微观结构和ELISA检测音猬因子缓释效果，并制备包载音猬因子的纤维蛋白支架和包载音猬因子的壳聚糖微球作为对照；②采用悬浮抗贴壁法获取外胚层间充质干细胞来源的神经球样细胞分别种植于上述支架和经多聚赖氨酸修饰的圆玻片上，加入神经诱导培养基培养。14 d后免疫荧光标记神经细胞相关蛋白β3-Tubulin、MAP-2和MBP，采用Western blot方法测定神经细胞相关蛋白表达水平。
结果与结论：①扫描电子显微镜观察纤维蛋白胶经冷冻干燥后呈海绵型网状结构，载音猬因子的壳聚糖微球均匀分散在其中；②ELISA检测结果显示复合纤维蛋白支架缓释速度较为平缓且持续时间较长，形成更稳定、持续的缓释体系；③免疫荧光染色显示复合纤维蛋白支架组高表达神经细胞相关蛋白；同时，Western blot检测结果显示复合纤维蛋白支架组表达的神经细胞相关蛋白水平明显高于其他组(P < 0.05)；④结果表明，壳聚糖复合纤维蛋白支架缓释效果较好，该复合支架对外胚层间充质干细胞来源神经球向神经元样细胞分化有一定的促进作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-9062-2895(杨文静)

关键词: 外胚层间充质干细胞, 壳聚糖, 音猥因子, 纤维蛋白胶, 复合纤维蛋白支架, 缓释, 神经球样细胞, 神经元, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The basic idea of spinal tissue engineering is to plant seed cells isolated and cultured in vitro onto a biomaterial scaffold with three-dimensional structure, where bioactive factors are added to maintain a certain concentration, eventually forming a biologically active cell-scaffold complex. However, how to construct a suitable cell growth microenvironment and maintain the optimal concentration of bioactive factors has been faced with many problems. This experiment innovatively proposed a double-crosslinking release system, which continuously released neurotrophic factors and promoted the growth and differentiation of seed cells.
OBJECTIVE: To fabricate a fibrin glue scaffold incorporated with sonic hedgehog (SHH)-loaded chitosan microspheres to construct a biologically active cell-scaffold complex with three-dimensional structure, and to investigate its effect on the differentiation of nasal mucosa-derived ectomesenchymal stem cells (EMSCs) into neuron-like cells.
METHODS: (1) Firstly, the SHH-containing chitosan microspheres were prepared via ionic gel method, and then mixed with fibrin glue; thus, the fibrin glue scaffolds embedded with SHH-loaded chitosan microspheres were prepared after freeze-drying. The structure of composite scaffold was observed with scanning electron microscope and the ELISA kit was employed to study the SHH releasing behavior. Meanwhile, the SHH-loaded chitosan scaffold and the SHH/fibrin scaffold were prepared as control. (2) The EMSCs-derived neurospheres cultured by suspension culture methods were transplanted on the above scaffolds and poly-L-lysine-coated glass, respectively. After co-cultured for 14 days, the differentiation of EMSCs was investigated with immunofluorescence staining (β3-Tubulin, MAP-2 and MBP) and western blot.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Under the scanning electron microscope, the fibrin glue/chitosan/SHH scaffold after lyophilization had reticular structure, which looked like sponge, and SHH-loaded chitosan microspheres were dispersed uniformly. (2) ELISA results showed that the release of SHH from the fibrin glue/chitosan/SHH scaffold was relatively gentle and could last for a longer time to form a more stable and sustained release system. (3) Immunofluorescence staining indicated that EMSCs could highly expressed neuron-related proteins after co-cultured with the fibrin glue/chitosan/SHH scaffold. Western blot results indicated that the expression of neuron-related proteins in the fibrin glue/chitosan/SHH scaffold was better than that in the control group (P < 0.05). These results indicate that the fibrin glue/chitosan/SHH scaffold exhibits good sustained drug release effect, and certainly promote the differentiation of EMSCs towards neuron-like cells.

