骨骼肌中筋膜源性细胞分化为软骨细胞的能力

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0198

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (12): 1823-1828.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0198

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骨骼肌中筋膜源性细胞分化为软骨细胞的能力

向勇，李广恒

郑州大学第一附属医院骨科，河南省郑州市 450000

收稿日期:2017-12-20 出版日期:2018-04-28 发布日期:2018-04-28
通讯作者: 李广恒，博士，教授，博士生导师，郑州大学第一附属医院骨科，河南省郑州市 450000
作者简介:向勇，男，1992 年生，四川省南充市人，汉族，郑州大学在读硕士，主要从事关节外科基础及临床研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81472136)

Chondrogenic progenitor cells isolated from the fascia of skeletal muscle

Xiang Yong, Li Guang-heng

Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, Henan Province, China

Received:2017-12-20 Online:2018-04-28 Published:2018-04-28
Contact: Li Guang-heng, M.D., Professor, Doctoral supervisor, Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, Henan Province, China
About author:Xiang Yong, Master candidate, Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, Henan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81472136

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
阿尔新蓝染色：阿尔新蓝属于阳离子染料，是显示酸性黏液物质最特异的染料，染料与酸性基团形成盐键。利用染料的不同pH值及不同电解质浓度，可区分酸性黏液物质的类别，能够特异性地显示软骨细胞胞外基质，检测软骨发育情况。
骨形态发生蛋白4：是机体的多肽生长因子之一，起源于脱钙骨基质，在正常骨折愈合中的软骨内成骨期中表达，与转化生长因子β家族成员一样，与受体结合后，磷酸化引起核基因的表达，可以增加软骨形成及促进分化。

摘要
背景：骨骼肌中的肌源性细胞在骨形态发生蛋白4与转化生长因子β3的作用下具有成软骨分化的能力，但由于骨骼肌组成复杂，其中包括肌纤维组织、筋膜组织、血管组织、神经组织等，所以其中具备向软骨分化能力的细胞组织来源尚未确定。
目的：观察骨骼肌中筋膜源性细胞分化成软骨细胞的能力，以明确骨骼肌来源的细胞中具有成软骨分化能力的种子细胞。
方法：分离大鼠的臀大肌筋膜组织，剪成细小组织块后于含骨形态发生蛋白4和转化生长因子β3的软骨形成培养基中培养，在第14天收集样本，使用阿尔新蓝、苏木精-伊红染色和番红O染色来鉴定筋膜源性细胞的成软骨细胞分化能力；使用结蛋白、CD34、波形蛋白、v-WF和α平滑肌肌动蛋白相应抗体的免疫染色来研究筋膜源性细胞上各种不同细胞标志物在的表达情况；筋膜源性细胞与L6大鼠成肌细胞不同比例混合(1∶0，4∶1，1∶1，1∶4，0∶1)，用免疫染色方法分析筋膜源性细胞和L6细胞分化成软骨细胞的能力。
结果与结论：①当在软骨形成培养基中培养第14天时，在阿尔新蓝和番红O免疫染色为阳性结果，表明筋膜组织块中的细胞具有分化成软骨细胞的能力；②分离的筋膜源性细胞的结蛋白，CD34、v-WF抗原和α平滑肌肌动蛋白的表达是阴性的，但超过90%的细胞表达波形蛋白；③纯筋膜源性细胞成软骨分化能力最强，随着L6大鼠成肌细胞比例增高，其成软骨分化能力逐渐下降；④结果提示，从骨骼肌中筋膜源性细胞表面标记物分析、免疫染色及筋膜源性细胞与L6大鼠成肌细胞混合培养对比后，表明筋膜源性细胞具有分化成软骨细胞的能力，是骨骼肌来源的细胞中具有成软骨能力的种子细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-4378-3450(向勇)

