三种方法提取大鼠原代巨噬细胞的生物学特点比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0315

摘要/Abstract

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文题释义：
DAPI染色：DAPI是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测。因为DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色。DAPI能快速进入活细胞中与DNA结合，因此DAPI对生物体而言，也被视为一种毒性物质与致癌物，使用过程中应注意操作与抛弃的处理程序。
肺泡灌洗液：肺泡灌洗液能直接获取肺内炎症免疫效应细胞，是探讨肺局部免疫病理过程的一种比较安全和有用的检查方法，已成为辅助临床诊断和预后判断的重要手段。

摘要
背景：提取原代大鼠巨噬细胞的方法包括肺泡灌洗液提取、脾脏提取及外周血提取等多种方法，这些方法各有优缺点，巨噬细胞活性、状态及数量各有不同。
目的：分析3种不同组织来源的巨噬细胞原代提取及培养的较优选择。
方法：在同一实验条件下，采用肺泡灌洗液提取、脾脏提取及外周血提取3种不同的原代细胞培养方法培养大鼠巨噬细胞。
结果与结论：①肺泡灌洗液提取、脾脏提取及外周血提取法各组巨噬细胞培养提取细胞个数平均值分别为(1.14±0.14)×106个、(9.29±0.19)×106个及(3.17±0.13)×106个，3组间比较差异有显著性意义(P < 0.001)；②3种方法提取细胞存活的平均时间分别为(111.00±5.98)，(100.00±4.60)及(97.00±3.43) h，差异有显著性意义(P < 0.001)；③3种方法提取细胞的活性比较，肺泡灌洗液提取出的巨噬细胞显著高于另2组(P < 0.05)，而脾脏提取与外周血提取差异无显著性意义(P > 0.05)；④结果提示，3种方法中，肺泡灌洗液提取的巨噬细胞活性最强，脾脏提取的巨噬细胞数量最多。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-7155-4575(禹茜)

关键词: 巨噬细胞, 原代培养, 肺泡灌洗液, 脾脏, 外周血, 细胞培养, 形态学, 鉴定, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Methods for extracting primary macrophages from rats include bronchoalveolar lavage fluid (BALF) extraction, spleen extraction, and peripheral blood extraction. These methods have their own advantages and disadvantages, and the cells show different activities, status and quantities.
OBJECTIVE: To analyze the better selection of primary extraction and culture of macrophages from three different tissue sources.
METHODS: Under the same experimental conditions, primary rat macrophages were cultured using three different methods: BALF extraction, spleen extraction and peripheral blood extraction.
RESULTS AND CONCLUSION: The average numbers of primary macrophage extracted from BALF, spleen and peripheral blood were (1.14±0.14)×106, (9.29±0.19)×106 and (3.17±0.13)×106 respectively, there was a significant difference among groups (P < 0.001). The average survival time of the three methods for cell extraction was (111.00±5.98), (100.00±4.60) and (97.00±3.43) hours respectively, the difference was significant (P < 0.001). The activity of cells extracted from BALF was significantly higher than that of the other two tissues (P < 0.05), but there was no significant difference between spleen and peripheral blood (P > 0.05). These results indicate that BALF extracts the most activated macrophage can be extracted in BALF, and the largest number of macrophages can be extracted from the spleen.

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Key words: Macrophages, Cell Culture Techniques, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

禹茜，胡军涛，赖洁，王睿之，马兰兰，汤展宏. 三种方法提取大鼠原代巨噬细胞的生物学特点比较[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(24): 3863-3868.

Yu Xi, Hu Jun-tao, Lai Jie, Wang Rui-zhi, Ma Lan-lan, Tang Zhan-hong. Comparison of the biological characteristics of primary rat macrophages extracted by three methods[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(24): 3863-3868.