Key words: ectomesenchymal stem cells, chitosan, sonic hedgehog, fibrin glue, composite fibrin scaffold, sustained release, neurosphere-like cells, neurons, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

崔学文，杨开元，杨文静，陆浩，史文涛，陈平波，毕士奇，沈元昊，张志坚. 包埋载音猬因子壳聚糖微球纤维蛋白支架对鼻黏膜来源外胚层间充质干细胞分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(29): 4694-4700.

Cui Xuewen, Yang Kaiyuan, Yang Wenjing, Lu Hao1, Shi Wentao, Chen Pingbo, Bi Shiqi, Shen Yuanhao, Zhang Zhijian. Effect of fibrin glue scaffolds embedded with sonic hedgehog-loaded chitosan microspheres on the differentiation of nasal mucosa-derived ectomesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(29): 4694-4700.

图/表（结果） 3

2.1 扫描电镜观察微球和支架形态 壳聚糖微球呈规则的圆形，表面不平，经冷冻干燥后平均粒径在10 μm左右；纤维蛋白支架为海绵形的网格状结构，网格的内径在50 μm左右；复合纤维蛋白支架中，壳聚糖微球均匀地分布在纤维蛋白支架网格内，形成稳定的三维空间结构，见图1。

2.2 ELISA测定微球、支架缓释效率 将ELISA试剂盒测得的缓释不同时间段的样品吸光度值代入标准曲线方程，得到不同时间段的音猬因子浓度，绘制成缓释曲线。壳聚糖微球组、纤维蛋白支架组在早期(2 d内)音猬因子迅速释放，随后2-10 d释放缓慢，最后4 d进入平台期并最终在11-14 d释放完全。而复合纤维蛋白支架组在早期(1 d内)音猬因子释放较快，随后1-10 d内匀速释放，最后4 d释放渐缓且仍未缓释完全，见图2。

2.3 外胚层间充质干细胞的形态学和表面标志鉴定结果 第1代大鼠鼻黏膜细胞形成小集群分布，早期扁平多边形上皮样细胞为优势细胞，呈鹅卵石状，巢样分布。随传代次数增加上皮样细胞逐渐消失，梭形的外胚层间充质干细胞增殖较快，当细胞铺满瓶底时，可见大量长条形纺锤状细胞平行排列。免疫荧光染色可观察到传代培养的外胚层间充质干细胞表达vimentin、nestin，见图3，且这2种表面标志物的表达率都大于98%，这表明分离培养的外胚层间充质干细胞纯度较高。

2.4 外胚层间充质干细胞来源神经球的形态学和表面标志鉴定结果 当更换为神经球诱导培养基后，外胚层间充质干细胞迅速聚合成球状。培养7 d后，逐渐形成外表透亮，悬浮在培养基中的神经球样细胞。免疫荧光染色可观察到外胚层间充质干细胞来源的神经球表达nestin、CD133，见图3。

2.5 免疫荧光染色检测支架中神经再生相关蛋白的表达 将外胚层间充质干细胞来源神经球分别接种于经多聚赖氨酸修饰的圆玻片(BLANK)、壳聚糖微球(CS-SHH)、纤维蛋白支架(FG-SHH)、复合纤维蛋白支架(FG-CS-SHH)上，用Neurobasal培养基培养后细胞进入分化状态。神经球在纤维蛋白支架和多聚赖氨酸修饰的玻璃片上均贴壁良好，3 d后从神经球边缘伸出许多细小突起。培养过程中动态观察，可见复合纤维蛋白支架组神经球内细胞逐渐向周围迁移并长出丝状突起，而壳聚糖微球组以及纤维蛋白支架组神经球内细胞迁移不明显，空白对照组几乎没有细胞迁移。14 d后行β3-Tubulin、MAP-2、MBP免疫荧光染色结果显示：复合纤维蛋白支架组 β3-Tubulin、MAP-2染色可见细胞自神经球向四周辐射状生长出细长突起，神经纤维连织成网。纤维蛋白支架组与壳聚糖微球组神经球内迁移出的细胞所形成的突起较少，未能形成完整的神经网络。空白对照组中几乎没有突起形成。复合纤维蛋白支架组MBP染色可见神经球逐渐分化形成髓鞘样结构，而纤维蛋白支架组与壳聚糖微球组髓鞘样结构形成较少，空白对照组几乎没有髓鞘样结构形成，见图4。

