可自主结合转化生长因子β1聚乙二醇水凝胶的制备及其生物相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0737

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

水凝胶：是最常用的生物支架材料之一，包括天然水凝胶和人工合成水凝胶。天然水凝胶虽然具有良好的生物相容性，但机械性能及其改性较差；人工合成水凝胶主要包括聚乙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯酸及其衍生物等。相对于天然水凝胶，人工合成水凝胶可进行结构及性质调整，并且具有良好的机械性能。

高分子水凝胶聚乙二醇二甲基丙烯酸酯：具有高亲水性、弹塑性、表面化学反应惰性、低免疫原性及安全性等优点，在医学领域及组织工程中得到广泛应用，同时聚乙二醇水凝胶可通过材料表面改性改善医用高分子材料的生物活性；另一方面，以聚乙二醇二甲基丙烯酸酯为基底制备的水凝胶，其剪切模量变化范围可以为10 kPa-1 MPa，推测可通过调节聚乙二醇二甲基丙烯酸酯的浓度来模拟软骨的机械性能，可能在软骨修复中发挥重要作用。

背景：有研究将生物活性分子或者多肽接枝到聚乙二醇水凝胶表面，改善聚乙二醇的生物活性。

目的：制备可自主结合转化生长因子β1的聚乙二醇水凝胶，观察其生物相容性。

方法：分别制备聚乙二醇水凝胶(A组)、接枝细胞黏附多肽RGD的聚乙二醇水凝胶(B组)、接枝HSNGLPL多肽的聚乙二醇水凝胶(C组)、接枝细胞黏附多肽RGD与HSNGLPL多肽的聚乙二醇水凝胶(D组)，检测4组水凝胶的接触角。将人骨髓间充质干细胞接种于4组水凝胶中，待细胞贴附后，扫描电镜观察细胞-水凝胶复合物，并进行死活细胞染色。分别采用普通培养基(对照组)、4组水凝胶浸提液培养人骨髓间充质干细胞，培养1，3，5，7 d，采用CCK-8法检测细胞增殖。将4组水凝胶材料放入24孔板中，分别加入含转化生长因子β1的PBS溶液，1 h后进行荧光免疫组织化学染色。

结果与结论：①A、C组水凝胶接触角较大，B、D组水凝胶接触角较小；②扫描电镜显示，A、C组水凝胶表面几乎无细胞，B、D组水凝胶表面贴附较多细胞；③死活细胞染色显示，A、C组水凝胶表面几乎无活细胞，B、D组水凝胶表面贴附较多活细胞；④CCK-8法检测结果显示，随着培养时间的延长，5组细胞增殖活性逐渐增强，且5组间细胞增殖无差异；⑤荧光免疫组织化学染色显示，A、B组荧光强度很弱，几乎无荧光；C、D组有较强的绿色荧光；⑥结果表明，接枝细胞黏附多肽RGD与HSNGLPL多肽的聚乙二醇水凝胶，可自主结合转化生长因子β1，具有良好的生物相容性。

ORCID: 0000-0003-1350-7241(鞠晓晶)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 水凝胶, 生物相容性, 聚乙二醇, 转化生长因子β1, 转化生长因子β1吸附多肽, 生物材料, 细胞黏附多肽RGD

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that bioactive molecules or polypeptides grafted onto the surface of polyethylene glycol (PEG) hydrogels can improve PEG bioactivities.

OBJECTIVE: To manufacture PEG hydrogels capable of auto-recruiting growth factor beta1 (TGF-β1) and to study its biocompatibility.

