基于内质网应激研究蛇床子素对成骨细胞增殖与分化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0802

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (12): 1817-1822.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0802

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基于内质网应激研究蛇床子素对成骨细胞增殖与分化的影响

郑苏阳1，马勇1，2，郭杨1，王礼宁1，潘娅岚1

1南京中医药大学骨伤研究所、骨伤修复与重建新技术实验室，江苏省南京市 210023；2南京中医药大学附属医院(江苏省中医院)骨伤科，江苏省南京市 210029

收稿日期:2017-11-05 出版日期:2018-04-28 发布日期:2018-04-28
通讯作者: 郭杨，博士，助理研究员，南京中医药大学骨伤研究所、骨伤修复与重建新技术实验室，江苏省南京市 210023。
作者简介:郑苏阳，男，1991年生，江苏省张家港市人，汉族，2017年南京中医药大学毕业，硕士，主要从事中医药治疗骨关节病研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81473692)；江苏省高校优势学科南京中医药大学护理学(苏政办发2014(37)号)资助项目；江苏省中医药局科技项目(YB2015135)

Osthol effects on the proliferation and differentiation of osteoblasts based on endoplasmic reticulum stress

Zheng Su-yang1, Ma Yong1, 2, Guo Yang1, Wang Li-ning1, Pan Ya-lan1

1Institute for Orthopedics of Nanjing University of Chinese Medicine, Laboratory of New-Tech Orthopedic Repair and Reconstruction, Nanjing 210023, Jiangsu Province, China; 2Department of Orthopedics, Jiangsu Provincial Hospital of TCM, Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China

Received:2017-11-05 Online:2018-04-28 Published:2018-04-28
Contact: Guo Yang, M.D., Researcher assistant, Institute for Orthopedics of Nanjing University of Chinese Medicine, Laboratory of New-Tech Orthopedic Repair and Reconstruction, Nanjing 210023, Jiangsu Province, China
About author:Zheng Su-yang, Master, Institute for Orthopedics of Nanjing University of Chinese Medicine, Laboratory of New-Tech Orthopedic Repair and Reconstruction, Nanjing 210023, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81473692; Superior Discipline Construction Project for the Nursing of Nanjing University of Chinese Medicine, No. 2014(37); the Scientific and Technological Project of Jiangsu Provincial Administration of TCM, No. YB2015135

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
内质网应激：是细胞在应激条件下做出的一系列适应性调节反应。内质网的能量供应不足或负荷过高会扰乱内质网的正常功能从而诱发内质网应激。适度的内质网应激有助于减轻细胞的损伤，但是持久或强烈的内质网应激会导致细胞凋亡。CHOP是内质网应激的标志性蛋白。
分子伴侣：是细胞质中一类蛋白，能够识别并结合不完全折叠或装配的蛋白质，帮助这些多肽正确折叠、转运或防止他们聚集，其本身不参与最终产物的形成。

摘要
背景：研究表明，蛇床子素可以通过促进成骨细胞分化而促进骨形成，但是蛇床子素抗骨质疏松效应的机制尚不明确。
目的：观察蛇床子素对体外培养大鼠成骨细胞增殖与分化的影响，探究其抗骨质疏松效应的机制。
方法：采用二次酶消化法分离大鼠成骨细胞，并使用碱性磷酸酶染色以及矿化结节染色进行鉴定。实验分5组，分别为溶剂对照组、β-雌二醇组以及蛇床子素低、中、高剂量组(1×10-6，1×10-5，1×10-4 mol/L)。用CCK-8法检测各组细胞增殖情况，通过检测各组细胞内碱性磷酸酶活力以及矿化结节染色评价细胞分化情况，蛋白免疫印迹法检测GRP78、PDI、CHOP蛋白表达。
结果与结论：①1×10-4，1×10-5 mol/L蛇床子素可抑制成骨细胞增殖；②10-4 mol/L蛇床子素可增加成骨细胞碱性磷酸酶活力、增强成骨细胞矿化能力；③10-4mol/L蛇床子素可降低GRP78蛋白水平，增加PDI及CHOP蛋白表达；④结果表明，蛇床子素可促进成骨细胞分化，可能通过内质网应激抑制成骨细胞增殖。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-7639-6975(郑苏阳)

关键词: 蛇床子素, 成骨细胞, 内质网应激, GRP78, PDI, CHOP, 组织构建

Abstract:

BACKGROUND: Osthol has been reported to promote osteogenesis by increasing osteoblast proliferation, but the anti-osteoporosis mechanism underlying osthol is poorly understood.
OBJECTIVE: To observe the effect of osthol on the proliferation and differentiation of rat osteoblasts in vitro and to explore its mechanism of anti-osteoporosis effect.
METHODS: Rat osteoblasts were isolated by secondary enzyme digestion and identified by alkaline phosphatase staining and mineralized nodule staining. There were five groups: blank control, solvent control, β-estradiol as well as low-, medium- and high-dose osthol groups. Cell proliferation was detected by cell counting kit-8 assay, and cell differentiation was evaluated by detection of alkaline phosphatase and mineralized nodule staining. The expression levels of GRP78, PDI and CHOP were detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Osthol at the concentrations of 1x10-4 and 1x10-5 mol/L could inhibit osteoblast proliferation. 1x10-4 mol/L osthol could increase the activity of alkaline phosphatase in osteoblasts and enhance osteoblastic mineralization. Meanwhile, 1x10-4 mol/L osthol was able to down-regulate the expression level of GRP78 and up-regulate the expression levels of PDI and CHOP. To conclude, osthol can promote osteoblast differentiation and inhibit osteoblast proliferation probably by endoplasmic reticulum stress.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Cnidium, Osteoblasts, Endoplasmic Reticulum, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

郑苏阳，马勇，郭杨，王礼宁，潘娅岚. 基于内质网应激研究蛇床子素对成骨细胞增殖与分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(12): 1817-1822.

Zheng Su-yang1, Ma Yong1, 2, Guo Yang1, Wang Li-ning1, Pan Ya-lan1. Osthol effects on the proliferation and differentiation of osteoblasts based on endoplasmic reticulum stress[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(12): 1817-1822.

图/表（结果） 2

2.1 成骨细胞的鉴定

2.1.1 形态学观察在倒置显微镜下观察，刚接种的成骨细胞呈球形，悬浮于培养基中(图1A)；24 h后经过换液，存活细胞已完全贴壁展开，此时细胞形态不规则，呈三角形或多角形，有较多突起(图1B)。生长期细胞分离相多见，细胞突起互相连接(图1C)。汇合时，细胞呈铺路石状(图1D)。

2.1.2 碱性磷酸酶染色经偶氮偶联法染色后，胞浆中有许多紫红色颗粒，使成骨细胞胞体呈现紫红色，胞质丰富而清晰。使用甲基绿复染细胞核，可以清晰地看到单个细胞核，呈卵圆形，含有1-3个核仁(图2A，B)。

2.1.3 矿化结节染色采用茜素红法行矿化结节染色，染色前矿化结节表现为暗黄色颗粒状不透光结晶，茜素红染色后矿化结节呈红色(图2C)。

2.2 蛇床子素对成骨细胞增殖的影响含药完全培养基干预后24，48 h，各浓度蛇床子素均能抑制成骨细胞增殖；药物干预后72 h，10^-4mol/L与10^-5mol/L的蛇床子素可以抑制成骨细胞增殖；药物干预后24，48，72 h，10^-8mol/L的β-雌二醇均能抑制成骨细胞增殖，但差异无显著性意义，而10^-4mol/L与10^-5mol/L的蛇床子素抑制成骨细胞增殖效应强于10^-8mol/L的β-雌二醇(表1)。

2.3 蛇床子素对成骨细胞分化的影响

2.3.1 蛇床子素对成骨细胞碱性磷酸酶活力的影响含药完全培养基干预24，48，72 h后，10^-4mol/L的蛇床子素均能提高成骨细胞内碱性磷酸酶活力，而10^-8mol/L的β-雌二醇虽然可以提高成骨细胞内碱性磷酸酶活力，但差异无显著性意义。10^-4mol/L的蛇床子素促进成骨细胞碱性磷酸酶活力的效应强于10^-8mol/L的β-雌二醇(表2)。

2.3.2 蛇床子素对成骨细胞矿化能力的影响 10^-4mol/L的蛇床子素可以增强成骨细胞的矿化能力，而10^-8mol/L的β-雌二醇及10^-5mol/L、10^-6mol/L的蛇床子素虽然也能增强成骨细胞的矿化能力，但与溶剂对照组相比差异无显著性意义(表3)。

2.4 内质网应激相关蛋白检测 10^-4mol/L的蛇床子素可以减少GRP78蛋白表达，增加PDI蛋白表达；10^-6mol/L的蛇床子素可以降低PDI蛋白的表达。CHOP只有在高浓度(10^-4mol/L)蛇床子素组有明显表达，其余各组表达量极小(图3)。

参考文献

[1] 傅崇辉,张玲华,李玉柱. 从第六次人口普查看中国人口生育变化的新特点[J]. 统计研究,2013,30(1):68-75.

[2] Hagino H, Kishimoto H, Ohishi H, et al. Efficacy, tolerability and safety of once-monthly administration of 75mg risedronate in Japanese patients with involutional osteoporosis: a comparison with a 2.5mg once-daily dosage regimen. Bone.2014;59:44-52.