2.6 免疫印迹检测支架中神经再生相关蛋白的表达 各组细胞培养14 d后进行免疫印迹检测β3-Tubulin、MAP-2、MBP蛋白表达，结果显示：复合纤维蛋白支架组>纤维蛋白支架组>壳聚糖微球组>空白对照组，统计学分析显示3种蛋白表达量在各组间差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图5。结果表明复合纤维蛋白支架能诱导外胚层间充质干细胞来源神经球分化为新生神经元以及髓鞘，该复合纤维蛋白支架的效果更优于纤维蛋白支架以及壳聚糖微球。

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引言

脊髓损伤是脊椎骨折最严重的并发症，常导致患者损伤节段以下瘫痪，高位脊髓损伤甚至导致患者全瘫而丧失基本生活能力^[1]；尽管脊髓损伤的病理过程已得到明确的阐释^[2]，然而脊髓损伤的治疗仍然不容乐观。

纤维蛋白是来源于血液的细胞外基质，其具有良好的可塑性和降解性^[3-4]。研究表明，纤维蛋白是具有降低炎症反应功能的生物大分子，可为细胞的生长提供良好的微环境^[5-6]。众所周知，壳聚糖是天然生物大分子甲壳素通过脱乙酰而得到的衍生物^[7]，其不仅具有优良的生物可降解性、生物相容性和生物交联黏附性，而且还具有消炎、抗菌、止血等大多数聚合物所不具有的功能^[8-10]。研究表明，外胚层间充质干细胞来源于胚胎时期的神经嵴，保留多向分化潜能^[11-12]。课题组发现在人和大鼠下鼻甲呼吸黏膜部位存在大量的外胚层间充质干细胞，进一步研究发现，外胚层间充质干细胞在特定的诱导条件下，可分化为成骨细胞、神经元和神经胶质细胞等^[13]。最重要的是，外胚层间充质干细胞可通过非侵入性的方式从下鼻甲鼻腔黏膜中获取，并且对嗅觉系统无任何损伤。

以往课题组构建了缓释音猬因子的壳聚糖纳米颗粒，然而出现了壳聚糖前期爆发性缓释、后期释放因子不足的情况^[14]，加之壳聚糖本身对细胞亲和力不够理想，一定程度上限制了其作为支架材料的广泛应用^[15-16]。鉴于此，实验构建包埋载音猬因子壳聚糖的纤维蛋白复合支架，利用纤维蛋白的多孔结构、药物缓释及良好的生物相容性，更有效地诱导外胚层间充质干细胞分化，并设法引导神经纤维延伸促进突触的形成，进而实现脊髓组织结构的重建。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学体外分化实验。

1.2 时间及地点 于2017年3月至2018年3月在江苏大学医学院实验大型平台完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 雌性SD大鼠30只，6-8周龄，体质量50-80 g，由江苏大学实验动物中心提供。

1.3.2 实验试剂和仪器 胎牛血清、DMEM/F12培养基、Neurobasal培养液、B27(Gibco公司)；表皮生长因子、成纤维细胞生长因子和音猬因子(PetroTech公司)；全反式维A酸、壳聚糖、纤维蛋白、凝血酶(Sigma公司)；小鼠抗NF200、小鼠抗β3-Tubulin、兔抗MAP-2(Santa Cruz公司)；兔抗nestin、兔抗vimentin、兔抗CD44、兔抗CD133、小鼠抗 β-Tubulin(作为免疫印迹测定内参)、羊抗兔IgG-Cy3、羊抗小鼠IgG-Cy3、HRP结合的羊抗兔IgG、HRP结合的羊抗鼠IgG(武汉博士德生物公司)；Marker(Thermo Scientific公司)；音猬因子ELISA试剂盒(X-Y Biotechnology公司)；培养瓶、培养板、多聚赖氨酸(南京Corning公司)；吐温80、司班80、三聚磷酸钠(国药集团化学试剂有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 壳聚糖微球(CS-SHH)、纤维蛋白凝胶支架(FG-SHH)、复合纤维蛋白支架(FG-CS-SHH)的制备及扫描电镜观察 取2 mL吐温80，4 mL司班80，共同放入烧杯中，加入液体石蜡定容到100 mL，放在搅拌机下搅拌均匀，混匀后加入5 mL 2%(2 g壳聚糖加双蒸水定容到100 mL)壳聚糖，继续搅拌，搅拌至半透明，再加入1%三聚磷酸钠4 mL，继续搅拌，搅拌至乳白色，最后加入1%京尼平3 mL，调节pH值至5，继续搅拌5 h。当溶液变成蓝色且杯底有沉淀颗粒时停止反应，将溶液装入离心管中，调节转速1 000 r/min，离心10 min；离心后将上层液体吸出，再加入石油醚清洗颗粒，清洗2遍；接着用无水乙醇清洗2遍；最后用PBS清洗2遍；离心后吸去上层液体。将得到的颗粒样品冷冻干燥后即得到制备的微胶囊颗粒。将5 mg颗粒放入含1 μg音猬因子的PBS(5 mL)中交联3 h，然后高速离心分离得到的沉淀冷冻干燥即为壳聚糖微球(CS-SHH)。