图/表（结果） 1

2.1 细胞数量估计对细胞进行计数、培养，每种细胞配置成2 mL悬液，如细胞悬液密度过大，补加培养液调整，用计数板计数，按细胞浓度1×10⁹ L^-1种入培养瓶中。1只 200 g成年大鼠可取血量约6 mL，因此可通过1 mL外周血可取的细胞个数预估外周血巨噬细胞个数。细胞计数后发现通过肺泡灌洗液、脾脏及外周血3种方法提取的巨噬细胞平均个数分别为(1.14±0.14)×10⁶、(9.29±0.19)×10⁶及 (3.17±0.13)×10⁶个。结果表明，脾脏培养组提取出的原代细胞数量显著高于其他2个培养组(P < 0.05)，3组所获取的原代细胞数比较，脾脏组织提取数目最多，外周血组其次，肺泡灌洗液组最少，3组间两两比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.2 细胞存活时间肺泡灌洗液、脾脏及外周血提取的细胞剩余50%时，存活的平均时间分别为(111.00±5.98)，(100.00±4.60)及(97.00±3.43) h。结果表明，肺泡灌洗液提取的原代细胞存活时间显著高于其他2个培养组，差异有显著性意义(P < 0.05)，脾脏及外周血2个培养组存活时间之间比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.3 细胞活性检测 CCK-8检测细胞活性结果表明，3组所获取的原代细胞活性比较，4个时间点的肺泡灌洗液提取

的原代细胞检测出的吸光度值均显著高于其他2个培养组，差异均有显著性意义(P < 0.05)，肺泡灌洗液提取的原代巨噬细胞活性最高，脾脏组织及外周血提取出的原代巨噬细胞活性差别在1 h与1.5 h无显著性意义(P > 0.05)，在 0.5 h与2 h组差异均有显著性意义(P < 0.05)；3个培养组与空白组之间两两比较，差异均有显著性意义(P < 0.05)，见表1，图1。

2.4 细胞形态观察肺泡(图2A)：与脾脏及外周血的巨噬细胞相比，肺泡提取出的巨噬细胞数量较少，但体积较大，形状圆润，核较明显，贴壁速度很快，且更容易聚集成团；相同细胞密度下，CCK-8检测其活性最强。脾脏(见图2B)：脾脏提取出的细胞体积较小，但数量巨大，是肺泡巨噬细胞的十倍之多，贴壁速度较肺泡巨噬细胞慢，贴壁牢固，不易消化。相同细胞密度下，CCK-8检测其活性较弱。外周血(图2C)：外周血巨噬细胞大小与脾脏巨噬细胞类似，数量中等，且形状不均匀；相同细胞密度下，CCK-8检测其活性较弱。体外培养2 d后，见贴壁生长，有个别伪足凸起，体外培养6 d后，明显见伪足样突起的形态不规则的单核巨噬细胞。

2.5 免疫细胞化学检测在相同培养条件、相同的抗体浓度下，同时进行免疫细胞化学检测，细胞免疫化学检测结果显示细胞呈特异性表面标志物C68阳性表达，肺泡灌洗液提取的原代巨噬细胞CD68化学染色，见图3A1，A2。脾脏提取的原代巨噬细胞CD68化学染色，见图3B1，B2。外周血提取的原代巨噬细胞CD68化学染色，见图3C1，C2。

参考文献

[1] Wynn TA, Chawla A, Pollard JW. Pollard, Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature.2013;496 (7446):445-455.

[2] Ginhoux F, Jung S. Monocytes and macrophages: developmental pathways and tissue homeostasis. Nat Rev Immunol. 2014;14(6): 392-404.

[3] Saidi H, Bérubé J, Laraba-Djebari F, et al. Involvement of alveolar macrophages and neutrophils in acute lung injury after scorpion envenomation:new pharmacological targets. Inflammation.2018.doi: 10.1007/s10753-018-0731-9.

[4] Morón-Calvente V, Romero-Pinedo S, Toribio-Castelló S, et al. Inhibitor of apoptosis proteins, NAIP, cIAP1 and cIAP2 expression during macrophage differentiation and M1/M2 polarization. PLoS One.2018;13(3):e0193643.

[5] 翟涛,宫鹏涛,张西臣,等.新孢子虫感染小鼠巨噬细胞IFN,TN和IL6分泌的变化[J].中国病原生物学杂志,2017,(4): 350-352,358.

[6] 刘华,田嘉铭,孙黎,等.正常小鼠巨噬细胞及外周血淋巴细胞亚群对防风多糖干预的反应[J].中国组织工程研究与临床康复, 2008, 12(18):3475-3478.