[3] Khosla S, Hofbauer LC. Osteoporosis treatment: recent developments and ongoing challenges. Lancet Diabetes Endocrinol.2017;7: S2213-8587(17)30188-30182.

[4] 李洁.阿仑膦酸钠治疗绝经后骨质疏松症的临床疗效及不良反应[J].临床合理用药杂志,2016,9(19):54-55.

[5] 杨艳,李蓬秋,朱显军,等.重组人甲状旁腺激素(1-34)和依降钙素治疗原发性骨质疏松症的随机对照研究[J].中国骨质疏松杂志, 2014, 20(2):137-141+155.

[6] 王非,荆莉,石卫峰,等.抗骨质疏松药物的不良反应[J].药品评价, 2013,10(23):23-28.

[7] 林雪源,欧阳国豪.鲑降钙素的临床应用及不良反应研究进展[J].中国实用医药,2011,6(33):244-245.

[8] 苑文杰.雌激素替代疗法治疗妇女绝经后骨质疏松症疗效观察[J].现代中西医结合杂志,2011,20(32):4082-4083.

[9] 刘月芬,尤琳,李恩泽,等.阿仑膦酸钠不良反应[J].中国误诊学杂志,2011,11(16):3804.

[10] 余伯龙,李义凯.使用双膦酸盐类药物的不良反应[J].中国骨质疏松杂志,2011,17(1):80-85.

[11] Costa CR,Amorim BR,de Magalhaes P,et al.Effects of Plants on Osteogenic Differentiation and Mineralization of Periodontal Ligament Cells: A Systematic Review. Phytother Res.2016;30(4):519-531.

[12] 赵晓玲,彭勇.中药防治骨质疏松症的研究进展[J].中国现代中药, 2012,14(8):16-20.

[13] 杜贵友,曹春雨.中药治疗骨质疏松症实验研究进展[J].中国中药杂志,2011,36(4):401-404.

[14] 郭冰凌,李法琦.老年人骨质疏松症的药物治疗进展[J].重庆医学, 2014,43(33):4542-4544.

[15] 严红梅,张振海,孙娥,等.中药治疗骨质疏松症的研究进展[J].中草药,2014,45(8):1174-1178.

[16] 郭杨,马勇.中医药治疗骨质疏松症的常用处方分析[J]. 中国实验方剂学杂志,2010,16(7):188-191.

[17] Gao F, Hu Y,Ye X, et al.Optimal extraction and fingerprint analysis of Cnidii fructus by accelerated solvent extraction and high performance liquid chromatographic analysis with photodiode array and mass spectrometry detections. Food Chem.2013;141(3):1962-1971.

[18] Zhang ZR,Leung WN,Li G,et al.Osthole Enhances Osteogenesis in Osteoblasts by Elevating Transcription Factor Osterix via cAMP/CREB Signaling In Vitro and In Vivo. Nutrients.2017;9(6):588.

[19] Li XX, Hara I,Matsumiya T.Effects of osthole on postmenopausal osteoporosis using ovariectomized rats; comparison to the effects of estradiol.Biol Pharm Bull.2002; 25(6):738-742.

[20] Jia M,Li Y,Xin HL,et al.Estrogenic activity of osthole and imperatorin in MCF-7 cells and their osteoblastic effects in Saos-2 cells.Chin J Nat Med.2016;14(6):413-420.

[21] Zhai YK,Pan YL,Niu YB,et al.The importance of the prenyl group in the activities of osthole in enhancing bone formation and inhibiting bone resorption in vitro. Intern J Endocrinol. 2014; 2014;(9):921954.

[22] Ming LG,Zhou J,Cheng GZ, et al.Osthol, a coumarin isolated from common cnidium fruit, enhances the differentiation and maturation of osteoblasts in vitro. Pharmacology.2011；88(1-2):33-43.

[23] Zhang W,Ma D,Zhao Q, et al.The effect of the major components of Fructus Cnidii on osteoblasts in vitro. J Acupunct Meridian Stud.2010;3(1):32-37.

[24] Tang DZ, Hou W, Zhou Q, et al. Osthole stimulates osteoblast differentiation and bone formation by activation of beta-catenin-BMP signaling.J Bone Miner Res.2010;25(6): 1234-1245.

[25] Kuo PL, Hsu YL, Chang CH, et al. Osthole-mediated cell differentiation through bone morphogenetic protein-2/p38 and extracellular signal-regulated kinase 1/2 pathway in human osteoblast cells.J Pharmacol Exp Ther.2005;314(3): 1290-1299.

[26] An J, Yang H, Zhang Q, et al. Natural products for treatment of osteoporosis: The effects and mechanisms on promoting osteoblast-mediated bone formation. Life Sci.2016;147: 46-58.