关键词: 筋膜细胞, 间充质干细胞, 软骨细胞, 骨形态发生蛋白4, 转化生长因子&beta, 3, 细胞分化, 种子细胞, 成肌细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Muscle derived cells in the skeletal muscle have the ability to differentiate into chondrocytes under the induction of bone morphogenic protein 4 and transforming growth factor β3. However, due to the complexity of the skeletal muscle (consisting of muscle fiber, fascia, blood vessel and nerves), the origin of cells has not been identified.
OBJECTIVE: To observe the potential for chondrogenic differentiation of fascia-derived cells (FDCs) in order to clarify the chondrogenic ability of the cells derived from the skeletal muscle.
METHODS: The fascia was isolated from the rat gluteus maximus, and was then cultured in chondrogenic medium containing bone morphogenic protein 4 and transforming growth factor β3. Samples were harvested on day 14. The chondrogenic differentiation of FDCs was identified by alcian blue, hematoxylin-eosin and safranin O stainings. Cell markers were investigated by immunostaining using the antibodies for desmin, CD34, vimentin, vWF and a-SMA. Immunostaining was used to assay the chondrogenic potential of FDCs cultured with L6 rat myoblasts at varying ratios (1:0, 4:1; 1:1, 1:4 and 0:1).
RESULTS AND CONCLUSION: FDCs harvested from the skeletal muscle displayed chondrogenic differentiation and formed cartilaginous tissue when cultured for 14 days in chondrogenic medium after alcian blue and safranin O stainings. Cells isolated from the fascia were negative for desmin, CD34, vWF and a-SMA, but over 90% of the cells were positive for vimentin. Mixed FDC and L6 myoblast pellets showed chondrogenic potential decreased with the increasing ratio of L6 myoblasts. From the analysis of cell surface marker of FDCs in the skeletal muscle, immunostaining, and the comparison with L6 rat myoblasts, it shows that FDCs are the seed cells with chondrogenic potential in the skeletal muscle.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Muscle, Skeletal, Fascia, Chondrocytes, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

向勇，李广恒. 骨骼肌中筋膜源性细胞分化为软骨细胞的能力[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(12): 1823-1828.

Xiang Yong, Li Guang-heng. Chondrogenic progenitor cells isolated from the fascia of skeletal muscle[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(12): 1823-1828.

图/表（结果） 1

2.1 臀大肌筋膜组织染色和其软骨细胞分化能力的分析取Fischer 344大鼠臀大肌肌筋膜进行活检，苏木精-伊红染色结果显示，筋膜组织主要是由包裹骨骼肌的纤维和结缔组织组成(图1)；筋膜组织块在软骨细胞培养基中培养，在软骨形成培养基中培养14 d之后，番红O和阿尔新蓝染色后可观察到软骨细胞的典型圆形形态和典型的细胞外基质，表明有软骨组织形成(图2)。

2.2 细胞表面标记物分析筋膜组织分离细胞的免疫组织化学染色显示，细胞核被染成蓝色，结蛋白被染成红色；在软骨形成基质培养之后，筋膜源性细胞获得成纤维细胞样外观(图3)。事实上，当结蛋白(肌原细胞标志物)和波形蛋白(成纤维细胞标志物)染色时，几乎所有的筋膜源性细胞均表达波形蛋白，而几乎不表达结蛋白、CD34，v-WF(内皮标记)和α平滑肌肌动蛋白(周细胞标记)，支持这些细胞的成纤维细胞的特性^[18-19]。

2.3 筋膜源性细胞与大鼠L6成肌细胞混合培养分析不同比例的筋膜源性细胞和L6成肌细胞混合群在软骨培养检测结果表明，其成软骨能力随着L6成肌细胞比例的增加而逐渐下降。完全由筋膜源性细胞组成的细胞团表现出最强的成软骨能力，其软骨细胞形态，及细胞外基质形成方面符合体外培养软骨细胞的形态学改变，而完全由L6成肌细胞组成的细胞团表现出最弱的软骨形成潜力，其软骨细胞形态，大小及细胞基质形成方面较差(图4)。在较高放大倍率下，理想的软骨形成分化(筋膜源性细胞)和低分化(L6)的比较，在番红O阳性染色(红色)中，纯筋膜源性细胞组可以见到典型的软骨基质内占据空隙的软骨细胞，而在纯L6组中没有发现典型的软骨细胞。番红O和阿尔新蓝染色后表明其筋膜源性细胞是主要的成软骨细胞，而L6成肌细胞表现出的成软骨能力十分有限。

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引言

骨关节炎仍是骨科最棘手疾病，是全球的主要疾病负担^[1]。关节软骨的退行性病变是骨关节炎的特征性病理变化，各种生物性因素和机械性因素可能造成软骨的持续损伤，但缺乏明确的病因^[2]。而且，临床上目前尚无有效的措施来控制骨关节炎病情进展，虽然临床上治疗措施种类较多，包括理疗、口服消炎止痛药物治疗、关节腔注射激素治疗、关节镜及关节置换等，但总的来说，均未取得满意的疗效^[3]。随着干细胞研究的不断进步和组织工程技术的广泛开展，大量的科研人员及科研资金投入到了骨关节炎的有效治疗措施的探索中^[4]。此外，间充质干细胞应用于骨关节炎中受损的关节软骨的修复取得了阶段性的成果，前景乐观^[5]。