[7] Kobayashi H, Kobayashi M, Heming, et al. TA Cytokine production by rabbit alveolar macrophages: differences between activated and suppressor cell phenotypes. Immunol Lett. 1999;69(3):339-346.

[8] Savill J, Dransfield I, Gregory C, et al. A blast from the past: clearance of apoptotic cells regulates immune responses. Nat Rev Immunol. 2002;2(12):965-975.

[9] Gordon S, Taylor PR. Taylor, Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat Rev Immunol.2005;5(12): 953-964.

[10] Mosser DM, Edwards JP. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 2008; 8(12): 958-969.

[11] Sica A, Erreni M, Allavena P, et al. Macrophage polarization in pathology. Cell Mol Life Sci.2015;72(21):4111-4126.

[12] Davies LC, Jenkins SJ, Allen JE, et al. Tissue-resident macrophages. Nat Immunol. 2013;14(10):986-995.

[13] 章述军,雷青松,李麟,等.两种PMA诱导方案对THP-1巨噬细胞M1和M2亚型相关基因表达的影响[J].中国细胞生物学学报, 2017,39(6): 765-771.

[14] 翟纯刚,季晓平,王和峰,等.抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路对兔原代巨噬细胞自体吞噬的影响及机制[J].中国动脉硬化杂志, 2014,1(3):7-12.

[15] Epstein-Barash H, Gutman D, Markovsky E, et al. Physicochemical parameters affecting liposomal bisphosphonates bioactivity for restenosis therapy: Internalization, cell inhibition, activation of cytokines and complement, and mechanism of cell death. J Control Release. 2010;146(2):182-195.

[16] Badaoui B, Rutigliano T, Anselmo A, et al. RNA-sequence analysis of primary alveolar macrophages after in vitro infection with porcine reproductive and respiratory syndrome virus strains of differing virulence. PLoS One.2014; 9(3): e91918.

[17] Li J, Yao ZY, She C, et al. Effects of low-dose X-ray irradiation on activated macrophages and their possible signal pathways. PLoS One.2017;12(10):e0185854.

[18] Qiu W, Liu S, Chen J, et al. The primary culture of carp (Cyprinus carpio) macrophages and the verification of its phagocytosis activity. In Vitro Cell Dev Biol Anim.2015; 52(1): 10-19.

[19] 杨琳,田蕾,谢杰施,等.一种简单的分离、培养及鉴定小鼠外周血单核巨噬细胞方法的建立[J].首都医科大学学报,2015,36(4): 610-613.

[20] 关开泮,江仁, 徐雪,等.旋毛虫排泄分泌抗原53-ku重组蛋白上调M2型肺泡巨噬细胞减轻脓毒症小鼠急性肺损伤[J].中山大学学报(医学科学版),2017,38(5):670-675.

[21] 何俊,徐文莉,曾思,等.大鼠肺泡巨噬细胞原代培养技术的改良措施[J].徐州医学院学报, 2010,30(5):325-327.

[22] Qiu W, Liu S, Chen J, et al. The primary culture of carp (Cyprinus carpio) macrophages and the verification of its phagocytosis activity. In Vitro Cell Dev Biol Anim.2016; 52(1):10-19.

[23] Farooque A, Afrin F, Adhikari JS, et al. Polarization of macrophages towards M1 phenotype by a combination of 2-deoxy-d-glucose and radiation: Implications for tumor therapy. Immunobiology.2016;221(2):269-281.

[24] Takeshita S, Kaji K, Kudo A. Identification and Characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts. J Bone Miner Res.2000;15:1477-1488.

[25] 周龙,陈曦,罗宗平,等.C57BL/6小鼠骨髓单核细胞分离、培养、纯化及向破骨细胞的分化[J].中国组织工程研究, 2015,19(6): 940-944.

[26] 袁娜娜.Real-time PCR精确定量检测CD68阳性巨噬细胞在结直肠癌中的表达及意义[D]. 郑州大学.2012.

[27] 刘志,黄允宁.生理状态下大鼠大网膜I型与II型乳斑内CD68、CD163阳性巨噬细胞数量对比研究[J].宁夏医学杂志, 2014, 36(2):139-140.

[28] 尹国栋,倪斌,周风金,等.脊髓损伤局部表达NgR的巨噬细胞的体外分离培养[J].脊柱外科杂志,2009,7(4):198-200.