[27] Roussel BD, Kruppa AJ,Miranda E,et al.Endoplasmic reticulum dysfunction in neurological disease. The Lancet Neurol.2013;12(1):105-118.

[28] Ryoo HD. Long and short (timeframe) of endoplasmic reticulum stress-induced cell death. FEBS J. 2016;283(20): 3718-3722.

[29] Moreno JA, Tiffany-Castiglioni E. The chaperone Grp78 in protein folding disorders of the nervous system. Neurochem Res.2015；40(2):329-335.

[30] Rao RV, Bredesen DE.Misfolded proteins, endoplasmic reticulum stress and neurodegeneration. Curr Opin Cell Biol. 2004;16(6):653-662.

[31] Zhu G, Lee AS.Role of the unfolded protein response, GRP78 and GRP94 in organ homeostasis. J Cell Physiol. 2015; 230(7):1413-1420.

[32] Okumura M, Kadokura H, Inaba K. Structures and functions of protein disulfide isomerase family members involved in proteostasis in the endoplasmic reticulum. Free Radic Biol Med.2015;83:314-322.

[33] Kranz P,Neumann F,Wolf A,et al.PDI is an essential redox-sensitive activator of PERK during the unfolded protein response (UPR). Cell Death Dis. 2017;8(8):e2986.

[34] Gutiérrez T, Simmen T.Endoplasmic reticulum chaperones and oxidoreductases: critical regulators of tumor cell survival and immunorecognition. Front Oncol. 2014;4:291.

[35] Marciniak SJ, Yun CY, Oyadomari S,et al.CHOP induces death by promoting protein synthesis and oxidation in the stressed endoplasmic reticulum.Genes Dev.2004;18(24): 3066-3077.

[36] Southwood CM,Garbern J,Jiang W, et al. The unfolded protein response modulates disease severity in Pelizaeus-Merzbacher disease. Neuron.2002;36(4):585-596.

[37] Rozpedek W,Pytel D,Mucha B,et al.The Role of the PERK/eIF2α/ATF4/CHOP Signaling Pathway in Tumor Progression During Endoplasmic Reticulum Stress.Curr mol med.2016;16(6):533-544.

[38] Hiramatsu N,Kasai A,Hayakawa K,et al.Real-time detection and continuous monitoring of ER stress in vitro and in vivo by ES-TRAP: evidence for systemic, transient ER stress during endotoxemia.Nucleic acids Rre.2006;34(13):e93.

[39] 王青,张云,毛红娇,等. 蛇床子素对TCP颗粒诱导小鼠颅骨溶解的影响[J].中国病理生理杂志,2015,31(12):2265-2270.

[40] Adler S, Pellizzer C, Paparella M, et al. The effects of solvents on embryonic stem cell differentiation. Toxicol In Vitro. 2006; 20(3):265-271.

[41] Gardner BM,Pincus D,Gotthardt K,et al.Endoplasmic reticulum stress sensing in the unfolded protein response. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2013;5(3):a013169.

引言

骨质疏松症是一种以低骨量和骨组织微结构破坏为特征，导致骨质脆性增加和易于骨折的全身性骨代谢性疾病，是老年人最常见的疾病之一，可严重影响患者的生活质量。随着中国人口的老龄化^[1]，骨质疏松症带来的负面影响日趋广泛。因此，如何有效防治骨质疏松症逐渐成为了学者们的研究热点。

药物治疗是骨质疏松症防治的重要方法，尽管已有诸多药物被开发出来治疗骨质疏松症，但是这些药物存在不同程度的不良反应^[2-10]，因此研究者们正在寻找经典骨质疏松治疗药物的替代品^[11-13]。目前药物治疗骨质疏松症主要着手于抑制骨吸收与促进骨形成^[14]，并辅以补充必要的钙剂。近年来，中药凭借其不良反应小的优势，越来越受到临床医师及研究者的关注，使用中药治疗骨质疏松症的文献报道逐渐增多^[15]。对这些文献进行处方分析，结果显示蛇床子在治疗骨质疏松症的中药方剂中出现频率较高^[16]。蛇床子是伞形科植物蛇床的干燥成熟果实，其有效成分蛇床子素(osthol，OST)被证实具备抗骨质疏松效应^[17-19]。研究表明，蛇床子素可以通过促进成骨细胞分化而促进骨形成，但蛇床子素抗骨质疏松效应的机制尚不明确，并且以往研究中蛇床子素对成骨细胞增殖的影响结果存在一定差异^[18^，^20-25]。因此，验证蛇床子素对成骨细胞增殖与分化的影响并探究其作用机制具有重要意义，可以为新的抗骨质疏松药物的开发提供证据及理论支持^[26]。