用生理盐水溶解纤维蛋白单体粉末，于37 ℃恒温箱内促溶，制成质量浓度为40 g/L的纤维蛋白溶液。用生理盐水溶解凝血酶粉末，制成浓度为20 U/mL的凝血酶溶液。取50 μL凝血酶溶液充分溶解1 μg音猬因子粉末，与50 μL纤维蛋白原溶液一起混合入24孔板中，两溶液一经接触即在几秒内反应成20 g/L的纤维蛋白凝胶，得到包载音猬因子的纤维蛋白凝胶支架(FG-SHH)。

取50 μL凝血酶溶液与5 mg壳聚糖微球充分混匀，再与50 μL纤维蛋白原溶液一起混合入24孔板中，得到复合纤维蛋白支架(FG-CS-SHH)。

运用扫描电镜观察与比较壳聚糖微球、纤维蛋白支架、复合纤维蛋白支架的内部结构。

1.4.2 壳聚糖微球、纤维蛋白支架以及复合纤维蛋白支架的缓释动力学测定 将5 mg壳聚糖微球、100 μL纤维蛋白支架、100 μL复合纤维蛋白支架置入3个2 mL的EP管内，然后向EP管中加入1 mL的PBS(pH=7.4)体外缓释液，置于37 ℃恒温箱内转速为1 000 r/min的摇床中，取每支EP管中不同时间段(1，6，12 h和1，2，4，8，10，12，14 d)上清液，每次取样500 μL，同时补加等温、同体积的释药介质，即PBS溶液。用ELISA试剂盒测定样品浓度，每个样品重复测定3次，计算其平均值。根据结果，绘制缓释曲线，比较3种样品的缓释效果。

1.4.3 鼻黏膜来源外胚层间充质干细胞的分离培养及干细胞特性检测 取50-80 g雌性SD大鼠，10%水合氯醛(330 mg/kg)腹腔注射麻醉，无菌条件下经鼻孔沿鼻腔向上至内眦部剪开皮肤及鼻骨，暴露鼻中隔黏膜，剪取下1/3鼻中隔置PBS中，剥离全层鼻黏膜。鼻黏膜取出后用无血清DMEM/F12培养基(含青霉素200 U/mL和链霉素200 U/mL)漂洗3次，置于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基(即普通完全培养基)中，充分剪碎，将碎组织块接种于培养瓶，置细胞培养箱中培养，3 d后将悬浮的细胞吸出并补充新的培养基，每3 d换液1次，当细胞铺满瓶底时进行消化，传代。

将第3代细胞接种于24孔培养板，分别用干细胞标志vimentin、nestin进行免疫荧光染色，鉴定细胞的干细胞特性。具体操作如下：细胞用含40 g/L多聚甲醛的PBS固定后，PBS漂洗3遍，37 ℃下于0.25% Triton X-100和3% BSA混合液中封闭30 min，分别用兔抗vimentin，兔抗nestin(均为1∶100)孵育过夜，PBS漂洗后用羊抗兔IgG-Cy3(1∶200)室温下孵育1 h，PBS漂洗3遍，Hochest 33342复染细胞核，PBS漂洗，甘油封固，于荧光显微镜下观察并摄片，阴性对照用PBS代替第一抗体，其余步骤同上。