[29] 陈龙,熊先智.巨噬细胞的极化分型在慢性阻塞性肺疾病中的研究进展[J].国际呼吸杂志,2014,34(21):1671-1676.

[30] Jenkins SJ, Ruckerl D, Cook PC, et al. Local macrophage proliferation, rather than recruitment from the blood, is a signature of TH2 inflammation. Science. 2011;332(6035): 1284-1288.

引言

巨噬细胞作为重要的免疫细胞，广泛分布于机体的多种组织中，在维护机体内环境稳态方面具有十分重要的作用，为体内的稳态维持和组织防御提供保障，是机体免疫反应的第一道防线，对于先天免疫应答及后天免疫应答均有重要作用，其吞噬能力是衡量机体非特异性免疫功能的标志之一^[1-6]。除吞噬作用外，巨噬细胞还有趋化功能、分泌功能以及抗原呈递功能，并在生物体生物学的各个方面都有作用，具有多功能作用及高度可塑性，成为许多领域的研究对象^[7-8]。巨噬细胞是参与维持组织稳态的异质细胞群体，去除凋亡细胞及细胞碎片，帮助组织重塑和修复，每天清除大约2×10¹¹个红细胞；这相当于每年大约3 kg的铁和血红蛋白，供宿主“回收”再用^[9]。这种清除过程是一个重要的代谢贡献，没有它，宿主就无法生存；巨噬细胞还参与清除在组织重塑过程中产生的细胞碎片，并迅速而有效地清除已经发生凋亡的细胞^[10]。在某些情况下，巨噬细胞可进入促炎状态，主要作为防御外界病原体或参与受损组织修复的作用^[11]。因此巨噬细胞的原代提取与培养对于人体免疫学、免疫损伤及细胞分子生物学都有重要意义，但巨噬细胞存在于机体多数组织中，组织内巨噬细胞极其不均匀，属于不繁殖细胞群，难以长期生存，提取与富集困难，建立提取培养巨噬细胞的体系势在必行^[12-13]。

巨噬细胞分离、体外培养的方法及动物来源多种多样，实验目的及靶器官的不同，提取的方法有所不同，动物来源也多种多样，如兔、大鼠、猪、小鼠、鱼等^[14-18]。目前较少有比较不同方法提取巨噬细胞生物学特点的研究^[19-21]。Qiu等^[22]指出机械分离法及细胞贴壁培养方法可使提取步骤更简洁，提取出纯度更高的健康巨噬细胞。Farooque等^[23]指出采用脾脏组织作为巨噬细胞来源，用不含胎牛血清的培养基培养3 h，用换液的方法洗去未贴壁细胞，剩余细胞便可认为是巨噬细胞，获取的细胞贴壁2 h后进行CD80、CD86等进行免疫染色，并指出该方法获得细胞纯度接近75%。当前实验对这些方法的细节进行改良，将不同组织巨噬细胞的提取方法及生物学特点进行比对，从几种常用巨噬细胞提取方法中选出较优方法及较优细胞，这有助于进行提取细胞方法的选择，提高细胞提取成功率，节约时间，并得到数量及活性都较优的原代巨噬细胞。

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材料方法

1.1 设计体外细胞学对照实验。

1.2 时间及地点于2017年12月在广西医科大学临床试验中心完成实验。

1.3 材料

实验动物：SD大鼠，36只，雄性，200-220 g，购自广西医科大学动物实验中心，均为SPF级。动物及颗粒饲料均由广西医科大学实验动物中心提供, 实验动物生产许可证号：SCXK (桂) 2014-0002, 使用许可证号：SYXK (桂) 2014-0003。

实验用主要试剂及仪器：1640培养基、胎牛血清(Gibico公司)，红细胞裂解液、磷酸盐缓冲液(PBS)、青霉素-链霉素-两性霉素B混合溶液(PSG)、0.25%胰蛋白酶(含EDTA)、动物脏器组织单核细胞分离液、抗荧光衰减封片剂、山羊血清、聚山梨酯20(Tween-20)、曲拉通X-100 (Triton X-100)、4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(Solarbio公司)，100%丙酮(科龙)，兔来源的CD68一抗(Abcam公司)，羊来源的二抗(Bioss公司)，脂多糖(Sigma公司)，2.5- 1 000 μL移液器、24孔板、96孔板、25T细胞培养瓶(Eppendorf公司)，CCK-8试剂盒(Abbkine公司)，超净工作台(苏州净化)，恒温细胞培养箱(Thermo Forma)，倒置荧光显微镜(Ix7，Olympus公司)，酶联免疫检测仪(Bio-Tek公司)。