文章验证了蛇床子素对体外培养大鼠成骨细胞增殖与分化的作用，结合实验结果，联系其他领域的研究成果综合分析，提出内质网应激可能是蛇床子素对成骨细胞增殖与分化影响的作用机制之一，并通过实验进一步证实。

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材料方法

1.1 设计细胞学实验观察。

1.2 时间及地点实验于2016年10月至2017年3月在南京中医药大学唐仲英科技楼完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物出生24 h的SD大鼠10只，性别不限，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场，许可证号：SCXK (苏)2017-0001。

1.3.2 实验用主要试剂和药品低糖DMEM培养基(HyClone，美国)，胎牛血清(GIBCO 10099-141，美国)，0.25%胰蛋白酶-EDTA、萘酚AS-MX磷酸盐、固蓝BB盐、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、戊酸雌二醇(均为Sigma，美国)，Tris碱(Biosharp，中国)，CCK-8试剂盒(同仁，日本)，碱性磷酸酶(ALP)定量检测试剂盒(碧云天，中国)，抗大鼠GRP78、PDI、CHOP抗体(CST，美国)，蛇床子素标准品(中国食品药品检定研究院)。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组实验共分为5组，分别为溶剂对照组、 β-雌二醇组、蛇床子素低剂量组、中剂量组、高剂量组。由于β-雌二醇与蛇床子素均难溶于水，故各组培养基中均含有0.25%的二甲基亚砜助溶。β-雌二醇组中β-雌二醇浓度为1×10^-8mol/L，蛇床子素低、中、高剂量组中蛇床子素浓度分别为1×10^-6，1×10^-5，1×10^-4mol/L。

1.4.2 原代大鼠成骨细胞的分离与培养无菌条件下分离乳鼠颅骨，置于冷PBS中，剥离结缔组织，将颅骨剪成 1 mm×1 mm左右大小碎块，37 ℃下于5 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA中消化30 min，加入0.5 mL胎牛血清终止消化，弃胰蛋白酶溶液，将碎骨片转移入50 mL离心管，加入0.1%Ⅱ型胶原酶10 mL，于37 ℃震荡培养箱中震荡消化4 h，吹打均匀后过100 μm细胞筛，1 000 r/min离心5 min，弃上清，用含10%的低糖DMEM培养基重悬，接种于25 cm²培养瓶中，置于37 ℃二氧化碳培养箱中培养2 h，吸取上清转移至另一培养瓶培养，10 min后再次吸取上清转移入第3个培养瓶中培养，于37 ℃二氧化碳培养箱中培养过夜后换液，其后每2 d换液。

1.4.3 碱性磷酸酶染色弃培养基，用PBS润洗2次，使用体积分数95%乙醇固定10 min，弃乙醇，用双蒸水润洗 5次，将萘酚AS-MX磷酸盐1 mg、固蓝BB盐6 mg溶于50 μL N，N-二甲基甲酰胺中，并用0.2 mol/L的Tris-HCl缓冲液稀释至10 mL制成碱性磷酸酶染液，加入固定后的细胞中，摇床上避光孵育30 min，弃染液，加入甲基绿染液复染细胞核30 min，弃染液，用双蒸水润洗5次，于倒置相差显微镜下观察。

1.4.4 CCK-8法检测细胞增殖胰酶消化后用低糖DMEM培养基重悬细胞，将细胞按1×10⁷ L^-1细胞浓度，每孔200 μL接种于96孔板上，第2天更换为含药完全培养基培养。24 h后将培养基更换为100 μL低糖DMEM培养基，加入10 μL CCK-8溶液，37℃孵育4 h，用酶标仪检测并记录450 nm处吸光度值，弃孵育液并用PBS润洗2次，加入含药完全培养基继续培养，按上述方法再次检测48 h及72 h的吸光度值。

1.4.5 碱性磷酸酶活力检测胰酶消化后用低糖DMEM培养基重悬细胞，将细胞按5×10⁷L^-1，每孔200 μL接种于3块96孔板上，第2天更换为含药完全培养基培养。分别于药物干预24，48，72 h后取出相应的96孔板，使用CCK-8法检测吸光度值后用PBS洗净96孔板，加入1%的Triton裂解液于冰上裂解30 min，按照碧云天碱性磷酸酶检测试剂盒说明加入底物缓冲液孵育1 h后，加入反应终止液，于酶标仪上检测405 nm处吸光度值，根据标准曲线得出各孔碱性磷酸酶活力值后，以CCK-8法测得的吸光度值为内参，得到校准后的碱性磷酸酶活力值。