METHODS: Pure PEG hydrogels (group A), PEG hydrogels grafted on a cell adhesion peptide RGD peptides (group B), PEG hydrogels grafted with auto-recruited TGF-β1 peptide sensitive polypeptide HSNGLPL (group C), PEG hydrogels grafted with both RGD and HSNGLPL polypeptides (group D) were prepared. Contract angle of the hydrogel was detected in each group. Human bone mesenchymal stem cells were seeded onto four kinds of hydrogels. After cells attached, scanning electron microscope and LIVE/DEAD staining were done to observe cell-hydrogel compounds. Human bone marrow mesenchymal stem cells were co-cultured with ordinary culture medium (control) or four kinds of hydrogels for 1, 3, 5, 7 days, and the cell proliferation was detected by cell counting kit-8 assay. The four kinds of hydrogels were put into 24-well culture plates with addition of PBS containing TGF-β1, and 1 hour later, immunofluorescence staining was done.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) The contact angles of groups A and C were larger than those of groups B and D. (2) Under the scanning electron microscope, groups A and C had little cells attached on the hydrogel surface, but there were many cells on the hydrogel surface in groups B and D. (3) LIVE/DEAD staining showed groups A and C had little living cells, and conversely groups B and D had many living cells. (4) The results of cell counting kit-8 demonstrated that as the incubation time went on, cell proliferation activity of five different groups increased with no difference at the same time point. (5) Findings from the immunofluorescence staining showed that groups A and B had very weak fluorescence, while groups C and D had stronger green fluorescence. In conclusion, PEG hydrogels grafted with RGD and HSNGLPL polypeptides can auto-recruit TGF-β1, and have good biocompatibility.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Polyethylene Glycols, Hydrogel, Materials Testing, Transforming Growth Factor beta1, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

鞠晓晶，潘国庆，刘星志，孙树金，黄立新，施勤. 可自主结合转化生长因子β1聚乙二醇水凝胶的制备及其生物相容性[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(14): 2209-2214.

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图/表（结果） 6

2.1 水凝胶材料表观如图1所示，大体观察水凝胶合成后形成透明固态片状，形状可根据需要进行切割，实验均在孔板中进行，切割成圆形。

2.2 水凝胶材料接触角测定结果显示，A和C组接触角相对较大，而B和D组相对较小，说明亲水性更好，因此加入RGD多肽后使得材料与组织或细胞有更好的贴附性(图2)。

2.3 电镜扫描观察细胞黏附图3电镜扫描结果中，A、C组材料表面几乎没有细胞，B、D组材料表面有较多的细胞贴附，说明聚乙二醇水凝胶加入了RGD多肽后有利于细胞的贴附，加入RGD多肽的复合型材料能够为细胞的贴附、生长提供良好的载体。

2.4 活死染色结果图4活死染色结果中，活细胞染成绿色荧光，死细胞染成红色荧光，A、C组几乎没有细胞的存在或大多数细胞死亡，B、D组中大多是活细胞，只有少量的死细胞(箭头处)，结果表明接枝细胞黏附多肽RGD的聚乙二醇水凝胶和接枝细胞黏附多肽RGD与HSNGLPL多肽的聚乙二醇水凝胶，不仅可保持较多的细胞贴附，还可保持细胞的活性，为细胞的贴附及增殖提供了良好的载体。

2.5 细胞毒性实验结果随着时间的延长，各组细胞吸光度A值(450 nm)逐渐增加，且同一时间点、4水凝胶材料浸提液组与对照组培养的细胞增殖无差异(图5)，说明4组材料都无细胞毒性。

2.6 荧光免疫组织化学染色结果对4组材料经过相同吸附时间后，鉴定转化生长因子β1吸附性，由图6可见，A、B组荧光强度很弱，几乎无荧光，说明聚乙二醇材料本身没有转化生长因子β1的吸附功能，且加入RGD也不会有吸附作用的存在；C、D组有较强的绿色荧光，证明了该敏感型结合多肽具有自主吸附转化生长因子β1的功能，加入RGD不会影响转化生长因子β1吸附多肽的性能。

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引言

近年来，由生物材料、种子细胞和生物因子3大要素组成的组织工程技术的发展，为各类组织损伤的修复开辟了新的途径，而生物材料的研发和应用是组织工程研究的重点领域之一，其中水凝胶由于自身良好的细胞相容性、可塑性高及生物降解性而在再生医学中得到广泛应用^[1-4]。