1.4 方法

1.4.1 主要步骤 SD大鼠麻醉，固定，颈部、胸前及腹部褪毛，碘伏消毒；收集同一只大鼠的肺泡灌洗液、脾脏及 1 mL颈静脉血，在相同条件下同时进行培养，主要采用密度梯度离心法分离巨噬细胞^[24-25]。观察细胞形态、数量及存活时间，CCK-8法检测细胞活性，CD68鉴定原代巨噬细胞。

1.4.2 肺泡提取原代巨噬细胞将气管暴露，用1 mL注射器吸取2 g/L的脂多糖0.1 mL，从气管给药，给药后缝合颈部肌肉皮肤，消毒包扎，放回鼠笼。3 h后，将大鼠麻醉固定，暴露气管，开胸暴露肺组织，气管切开，将一次性静脉输液针针头剪去，制成简易的肺泡灌洗液提取胶管，进行气管插管，用缝线固定。取2 mL注射器去针头，吸取含体积分数5%青霉素-链霉素-两性霉素B混合溶液的冷PBS 1 mL，从胶管注入肺脏，轻柔按摩两三分钟后回吸，重复15次，大概能回收肺泡灌洗液8 mL，离心，红细胞裂解液去除红细胞，培养基(含1640+体积分数10%胎牛血清+1%青霉素-链霉素-两性霉素B混合溶液)重悬计数，按1×10⁹ L^-1细胞浓度种入T25培养瓶中，3 h后换液，用传统贴壁法提纯细胞。

1.4.3 脾脏提取原代巨噬细胞取出脾脏组织，止血并缝合伤口，为3 h后取肺泡灌洗液做准备。将新鲜脾脏放入冷PBS剥离脂肪和外膜，清洗过后放置在滤网上，剪成组织小块，用研磨棒研磨组织，用冷PBS冲洗，保证组织和细胞处于液体环境，用滤网滤过组织团块，将所得细胞悬液缓慢加入单核细胞分离液上层(按1∶1体积比)，4 000 r/min，离心20 min，离心后分为3层，上层为血浆及分离液，下层为红细胞和粒细胞，中间层为淋巴细胞，上中层界面处有1个以单核细胞为主的白色雾层狭窄带，用移液枪小心吸取雾层，置于15 mL离心管中，加入5倍体积预冷PBS洗3次 (2 500 r/min，离心5 min)，培养基重悬，计数，按1×10⁹ L^-1接种入T25培养瓶中，3 h后换液，用传统贴壁法进一步提纯细胞。

1.4.4 外周血提取原代巨噬细胞颈静脉抽血1 mL，注入EDTA抗凝管，加入相同体积PBS，将所得细胞悬液缓慢加入单核细胞分离液上层(按1∶1体积比)，4 000 r/min，离心20 min，与上述方法相同，吸取白膜层，5倍体积预冷PBS洗3次(2 500 r/min，离心5 min)，培养基重悬，计数，按1×10⁹ L^-1细胞浓度接种入T25培养瓶中，3 h后换液，用传统贴壁法进一步提纯细胞。

1.4.5 对细胞进行计数、培养每种细胞配置成2 mL悬液，用计数板计数，如细胞悬液密度过大，补加培养液调整后再计数，记录数值，一般按1×10⁹ L^-1细胞浓度接种入培养瓶中。37 ℃，体积分数5%CO₂、95%湿度的培养箱培养，一般在2-4 h内贴壁。倒置相差显微镜观察细胞数量、形态等。

1.4.6 监控原代巨噬细胞存活时间通过细胞计数定量的方法计数细胞，原代巨噬细胞种瓶后，每天每组取一瓶细胞，PBS洗2遍后，加入1 mL体积分数0.25%胰酶，在37 ℃培养箱消化2.0-3.0 min，显微镜下观察细胞皱缩变圆，加入1640完全培养基终止消化，吹打后，离心，弃上清，加入1640完全培养基1 mL重悬、计数，与初始提取巨噬细胞数量进行比对，观察原代巨噬细胞剩余50%的时间。