1.4.4 外胚层间充质干细胞来源神经球的培养及表面标志蛋白的鉴定 将上述第3代外胚层间充质干细胞接种于24孔板上，将DMEM/F12完全培养基更换为神经球诱导培养基(即无血清DMEM/F12培养基中含2% B27、20 μg/L表皮生长因子、20 μg/L成纤维生长因子)继续培养，2 d换液1次，诱导培养7 d。当外胚层间充质干细胞形成神经球后进行扩增传代形成次级神经球，用含40 g/L多聚甲醛的PBS固定24 h。以兔抗nestin、兔抗CD133(均为1∶100)和相应羊抗兔IgG-Cy3为二抗(1∶200)进行免疫荧光染色，染色方法同上。阴性对照用PBS代替第一抗体，其余步骤同上。

1.4.5 神经球的诱导分化及免疫荧光鉴定 上述培养的外胚层间充质干细胞来源神经球经自然沉淀后弃去上清，添加少量的Neurobasal培养基(含2% B27、体积分数为10%胎牛血清、1 mg/L全反式维A酸)，轻轻吹打使神经球均匀悬浮，将其接种于经多聚赖氨酸修饰的圆玻片(BLANK)、壳聚糖微球(CS-SHH)、纤维蛋白支架(FG-SHH)或复合纤维蛋白支架(FG-CS-SHH)的24孔培养板中，置37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱内培养，两三天后半量换液，显微镜下观察神经球的分化及细胞迁移情况。培养14 d后用40 g/L多聚甲醛固定，以鼠抗 β3-Tubulin、兔抗MAP-2、兔抗MBP(均为1∶100)和相应羊抗鼠 IgG-Cy3、羊抗兔IgG-Cy3为二抗(1∶200)进行免疫荧光染色，染色方法同上。

1.4.6 免疫印迹检测神经再生相关蛋白表达 培养14 d后各组选取3个孔，倒去培养液，用预冷的PBS清洗去除残余培养液，每孔加入50 μL裂解液，用细胞刮将细胞刮下，迅速收集细胞于EP管中，置冰浴裂解45 min，4 ℃ 10 000 r/min离心5 min，取上清，然后与等体积2×上样缓冲液混匀后煮沸5 min，冻存于-70 ℃备用。常规配置聚丙烯酰胺凝胶，电泳，转膜，封闭，以鼠抗β3-Tubulin IgG(1∶500)、兔抗MAP-2 IgG(1∶500)和兔抗MBP IgG(1∶500)室温孵育3 h，以HRP结合的山羊抗小鼠IgG或HRP结合的山羊抗兔IgG(1∶5 000)室温孵育1 h，ECL-plus作为发光剂，于分子成像系统(Typhoon9400)上扫描。以β-tubulin作为内参，测定各泳道(各组)β3-Tubulin、MAP-2和MBP蛋白条带与β-tubulin蛋白条带的吸光度并计算其比值，进行统计学处理。

1.5 主要观察指标 壳聚糖微球、纤维蛋白支架、复合纤维蛋白支架培养外胚层间充质干细胞来源神经球向神经元样细胞分化的情况，以及神经再生相关蛋白的表达。

1.6 统计学分析 实验数据用x(_)±s表示，采用SPSS 22.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

脊髓损伤后会形成组织凋亡性空洞，随后过度增殖的星形胶质细胞形成胶质瘢痕组织填补该空洞^[17^-18^]；然而，过度增殖的胶质瘢痕会阻碍神经元和神经轴突再生，最终导致脊髓上下通行束连接中断。因此，使用组织工程支架搭载外源性细胞以填补组织缺损是有效修复脊髓损伤的重要策略^[1⁹^-2²^]。实验在原有研究基础上，以组织工程“三要素”，即生物活性分子、种子细胞和三维支架的优化组合为切入点，同时利用药物缓释技术，构建一种具有三维空间立体结构，可缓释音猬因子的复合型生物支架，并探讨该支架对外胚层间充质干细胞分化的影响。