目前，关节软骨组织工程在修复关节软骨缺损和恢复关节功能方面已经取得了很大的进展^[6]。大量基础实验表明，软骨种子细胞来源包括骨髓基质干细胞、脂肪干细胞、皮肤成纤维细、诱导多能干细胞、关节滑膜细胞、骨骼肌细胞等^[7-12]。尽管这些种子细胞在关节软骨组织工程得到了广泛运用并取得显著成果，但在细胞培养和细胞分化的调控上仍面临巨大挑战^[13]。但其中骨骼肌细胞因其取材方便、植入后免疫排斥反应小、体外增殖能力强、软骨细胞表型稳定等特点在软骨组织工程应用中具有独特的优势^[14]。因此越来越多的研究者开展了骨骼肌细胞相关的基础实验，并发现骨骼肌中卫星细胞是多能细胞，具有成骨分化能力、成肌分化能力和成软骨分化能力^[15]。有文献报道在骨形态发生蛋白4和转化生长因子β3的刺激下，骨骼肌干细胞在体内和体外都具有向成软骨细胞分化的能力，但由于骨骼肌组成复杂，其中包括肌纤维组织、筋膜组织、血管组织、神经组织和血管内循环细胞等，所以其中具备向软骨分化能力的细胞组织来源尚未确定^[16-17]。

基于骨骼肌细胞的独特优势，可以推测骨骼肌筋膜和类似的骨骼肌纤维组织筋膜细胞中可能存在具有向软骨细胞分化能力的细胞。因此进一步探索具有向软骨细胞分化能力的骨骼肌细胞群的特性，来明确筋膜源性细胞是否为骨骼肌中具有成软骨能力的细胞，为组织工程运用寻找重要的新的种子细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学实验。

1.2 时间及地点于2016年12月至2017年9月在郑州大学第一附属医院重点实验室基因与细胞治疗中心完成。

1.3 材料

实验动物：8周龄健康Fischer 344大鼠1只，雄性，体质量200 g，购自济南金丰实验动物有限公司，许可证号：SCXK(鲁)2014 0006。实验方案已获得郑州大学第一附属医院伦理委员会的批准。

实验主要试剂及仪器：软骨形成培养基(Cambrex)；杜尔伯科改良伊格尔培养基(DMEM)；优质胎牛血清(FBS， Gibco公司)；优质马血清(HS，BD Pharmingen公司)；I型胶原酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶(Sigma公司)；兔抗小鼠结蛋白抗体(Desmin，Santa Cruz Biotechnology)；抗小鼠的Cy3结合IgG(BD Pharmingen公司)；异硫氰酸荧光素(FITC)结合的小鼠抗CD34(Santa Cruz Biotechnology公司)；Cy3结合的波形蛋白抗体(Vimentin，Sigma公司)；兔抗第VIII因子关连抗原抗体(Santa Cruz Biotechnology公司)；兔抗α平滑肌肌动蛋白抗体(Chemicon公司)；FITC结合的山羊抗兔IgG(Vector Labs公司)；7-氨基放射菌素 D(7AAD，BD Pharmingen公司)；转化生长因子β3(R&D Systems公司)；骨形态发生蛋白4(Peprotech公司)；阿尔新蓝，苏木精-伊红染色(Sigma公司) ；番红O染色(Safranin O，Sigma公司)。

1.4 方法

1.4.1 骨骼肌筋膜的苏木精-伊红染色无菌组织剪获取Fischer 344大鼠臀大肌骨骼肌筋膜，组织洗液反复洗涤5次，超净台里将组织置于冰盒上的培养皿中，在预先冷却的2-甲基丁烷中快速冷冻，并在-80 ℃储存；将切片在室温下在体积分数4%甲醛中固定15 min，固定后的组织块经过冲洗、修整、脱水、透明、浸蜡、包埋(浸蜡、包埋温度<65 ℃)，制成蜡块，每个蜡块连续切片4张(厚度4 μm)，预热水中展片，贴至载玻片，放于45 ℃恒温箱中烘干，石蜡切片脱蜡，至水，苏木精水溶液，乙醇伊红染色，封固。荧光显微镜(徕卡)下采集图像。