1.4.7 原代巨噬细胞的鉴定 CD68一般被认为是人类单核细胞和巨噬细胞的选择性标记物，它的表达主要由巨噬细胞特异性启动因子进行调节，在诊断和研究中作为单核巨噬细胞的特定标记物而被广泛应用^[26]。有文献表明，CD68是巨噬细胞表面的分子标志物，使用CD68检测鉴定巨噬细胞，可以避免由于巨噬细胞分型造成误差^[27]。且在一些文献中，也是采用CD68鉴定巨噬细胞^[28]。将24孔板爬片置入24孔板中，现取的3种原代巨噬细胞制成细胞浓度为5×10⁸ L^-1的细胞悬液，各1 mL分别加入24孔板， 37 ℃、体积分数5%CO₂、95%湿度的培养箱培养4 h，PBS洗2次，每次10 min，体积分数100%丙酮固定10 min，再用PBS洗3次，每次3 min，加入0.3%Triton X-100，10 min后再用PBS洗2次，每次10 min；体积分数5%山羊血清封固，1 h后，弃掉山羊血清，每孔加入0.5%兔抗羊CD68一抗30 μL，放入湿盒，4 ℃过夜。第2天取出，PBS洗3次，每次10 min，加入体积分数0.5%荧光羊抗兔二抗，每孔 30 μL，孵育30 min，注意避光；30 min后，用DAPI染核 5 min，吸干液体，每孔爬片加适量抗免疫荧光淬灭剂，在倒置荧光显微镜下观察细胞数量，比例等。

1.4.8 CCK-8法检测细胞活性将3种方法提取的细胞以细胞浓度1×10⁷ L^-1分别制成细胞悬液，每种6孔，加入96孔板中，每孔加入90 μL细胞悬液，培养4 h后，换液，用无细胞的培养液做空白对照，培养6 h后，再次换液，室温下避光，每孔加入10 μL CCK-8，每0.5 h用酶标仪检测各组细胞吸光度值(波长450 nm)，舍去最大值及最小值，其余求平均数，进行计算比较。

1.5 主要观察指标 ①在细胞原代提取后观察细胞数量，培养、贴壁后观察细胞形态；②细胞存活剩余约50%时的存活时间；③CCK-8法检测细胞活性；④免疫细胞化学检测细胞分子CD68的表达情况。

1.6 统计学分析数据以x(_)±s表示，采用SPSS 22.0软件完成统计处理，以ANOVA进行双侧显著性检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

巨噬细胞的原代提取与培养存在诸多难题与困扰，主要有以下几个方面：首先，肺脏是个与外界相通的空腔器官，存在大量微生物、细菌等，由于自身先天免疫的存在及体内环境的稳定状态维持，并没有病理表现；然而，提取的肺泡灌洗液中或多或少存在细菌污染，会对脆弱的体外细胞培养环境及状态产生一定影响。其次，不管是与外界相通的肺泡灌洗液，还是体内环境的脾脏及外周血中，除了巨噬细胞的存在，还有大量其它细胞，包括肺泡中的肺上皮细胞、成纤维细胞等，脾脏中的成纤维细胞、淋巴细胞及红细胞等，外周血中的血细胞、各种其它免疫细胞、单个核细胞等，都会对巨噬细胞的提取纯度产生影响。再次，巨噬细胞属于不繁殖细胞群，且在体外培养存活时间不长，极易受到损伤，不能长期培养，这给巨噬细胞的研究及进展带来诸多麻烦。