1.4.6 矿化能力检测胰酶消化后用低糖DMEM培养基重悬细胞，将细胞按1×10⁹ L^-1，每孔1 mL接种于24孔板上，第2天更换为含药完全培养基培养，每2 d换液。当对照组出现矿化结节时终止培养。体积分数95%乙醇固定10 min后用0.1%的茜素红-Tris-HCl染液(Ph 8.3)于37 ℃孵育 30 min，双蒸水洗净，吸弃残余双蒸水，使用相机于自制固定架上拍摄每孔图像，用ImageJ软件将图片转换为灰度图像进行灰度分析。

1.4.7 内质网应激相关蛋白检测将细胞按1×10⁹ L^-1细胞浓度接种于6孔板上，第2天更换为含药完全培养基培养。药物干预后48 h，弃培养基，加入RIPA强裂解液用细胞刮刀刮下细胞，于冰上裂解30 min，以13 500 r/min 4 ℃离心30 min，吸取上清制作蛋白样品，使用Western Blot法检测GRP78、PDI、CHOP表达，实验重复3次，用ImageJ软件进行蛋白条带灰度分析。

1.5 主要观察指标 ①成骨细胞光镜下形态学观察；②成骨细胞碱性磷酸酶染色光镜下观察；③CCK-8实验吸光度值测定；④碱性磷酸酶活力测定(使用酶标仪测定吸光度值)；⑤茜素红染色吸光度值分析；⑥GRP78、PDI、CHOP、GAPDH蛋白条带灰度分析。

1.6 统计学分析实验数据以x(_)±s表示，使用GraphPad Prism 6.0进行单因素方差分析和SNK-q检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

内质网负责细胞中蛋白质的翻译与折叠，当内质网的能量供应不足或负荷过高会导致蛋白质不折叠或错误折叠，进而引起内质网应激^[27]。内质网应激将细胞导向两个结局，一是细胞凋亡，二是内质网恢复正常功能^[28]。

GRP78是一种分子伴侣^[29]，在内质网中辅助蛋白质折叠，可以识别错误折叠蛋白并使其降解或重新折叠。GRP78的水平越高，越有利于内质网中蛋白的正确折叠，促使细胞恢复正常功能；而GRP78水平越低，内质网中未折叠或错误折叠蛋白蓄积，内质网应激持续激活，易引起细胞凋亡^[30-31]。

PDI是蛋白质二硫键异构酶^[32]，具有分子伴侣功能。

分泌蛋白需要通过在分子内或分子间形成二硫键，从而形成其天然构象，PDI可以催化这些二硫键的形成和异构化。当内质网中分泌蛋白翻译量增加时，PDI的表达会相应增高。此外，在内质网中错误折叠或未折叠蛋白增多时，其含量也会随之升高，抑制错误位置的二硫键生成，以促进蛋白正确折叠^[33-34]。

图2 成骨细胞的鉴定(A：×40，B：×200，C：×40)

Figure 2 Identification of osteoblasts

图注：图A、B经偶氮偶联法染色后，成骨细胞胞体呈现紫红色，胞质丰富而清晰。使用甲基绿复染细胞核，可以清晰地看到单个细胞核；C为茜素红染色后矿化结节呈红色。

GRP78

PDI

CHOP

GAPDH

溶剂对照组 β-雌二醇组低剂量组中剂量组高剂量组

图3 蛇床子素对大鼠成骨细胞内质网应激相关蛋白表达的影响

Figure 3 Effect of osthol on the expression levels of endoplasmic reticulum stress-related proteins in rat osteoblasts

图注：CHOP只有在高浓度(10^-4 mol/L)蛇床子素组有明显表达，其余各组表达量极小。

蛇床子素

图1 成骨细胞的形态学观察(×40)

Figure 1 Morphology of osteoblasts (x40)

图注：图A刚接种的成骨细胞呈球形；B为24 h后细胞形态不规则，呈三角形或多角形，有较多突起；C为生长期细胞突起互相连接；D为汇合时，细胞呈铺路石状。

表3 蛇床子素对大鼠成骨细胞矿化能力的影响 (x(_)±s，×10⁴)

Table 3 Effect of osthol on rat osteoblastic mineralization

组别	灰度值
溶剂对照组	1.626±0.424
β-雌二醇组	3.077±0.728
蛇床子素低剂量组	2.767±0.773
蛇床子素中剂量组	2.909±0.737
蛇床子素高剂量组	3.901±0.725^a

表注：与溶剂对照组比较，^aP < 0.05。

表2 蛇床子素对大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活力的影响 (x(_)±s，IU)

Table 2 Effect of osthol on the differentiation of rat osteoblasts

组别	干预时间
组别	24 h	48 h	72 h
溶剂对照组	690.4±66.6	553.6±96.0	574.2±40.3
β-雌二醇组	700.3±103.5	629.2±98.6	642.1±88.2
蛇床子素低剂量组	800.5±127.8	725.3±113.0	682.8±124.9
蛇床子素中剂量组	1 171.0±106.3	1 115.0±334.9	812.8±191.6
蛇床子素高剂量组	2 119.0±613.1^ab	1 420.0±160.1^ab	1 223.0±146.5^ab