1.4.2 骨骼肌筋膜组织块的成软骨能力的分析将新鲜获取的骨骼肌筋膜剪成5 mmx5 mm大小的组织块，筋膜组织块在细胞培养液中会自动收缩成球状。将这些球状组织块分别转移入15 mL离心管中，在离心管中加入1 mL软骨形成培养基(含500 μg/L骨形态发生蛋白4和10 μg/L转化生长因子β3，混匀后2 000 r/min离心5 min，含体积分数5%CO₂的细胞培养箱中培养，每隔两三天更换培养基；于第14天收集样品并用石蜡包埋，切片用阿尔新蓝染色：二甲苯脱蜡梯度乙醇脱水后，蒸馏水冲洗10 min，体积分数3%醋酸分化液处理3 min，阿尔新蓝染色30 min，自来水冲洗1 min。二甲苯透明封固。

1.4.3 细胞分离与筛选取Fischer 344大鼠的臀大肌筋膜来分离筋膜源性细胞，剪成2 mmx2 mm大小的组织碎末，放置在冰盒上的培养皿中。加至含3 mL 0.2%Ⅰ型胶原酶的15 mL离心管中，孵育1 h，后再添加0.1%胰蛋白酶、中性蛋白酶继续孵育30 min；取孵育液在100目滤网中过滤，后将滤液置于50 mL离心管中，以1 000 r/min的转速离心5 min；弃上清，沉淀加至含体积分数10%胎牛血清的DMEM中混悬，将获得的细胞接种在100 mL培养瓶中，在体积分数5%CO₂，37 ℃的条件下培养24-48 h，换液，去除未贴壁细胞，两三天更换一次培养基，光镜观察细胞融合情况，细胞80%融合后传代。0.1%胰蛋白酶消化并收获第2代细胞作为实验细胞，1 mL PBS洗涤1次，加入预冷的体积分数70%乙醇1 mL混匀后置于4 ℃冰箱中。

1.4.4 免疫荧光染色分析细胞表面标记物取第2代细胞，以1 mL PBS洗涤2次，重悬于加有体积分数10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM中，研磨并通过40 mm过滤器以获得单细胞悬浮液，分成5个等份(1×10⁵个细胞)并重悬在含体积分数10%PBS的小鼠血清，在12 mm× 75 mm聚苯乙烯流动管中冰育10 min；将表面标记物 (1∶200)的一级抗体(按如下流程)加入管中，每支试管加入一种一级抗体。结蛋白染色：加入兔抗鼠结蛋白抗体在含体积分数5%优质马血清中孵育室温下，在PBS洗涤3次， 5 min后，加入抗小鼠的Cy3结合IgG在室温下孵育1 h；波形蛋白染色：加入饱和浓度的Cy3结合的波形蛋白抗体、在室温孵育45 min，PBS冲洗并用DAPI溶液(在PBS中 1∶1 000)温育10 min；v-WF、a-SMA染色：分别加入纯化的兔抗vWF和兔抗a-SMA 30min，然后加入FITC结合的山羊抗兔IgG，再放置冰上30 min；CD34染色：加入FITC结合的小鼠抗CD34，室温孵育30 min。加入7-氨基放线菌素D，去除死细胞。然后将切片在DAPI中温育10 min，在荧光显微镜下检查并采集图像。

1.4.5 筋膜源性细胞与大鼠L6成肌细胞混合培养分析大鼠L6成肌细胞细胞系(CRL 1458; ATCC)在加有体积分数10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM的T-75烧瓶中生长以防止分化或肌管形成。将筋膜源性细胞和大鼠L6成肌细胞混合并离心以制备具有不同比例的细胞团(筋膜源性细胞与L6细胞混合比例为：1∶0，4∶1，1∶1，1∶4，0∶1)，每个细胞团具有相同的总数的细胞(2.5×10⁵)，将5组细胞团在含有骨形态发生蛋白4和转化生长因子β3的软骨形成培养基中培养14 d。将细胞团包埋在石蜡中切片，并用阿尔新蓝和番红O染色。

1.5 主要观察指标 ①筋膜源性细胞阿尔新蓝，苏木精-伊红染色和番红O染色；②筋膜源性细胞上各种不同细胞标志物的免疫染色结果；③筋膜源性细胞与L6大鼠成肌细胞混合培养的染色结果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