因此，在巨噬细胞的提取及富集培养过程中，进行了诸多学习及改进。(1)在进行取材时，注意器材的高压紫外消毒，注意操作无菌，在冲洗肺泡、取出脾脏及外周血时所需的PBS中加入5%的三抗，分离细胞时用加了三抗的PBS冲洗，使细胞及组织随时处于无菌液体环境中，从而显著减少了细菌及真菌的污染；(2)尽可能的改善细胞的纯化问题，首先利用单核细胞分离液去除大多数淋巴细胞、成纤维细胞及红细胞等，吸取单核细胞时轻柔小心，尽量多的收集单核细胞的同时减少其它细胞的污染；其次细胞种板培养时，使用无血清培养基进行培养，在无血清培养基培养条件下，巨噬细胞在2-4 h内贴壁，单个核细胞如内皮细胞、内皮组细胞等在10-12 h内贴壁，淋巴细胞及红细胞属于不贴壁细胞，在4 h内换成完全培养基，可使尽可能多的巨噬细胞贴壁，尽量去除其它杂质细胞，在免疫细胞化学检测中，巨噬细胞纯度明显增高；(3)提取细胞及换液或加药时动作轻柔，配制完全培养基时，增大胎牛血清浓度，减少细胞在外界停留的时间，减少细胞损伤，避免人为因素造成细胞寿命减短。

此前较少有文献直接论述及比较不同组织提取的巨噬细胞特性，在当前实验中，对比了3种细胞提取方法及各自的生物学特点，包括肺泡灌洗液提取法、脾脏提取法及外周血提取法，首先发现肺泡灌洗液提取法提取出的细胞活性高于其他2种方法，且体积明显大于其它2种方法，脾脏提取法及外周血提取法提取出的细胞活性没有明显差异，细胞大小也无明显差异，可能原因分析为：同1只大鼠3种方法提取细胞时，气管内给脂多糖，脾脏及外周血提取较快，药物影响较小，而肺泡灌洗液在给药后3 h提取，可能已被激活；继而发现3种方法提取的巨噬细胞存活时间存在差异，肺泡灌洗液提取的细胞在细胞剩余50%时时间最长，脾脏提取法及外周血提取法的存活时间没有明显差异；其次发现脾脏提取的巨噬细胞数量最多，外周血提取次之，肺泡灌洗液数量最少，3者两两比较均存在显著性差异。

然而巨噬细胞的提取及培养还存在许多困扰及不足，首先，何俊等^[21]发现种瓶时使用含体积分数10%胎牛血清的培养基有助于细胞贴壁，而当前实验过程中，多次种瓶时使用含体积分数10%胎牛血清的培养基，细胞贴壁率反而下降，甚至贴壁极少，只有在种瓶时使用不含胎牛血清的培养基，培养3 h后换液时再使用含体积分数10%胎牛血清的培养基培养，贴壁细胞明显增多，在Farooque等^[23]的实验中也是使用不含胎牛血清的培养基进行细胞贴壁处理，这种现像并没有具体合理的解释。其次，巨噬细胞是否会增殖一直是令人困扰的问题，有文献指出巨噬细胞属于终末分化细胞，不会增殖^[29]；也有文献表示在局部Th2环境下，巨噬细胞会增多^[30]。与周龙等^[25]的实验结果比较，巨噬细胞形态类似，没有加入巨噬细胞集落刺激因子的巨噬细胞生长基本停滞，这与实验前期结果相同；但在细胞贴壁3 d后，实验通过胰酶消化法对巨噬细胞计数，细胞数每天逐渐下降，在第5，6天即降至原有细胞数的1/2，分析其中原因可能是：①未使用巨噬细胞集落刺激因子刺激巨噬细胞生长；②巨噬细胞不适应体外环境；③前期研磨及使用胰酶消化细胞可能会对细胞有所损伤；④1640培养基易氧化，pH值可能有所改变，影响细胞生长。如何增加细胞生命周期，延长培养时间，解决巨噬细胞生命周期不长，老化、死亡较快及细胞贴壁等诸多困扰，还需从提取方法至培养条件进行全面改进，这也是以后需要进行研究的方向之一。

综上所述，实验通过3种不同提取方法，比较各自提取细胞数量、形态及活性，有助于提高细胞提取成功率，节约时间，并得到数量及活性都较优的原代巨噬细胞。结果显示，脾脏提取出的巨噬细胞数量多，体积大，活性、纯度及存活时间均较高，在需要大量巨噬细胞的实验中具有明显优势；肺泡灌洗液提取的巨噬细胞明显激活，活性较高，存活时间较长，在需要高活性高生命力的巨噬细胞相关实验中可以采用；而外周血提取的巨噬细胞活性及数量均处于中等，优势是提取方便，操作简单。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程