壳聚糖作为种子细胞及各类生长因子的载体，被广泛应用于各类组织工程中^[2^3-24^]。但最近研究表明，壳聚糖对细胞亲和力不够理想，需通过复合其他材料或表面改性，以更有利于细胞的黏附与增殖^[15-16]。纤维蛋白原在凝血活酶作用下形成可溶性纤维蛋白分子，后者在凝血酶的作用下交联形成网状结构，有利于细胞的黏附、增殖^[2⁵^]，其内部的三维网状结构更是再生神经纤维延伸的物质基础^[2⁶^]。实验构建一种纤维蛋白包埋壳聚糖微球的三维复合型生物支架，扫描电镜显示复合支架呈海绵型的网格状结构，平均孔径50 μm左右，壳聚糖微球均匀分布其中，具有良好的生物/材料空间界面，为细胞的生长提供了良好的微环境。

利用药物缓释技术解决神经营养因子半衰期短、消耗快的问题一直是近期国内外研究的热点^[2⁷^-2⁸^]。课题组通过构建缓释音猬因子的壳聚糖微球，缓释效果较好；然而，该颗粒缓释不平衡，出现前期音猬因子迅速释放，后期释放不足的“暴释”现象。为了进一步解决这个问题，课题组采用纤维蛋白包埋壳聚糖微球的复合型支架，构建一种壳聚糖交联音猬因子后缓释出音猬因子，并进一步与纤维蛋白再次交联的二梯阶缓释体系。音猬因子通过共价键与壳聚糖交联，同时音猬因子通过氢键与纤维蛋白形成交联，双交联使音猬因子缓释更为平缓^[2⁹^-³⁰^]。通过ELISA法测定复合生物支架缓释音猬因子的效果，结果显示所构建的复合生物支架未出现“暴释”现象，缓释平缓，持续时间较长，这说明构建的支架比以往研究报道中的缓释颗粒具有更好的缓释效果。

鼻腔黏膜来源外胚层间充质干细胞为原始干细胞亚群结构层次的干细胞，保留多向分化潜能，而且呼吸部黏膜面积较大，包括中下鼻甲及鼻中隔中下份等，取材量较大，取材方便，对嗅觉无损伤^[^31-32^]。有趣的是，将外胚层间充质干细胞种植于纤维蛋白表面，二者具有良好生物相容性，进一步发现纤维蛋白具有促进外胚层间充质干细胞向其他细胞分化的潜能^[3³^-3⁴^]。然而，作者发现外胚层间充质干细胞在培养过程中，会发生自发分化现象，为保持外胚层间充质干细胞良好的干性，采用悬浮培养法将其诱导成为神经球样细胞，通过免疫荧光法检测该悬浮神经球高表达神经嵴源干细胞标志物nestin和干细胞特征性蛋白CD133，这说明通过悬浮培养法可获取高纯度样外胚层间充质干细胞。

将外胚层间充质干细胞来源神经球样细胞种植于支架表面，经全反式维A酸诱导14 d，发现黏附于支架的神经球逐渐伸出神经细胞突触样结构，且细胞间突触相互连接成网，呈现较典型的神经元样细胞形态。免疫荧光发现，共培养条件下细胞已高表达β3-Tubulin、MAP-2和MBP。β3-Tubulin微管蛋白几乎只存在于神经元细胞，是神经元细胞特征性蛋白；MAP-2则参与神经元细胞组装和轴突再生；MBP为髓鞘碱性蛋白参与轴突再生，这3种神经细胞相关蛋白的共表达，进一步表明外胚层间充质干细胞已向神经元样细胞分化。Western blot数据表明复合纤维蛋白支架组表达3种神经细胞相关蛋白水平高于其他3组，说明该复合支架更有利于外胚层间充质干细胞向神经元样细胞分化。

综上所述，包埋载音猬因子壳聚糖微球的纤维蛋白支架可作为一种有利于神经生长的生物组织工程支架，为进一步进行该支架移植的体内研究奠定一定的理论基础，课题组将继续进行深入的探讨。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

包埋载音猬因子壳聚糖微球纤维蛋白支架对鼻黏膜来源外胚层间充质干细胞分化的影响

Effect of fibrin glue scaffolds embedded with sonic hedgehog-loaded chitosan microspheres on the differentiation of nasal mucosa-derived ectomesenchymal stem cells

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