目前，利用组织工程技术来修复骨与关节软骨损伤的研究发展很快，其中骨髓基质干细胞和脂肪干细胞是研究的热点^[20-22]。有文献报道了骨髓基质细胞、从骨膜分离的细胞和脂肪干细胞均可在体外培养实验中见到软骨组织的形成，但是其种子细胞在取材和细胞纯化方面较为复杂，这为大规模的实验研究带来了巨大的挑战^[23-24]。骨骼肌来源的间充质干细胞作为成软骨的种子细胞在骨关节领域的组织工程中已经被广泛运用^[25]。有实验表明骨骼肌干细胞在体内和体外都具有向成骨细胞和成软骨细胞分化的能力，但是在此过程中向成骨细胞和成软骨细胞分化的细胞是否来源于同一类干细胞尚无定论^[26]。因此，在当前研究中，证明了从骨骼肌筋膜分离的非肌源性细胞筋膜源性细胞在用含骨形态发生蛋白4和转化生长因子β3的软骨细胞培养基刺激后具有软骨形成潜能。并且这些筋膜源性细胞不同于以前的研究从骨骼肌中分离出来的既可以发生成骨也可以成软骨的成肌干细胞^[27]。筋膜源性细胞是主要位于肌肉外筋膜和肌肉内(可能是肌内膜和肌束膜)筋膜，筋膜源性细胞可以很容易地从筋膜中分离出来并在体外扩增，其潜在的软骨修复能力可使之成为一种优良的软骨种子细胞来源，来满足科研需求及临床应用^[28]。

骨骼肌构成一个复杂的器官系统，其中包含许多组织结构，如肌纤维，血管，神经和筋膜等其他组织^[29-30]。为了消除肌纤维和卫星细胞在体外软骨形成过程中的干扰，使用容易获得的骨骼肌筋膜进行研究，并在含有骨形态发生蛋白4和转化生长因子β3的软骨形成培养基中培养，由于筋膜组织块经培养后可见软骨组织形成，推测在筋膜内存在具有体外成软骨分化能力的细胞。在当前实验，作者发现，在含有骨形态发生蛋白4和转化生长因子β3的成软骨培养基中培养的筋膜源性细胞，在阿尔新蓝和番红O染色后可见典型的软骨细胞形成，这也证实了这一假设。研究表明，在骨骼肌筋膜内发现的细胞也具有成软骨分化能力。

筋膜源性细胞在骨形态发生蛋白4和转化生长因子β3处理后可表现出成软骨分化的潜能，分析筋膜源性细胞细胞表面标志物的特性与其细胞亚群的成软骨能力具有潜在的相关性。实验发现，几乎所有的筋膜源性细胞均表达波形蛋白，而几乎不表达结蛋白、CD34，v-WF和α平滑肌肌动蛋白，这些细胞表面标志物的构成支持这些细胞的成纤维细胞特性，而且具有成软骨分化的潜能。

骨骼肌肌束膜和肌内膜是分别分离骨骼肌束和纤维的结缔组织的鞘，具有与筋膜相似的组织学结构和功能，仅仅具有不同的肌肉结构尺。有文献报道肌源性细胞具有潜在的成肌分化能力和成软骨分化能力^[31]。因此实验进一步假设骨骼肌内的非肌源性细胞，可能具有成软骨分化的潜力，如肌内膜和肌束膜细胞等。然而，由于其解剖结构的复杂性，很难将这些组织从骨骼肌中分离出来。为了明确肌内膜和肌束膜来源的细胞是否在肌源性细胞介导的软骨分化中发挥作用，因此，研究将筋膜源性细胞和L6成肌细胞以不同的比例混合之后，在骨形态发生蛋白4和转化生长因子β3的诱导培养之后染色，进行成软骨分化分析。实验结果表明，L6成肌细胞对整体成软骨分化具有负性影响，而筋膜源性细胞是成软骨分化的主要细胞。这也证实了筋膜源性细胞(如肌外膜、肌内膜和肌束膜细胞)是成软骨分化过程中所必需的细胞群。

研究证明了骨骼肌中筋膜源性细胞分化成软骨细胞的能力，但该技术尚也存在也多的问题，诸如，该技术尚缺乏基因和蛋白水平的证据来证明其成软骨分化的能力，同时，实验的研究对象还局限于动物模型，运用临床的的差距还较大，需要更多研究者的进一步探索。

总之，骨骼肌筋膜组织中可能含有具有向软骨细胞分化的细胞群，此类细胞群位于骨骼肌肉外筋膜和骨骼肌肉内(可能是肌内膜和肌束膜)，是表达波形蛋白且具有成纤维细胞样特性的独特细胞群体，其成软骨能力优于骨骼肌中的肌源性细胞群体。此外，因筋膜源性细胞取材更为方便、体外增殖能力强于肌源性细胞、软骨细胞表型更为稳定等特点，将其从肌肉分离出来并在体外扩增可以作为软骨修复应用的替代细胞来源，在组织工程中软骨修复方面具有很大的应用前景，同时还可能为临床中治疗骨性关节炎患者疾病提供了新的替代方案。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

骨骼肌中筋膜源性细胞分化为软骨细胞的能力

Chondrogenic progenitor cells isolated from the fascia of skeletal muscle

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