水凝胶是最常用的生物支架材料之一，包括天然水凝胶和人工合成水凝胶。天然水凝胶虽然具有良好的生物相容性，但机械性能及其改性较差；人工合成水凝胶主要包括聚乙二醇^[5-6]、聚乙烯醇^[7-9]、聚丙烯酸及其衍生物等^[10]。相对于天然水凝胶，人工合成水凝胶可进行结构及性质调整，并且具有良好的机械性能。此次实验选用聚乙二醇水凝胶^[11-12]，因其具有高亲水性、弹塑、表面化学反应惰性、低免疫原性及安全性等优点，但其与组织、细胞贴附性相对较差^[13-14]。有文献报道生物活性分子或者多肽可通过与聚乙二醇自由端基反应接枝到聚乙二醇水凝胶表面，改性聚乙二醇的生物活性^[15-16]。Methacrylate-GGGG-RGDS (Arg-Gly-Asp-Ser)是一种黏附多肽^[17-18]，对于维持细胞、组织在聚乙二醇水凝胶上的稳定性及增殖、修复能力等具有重要作用^[19]，因此在合成水凝胶本体上接枝精氨酸-甘氨酸-丝氨酸(arginine-glycine-aspatic acid，RGD)黏附多肽对提高材料与组织、细胞的贴附性是很有必要的。

转化生长因子β1是转化生长因子β家族的重要成员，对细胞的生长、分化和免疫功能及组织修复等方面起重要调节功能^[20-22]，尤其是对间充质来源的细胞起刺激作用，对于软骨损伤修复具有重要作用。但是外源性注射转化生长因子β1存在很多缺点，如成本高、半衰期短等，因此有效利用内源性转化生长因子β1会显著提高安全性，有很高的利用价值。

组氨酸-丝氨酸-天冬酰胺-甘氨酸-亮氨酸-脯氨酸-亮氨酸(HSNGLPL)多肽是Shah等^[23]在海洋生物中发现的，其能够吸附转化生长因子β1，原因是其表面有很多转化生长因子β1结合表位，可与转化生长因子β1紧密结合，并保持转化生长因子β的生物活性。因此，此次实验中通过该方法以转化生长因子β1吸附多肽HSNGLPL和黏附多肽RGD，接枝到聚乙二醇表面，改性水凝胶，从而发挥生物学作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计对比观察实验。

1.2 时间及地点实验于2016年5月至2017年5月在苏州大学医学部骨科研究所实验室完成。

1.3 材料平均相对分子质量3 400的聚乙二醇二甲基丙烯酸酯、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素(sigma)；RGD黏附多肽(上海强耀生物科技)；HSNGLPL多肽(上海强耀生物科技)；转化生长因子β1(Peprotech)；胎牛血清(Gibco)；DMEM低糖培养基(Hycolne)；转化生长因子β1单克隆抗体、荧光二抗(Abcam)；PBS粉末(博士德生物科技)。

1.4 实验方法

1.4.1 改性聚乙二醇水凝胶的制备将18.24 mg (0.025 mmol)Methacrylate-GGGG-RGD、29 mg(0.025 mmol) HSNGLPLGGGGK-methacrylate及250 mg聚乙二醇二甲基丙烯酸酯的复合物水溶液混合均匀之后，通氩气5 min排除氧气，然后依次加入50 g/L的多硫酸铵水溶液100 μL和体积分数5%四甲基乙二胺水溶液100 μL，快速混合均匀之后，将反应液移入间距为0.75 mm的制胶玻璃板中，并于室温下静置反应3 h，体系中反应物完全交联形成透明的接枝细胞黏附多肽RGD与HSNGLPL多肽的聚乙二醇水凝胶片层(D组)。将水凝胶取出后放入透析袋中透析1周，以除去其中残留的单体、引发剂等。同理制备单纯聚乙二醇水凝胶(A组)、只含有RGD多肽的水凝胶(B组)、只含有HSNGLPL多肽的水凝胶(C组)。待透析结束后根据实验需要进行切割使用。