表注：与溶剂对照组比较，^aP < 0.05；与β-雌二醇组比较，^bP < 0.05。

表1 蛇床子素对大鼠成骨细胞增殖的影响 (x(_)±s，A，×10^-3)

Table 1 Effect of osthol on the proliferation of rat osteoblasts

组别	干预时间
组别	24 h	48 h	72 h
溶剂对照组	610.0±34.87	663.3±75.1	670.3±11.9
β-雌二醇组	582.5±26.7	567.0±41.6	643.5±51.5
蛇床子素低剂量组	509.5±50.2^a	508.0±25.0^a	596.5±46.0
蛇床子素中剂量组	431.8±22.7^ab	405.5±60.3^ab	488.8±55.0^ab
蛇床子素高剂量组	298.3±21.5^ab	307.3±6.4^ab	320.5±7.8^ab

表注：与溶剂对照组比较，^aP < 0.05；与β-雌二醇组比较，^bP < 0.05。

图3 蛇床子素对大鼠成骨细胞内质网应激相关蛋白表达的影响

Figure 3ffect of osthol on the expression levels of endoplasmic reticulum stress-related proteins in the rat osteoblasts

图注： CHOP只有在高浓度(10^-4mol/L)蛇床子素组有明显表达，其余各组表达量极小。

溶剂对照组β-雌二醇组OST低剂量组 OST中剂量组 OST高剂量组

GRP78

PDI

CHOP

GAPDH

CHOP是内质网应激的特异性标志蛋白^[27]，在正常细胞中几乎不表达，只有在细胞发生内质网应激时表达才会显著升高。当敲除CHOP基因时，细胞将免于内质网应激诱发的凋亡^[35]。因此，学者们普遍认为CHOP的功能是促进细胞凋亡。但是，还有一些研究表明CHOP起到抗细胞凋亡的作用^[36]。对于这样的矛盾情况，有学者提出CHOP的主要功能是促进蛋白质分泌^[27]，并找到了实验依据。当发生内质网应激时，CHOP蛋白合成增加，进而促进蛋白分泌。但是内质网应激的诱因未去除时，CHOP促进蛋白分泌的作用反而会进一步加重内质网的负载，从而加重内质网应激，形成一个正反馈循环^[35]。因此，CHOP的高表达代表内质网应激的激活，并预示着细胞的凋亡趋势^[37]。

研究表明，蛇床子素可以防治大鼠骨质疏松^[19]。然而，与诸多其他研究相同^[21^，^23]，本次实验中蛇床子素抑制了成骨细胞的增殖，这样的结果看似与抗骨质疏松的效应相悖。为了解释其中的原因，作者提出了内质网应激假说：蛇床子素可以促进成骨细胞部分分泌蛋白表达，且蛇床子素浓度越高，其促进作用越强，当超过内质网的最大载荷时，便可以诱发内质网应激，进而诱导成骨细胞凋亡。

在本实验中，蛇床子素表现出浓度依赖的增强成骨细胞内碱性磷酸酶活力的作用。此外，蛇床子素在增强成骨细胞内碱性磷酸酶活力的同时，伴有对成骨细胞增殖的抑制，尤其是高浓度蛇床子素组，其抑制成骨细胞增殖的作用最为明显。成骨细胞增殖受到抑制，可能是细胞周期受到阻断，也可能是细胞凋亡导致数量减少。CHOP蛋白在高浓度蛇床子素组的高表达意味着10^-4mol/L的蛇床子素诱发了成骨细胞的内质网应激，并促使成骨细胞凋亡。CCK-8检测结果表明10^-4mol/L蛇床子素可以显著抑制成骨细胞数量的增长，这与CHOP蛋白在高浓度蛇床子素组高表达的结果一致，假说得到初步验证：碱性磷酸酶即是被促进的分泌蛋白的一种，碱性磷酸酶活力的增强是蛇床子素提高碱性磷酸酶蛋白水平的结果，但是高浓度的蛇床子素使碱性磷酸酶蛋白翻译过多，诱发了内质网应激，导致成骨细胞凋亡，从而表现为蛇床子素抑制了成骨细胞增殖。有趣的是，既往有学者研究发现内质网应激可以直接降低分泌性碱性磷酸酶的活力^[38]，因此本实验中内质网应激的激活可能是碱性磷酸酶活力过度提高的负反馈机制。