1.4.2 水凝胶的表征

接触角：取4组水凝胶，每组至少3个样本，通过接触角测试仪测定接触角大小，从而确定其亲水性。

扫描电镜：切割4组水凝胶，放入24孔板中(每组至少3个孔)，辐照灭菌后，分别接种人骨髓间充质干细胞(苏州大学医学部骨科研究所实验室保留)，细胞接种浓度为 10⁸ L^-1，待其完全贴附后，弃上清，加入40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3次，每次2 min；加入浓度梯度(体积分数10%、30%、50%、70%、90%)乙醇脱水后，放入体积分数100%乙醇中保存，电镜扫描前进行临界点干燥、喷金，再在电镜下扫描观察。

活死染色：将骨髓间充质干细胞以10⁸ L^-1分别接种于4组水凝胶上，培养24 h后，弃上清；PBS清洗2次，加入现配置的活死染色剂混合液，即A液、B液、PBS体积比为 1∶2∶2 000，每孔加入0.1 mL，常温下反应30 min，弃上清，立即镜检。

细胞毒性实验：分别取4组材料液态混合液1 mL，3 h成胶后，分别放于10 mL DMEM低糖不完全培养基中，置于细胞培养箱中浸泡1周，收集材料浸提液，用0.22 μm过滤器过滤后，加入体积分数10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素，4 ℃保存备用。将人骨髓间充质干细胞以10⁷ L^-1的细胞浓度接种于96孔板中，待贴壁后，去掉培养上清，PBS清洗2次，分5组培养，4组分别更换成4种材料浸提液，普通培养基作为对照组，培养1，3，5，7 d，弃掉细胞上清，加入CCK-8试剂与培养基(1∶10)的混合液，置于37 ℃培养箱中反应2 h，在450 nm处的吸光度A值，通过细胞产酶的多少间接反应细胞的增殖情况。

免疫荧光染色：切割4组水凝胶，放入24孔板中(每组至少3个孔)，再分别加入含4 mmol/L HCl、1%BSA、1 mg/L转化生长因子β1的PBS 1 mL^[24]，放置37 ℃ 培养箱中吸附1 h后，进行荧光免疫组织化学染色，具体步骤如下：将吸附后的4组材料分别用PBS轻微冲洗，加入转化生长因子β1一抗(1∶1 000稀释)，室温孵育2 h并轻微震荡，再用PBS轻微冲洗3次，再避光孵育二抗(1∶500稀释)90 min，PBS轻微冲洗3次，将材料放置在载玻片上，锡箔纸包好，荧光显微镜下镜检观察。

1.5 主要观察指标接种于4组水凝胶材料后，骨髓间充质干细胞的增殖及存活；4组水凝胶材料吸附转化生长因子β1的能力。

1.6 统计学分析数据以x(_)±s表示，采用统计学分析软件SPSS 12.0，组间分析采用ANOVA的统计学分析方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

近年来随着生活水平的提高，人口老龄化愈来愈严重，软骨损伤在中老年中的发生率越来越高，又由于关节软骨自身的独特生理结构，自然退变或创伤引起的软骨缺损会导致不可逆的损害，很多药物保守治疗的方法仅能暂时缓解症状，根本无法从根本上实现软骨的功能性修复。目前临床上常用软骨组织修复手段主要包括微裂缝、骨软骨移植及软骨细胞移植等，但治疗结果不理想。随着生物工程与医学的快速发展，组织工程为治疗软骨疾病开辟了新途径。组织工程主要包括3个方面：种子细胞、支架材料及微环境。组织工程中的支架材料是为细胞生长提供附着点及物理环境，同时是细胞间接触、信号传递的重要媒介，因此需要满足如下条件：有良好的细胞相容性、良好的细胞界面、可塑性高、机械强度好及生物可降解性。由于关节软骨不仅需要承受压力，还需要承受复杂的剪切力，如摩擦力、应力等，因此软骨修复材料需要仿软骨细胞外基质，且具有足够强的力学性能。高分子水凝胶聚乙二醇二甲基丙烯酸酯，因其具有高亲水性及弹塑性、表面化学反应惰性、低免疫原性及安全性等优点，在医学领域及组织工程中得到广泛应用，同时聚乙二醇水凝胶可通过材料表面改性改善医用高分子材料的生物活性^[15，25-27]；另一方面，以聚乙二醇二甲基丙烯酸酯为基底制备的水凝胶，其剪切模量变化范围可以为10 kPa-1 MPa^[28-30]，推测可通过调节聚乙二醇二甲基丙烯酸酯的浓度来模拟软骨的机械性能，可能在软骨修复中发挥重要作用。

此次实验中采用的细胞为间充质干细胞，具有多向分化潜能，且能不断地自我更新和自我复制，在特定条件下可分化为骨、软骨、脂肪等多种组织细胞。

转化生长因子β1是一种具有多功能生物学活性的细胞因子，广泛存在于各种组织中，参与多种疾病的调控，包括血液病^[31]、糖尿病及骨与软骨疾病等^[32-35]，因此寻找一种可局部改变转化生长因子β1含量的方法，对于这些疾病的治疗具有重要作用。此次实验制备的水凝胶具有可自主吸附转化生长因子β1的功能，有效吸附内源性转化生长因子β1，节省了治疗成本，有效解决了外源性转化生长因子β1注入体内活性差、半衰期短的缺点^[36]，同时使用内源性转化生长因子β1也提高了安全性，因此在组织工程中具有潜在的应用前景。实验材料主要出发点用于吸附内源性转化生长因子β1，即将材料注入体内，通过局部提高内源性转化生长因子β1，达到组织修复与医学再生作用，因此体外暂时不考虑吸附转化生长因子β1的活性，以后会进一步改善做体内相关实验进行研究。

材料的生物相容性，简单的说就是指材料在体内及体外与细胞或者机体自身的兼容性，体外鉴定材料生物相容性主要是通过细胞在材料上的贴附情况及增殖情况来判断。在此次实验细胞扫描电镜及活死染色结果可以看出，加入RGD多肽后，聚乙二醇水凝胶可为细胞提供有效贴附点，并且能够使贴附的细胞保持存活，大多数细胞被染成绿色荧光，只有少部分细胞发生凋亡或者死亡，这与细胞自身状态及细胞争夺营养的能力等都有一定的关系，即使是普通平板培养细胞，也会出现少量的细胞凋亡或死亡，所以属于正常现象；细胞增殖实验(CCK-8)中，实验采用材料上清液与间充质干细胞共培养，由于A组和C组材料的生物相容性极差，导致间充质干细胞无法正常贴附，因而无法测定通过直接接种于材料上的方法来测定材料的毒性对细胞的影响还是由于细胞黏附问题导致的细胞无法增殖。将普通培养基作为对照组，相较材料浸提液，细胞增殖没有显著性差异，但数值相对高一点，可能原因为材料采用多硫酸铵和四甲基乙二胺化学交联法成胶，其单体毒性较大，虽经过透析处理后，可能仍然有少量残留的单体分子对细胞有一定毒性^[37]，进而导致对细胞增殖产生轻微抑制作用，但不影响细胞的增殖。今后，会研究其他凝胶交联方式及接枝多肽的方法，从而减轻非凝胶自身原因导致的不利于细胞因素。此外，转化生长因子β1是一种复性调控因子，对软骨修复具有剂量依附性，因而控制加入HSNGLPL敏感型多肽进而控制转化生长因子β1吸附量是有必要研究的，但需要大量的体内调查数据支撑，会通过后续相关体内外研究进一步研究材料的生物学性能。

总之，此次实验成功制备了接枝HSNGLPL和RGD多肽的新型复合水凝胶，其可吸附转化生长因子β1，提高了传统的聚乙二醇水凝胶的生物组织相容性，为该材料在组织工程和再生医学中的应用提供了物质基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程