蛇床子素与内质网应激反应的关系，既往已有学者开展过动物实验研究^[39]。研究发现，颅骨局部注射20 mg/kg蛇床子素能够逆转TCP颗粒诱导的炎症因子释放、破骨细胞生成及TRAP活性增强，同时还能减弱内质网应激反应。此结果与本实验结果相悖，可能与以下因素有关：①局部注射蛇床子素使用的溶剂或者助溶剂不同，可能会对细胞产生影响。本研究采用0.25%二甲基亚砜助溶，根据文献报道，0.25%二甲基亚砜对细胞没有明显毒性^[40]；②蛇床子素采用注射给药，颅骨内成骨细胞接触到的蛇床子素浓度可能较低，而浓度是蛇床子素影响成骨细胞增殖与分化的一个重要因素，低浓度蛇床子素不会引起成骨细胞严重的内质网应激；③在体内实验中，蛇床子素可能通过机体的其他途径间接影响成骨细胞的内质网应激反应，而非直接作用于成骨细胞；④两项研究中诱发成骨细胞内质网应激的原因不同，本研究可能为内质网过载反应，是由高浓度蛇床子素过度促进分泌蛋白合成引起。而上述体内实验成骨细胞内质网应激是由TCP诱发，其机制与本研究不同。

通常情况下，内质网应激发生时，细胞内分子伴侣的水平会相应提高^[41]。在本实验中出现了一个有趣的现象：高浓度蛇床子素组PDI如预期提高，但是GRP78水平反而下降了。由于GRP78的表达与IRE1通路和ATF6通路有关，CHOP的表达与PERK通路、IRE1通路和ATF6通路均有关^[16]，因此，高浓度蛇床子素诱发内质网应激可能在PERK通路还有特定的靶点，这将成为下一步研究的方向。本实验尚有一些不足之处，例如检测细胞增殖和凋亡采用流式细胞术将更有说服力。此外，本实验仅检测了内质网应激相关蛋白的水平，后续可检测相应的基因转录水平进一步验证实验结果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

基于内质网应激研究蛇床子素对成骨细胞增殖与分化的影响

Osthol effects on the proliferation and differentiation of osteoblasts based on endoplasmic reticulum stress

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[1]	王秋霏, 顾叶, 彭育沁, 薛峰, 巨荣, 朱锋, 王熠军, 耿德春, 徐耀增. 人工假体磨损颗粒作用下Wnt/β-catenin信号通路对成骨细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(24): 3894-3901.
[2]	唐小凯, 李伟明. Nel样分子1型蛋白在脊柱融合术后促进骨性融合的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(24): 3914-3920.
[3]	霍花, 程余婷, 周倩, 齐昱晗, 伍超, 石前会, 杨童景, 廖健, 洪伟. 种植体表面药物涂层对骨结合的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3558-3564.
[4]	魏琴, 张雪, 马磊, 李志强, 寿玺, 段明军, 吴硕, 贾麒钰, 马创. 血小板衍生生长因子BB诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 2953-2957.
[5]	郭志斌, 吴春芳, 刘子洪, 张钰英, 迟博婧, 王宝, 马超, 张国彬, 田发明. 辛伐他汀可刺激骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 2963-2968.
[6]	姜涛, 凌翠敏, 陈庆真, 杨冰璇, 林燕平, 邵敏. 淫羊藿苷通过提高自噬促进成骨细胞分化防治骨质疏松[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(17): 2643-2649.
[7]	艾力麦尔旦•艾尼瓦尔, 王玲, 古丽, 迪丽达尔•塔西甫拉提, 王珊, 尹宏斌. 转化生长因子β3对成骨细胞增殖和成骨能力的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(17): 2664-2669.
[8]	吴钰坤, 韩杰, 温帅波. 骨折愈合过程中Runx2基因的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(14): 2274-2279.
[9]	韩飞, 蒲沛东, 马青源, 朱洲均, 王梦雨, 王超, 石冲, 史晨辉, 王维山. 骨肉瘤外泌体miR-1307与骨肉瘤细胞的增殖和凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 2036-2042.
[10]	税晓平, 李春莹, 曹艳霞, 苏全生. 有氧和抗阻运动干预2型糖尿病模型大鼠周围神经内质网应激相关蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1693-1698.
[11]	张煦坚, 赵振群, 刘万林. 激素性股骨头缺血坏死发病机制中的内质网应激[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1759-1765.
[12]	李冬冬, 廖红兵. miR-214参与骨组织代谢的调控[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1779-1784.
[13]	陈强, 卓鸿武, 夏天, 叶哲伟. 不同质量浓度异烟肼对体外培养乳鼠成骨细胞的毒性作用[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1162-1167.
[14]	许国峰, 李学斌, 唐一钒, 赵寅, 周盛源, 陈雄生, 贾连顺. 人黄韧带细胞骨化发生过程中的自噬[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1174-1181.
[15]	周玉, 龙小安, 李宁, 王纯. 有限元法分析髌腱炎状态时的生物力学变化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1280-1286.