带部分松质骨小牛皮质骨复合骨髓间充质干细胞植入兔体内成骨及骨形态发生蛋白2的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.17.010

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (17): 2684-2689.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.17.010

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带部分松质骨小牛皮质骨复合骨髓间充质干细胞植入兔体内成骨及骨形态发生蛋白2的表达

陈能¹，邵云峰¹，刘傥²，张湘生²，熊光仲²

¹深圳市蛇口人民医院，广东省深圳市 518067；²中南大学湘雅二医院，湖南省长沙市 410011

修回日期:2017-03-15 出版日期:2017-06-18 发布日期:2017-06-29
作者简介:陈能，男，1975年生，广东省高州市人，汉族，1998年中山医科大学毕业，副主任医师，主要从事创伤骨科及关节外科研究。
基金资助:
湖南省科技计划项目(2013FJ6001)；深圳市科创委基金(20150305190447)

Osteogenesis and expression of bone morphogenetic protein 2 after bone marrow mesenchymal stem cells combined with calf cortical bone with partial cancellous bone implanted into rabbits

Chen Neng¹, Shao Yun-feng¹, Liu Tang², Zhang Xiang-sheng², Xiong Guang-zhong²

¹Shenzhen Shekou People’s Hospital, Shenzhen 518067, Guangdong Province, China; ²The Second Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410011, Hunan Province, China

Revised:2017-03-15 Online:2017-06-18 Published:2017-06-29
About author:Chen Neng, Associate chief physician, Shenzhen Shekou People’s Hospital, Shenzhen 518067, Guangdong Province, China
Supported by:
the Scientific Research Project of Hunan Province, No. 2013FJ6001; the Foundation of the Science and Technology Innovation Committee of Shenzhen, No. 20150305190447

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
骨形态发生蛋白：是一种存在于骨基质中的糖蛋白多肽，在生物体内的一项重要生物学作用是诱导未分化的间质细胞分化成为软骨和骨，它是唯一能够单独诱导骨组织形成的局部生长因子。骨形态发生蛋白各成员的诱导成骨能力不同，其中以骨形态发生蛋白2的成骨能力最强。
异种骨：作为一种生物组织，骨源丰富，目前异种松质骨应用较为多见，皮质骨因其难以降解，孔隙率低等原因限制了其使用。但皮质骨具有许多松质骨不具备的优越性，如生物力学方面，如何开发利用皮质骨是本课题研究的重点。

摘要
背景：前期研究已证实兔骨髓间充质干细胞在体外成骨诱导培养下可定向成骨分化，并能够稳定表达成骨细胞的特异性表型，具有成骨能力；且已证实带部分松质骨的小牛皮质骨支架材料具有良好的生物相容性和降解性，可以作为骨髓间充质干细胞的载体材料。
目的：在前期研究基础上，根据骨组织工程学的基本原理，将骨髓间充质干细胞与小牛异种骨复合，植入新西兰大白兔髂骨内观察其成骨情况，为构建理想的初步组织工程骨工程化产品提供理论依据。
方法：分别将兔骨髓间充质干细胞成骨诱导后复合的带部分松质骨小牛皮质骨(组织工程骨组)、单纯小牛异种骨(异种骨组)、自体髂骨(自体髂骨组)随机植入兔髂骨。观察各组植入物的表面变化和周围组织反应，植入后4，8，12，24周摄X射线片观察成骨情况，取材后利用免疫组织化学染色观察骨形态发生蛋白2的表达情况。
结果与结论：异种骨植入兔髂骨后，伤口生长良好，没有全身和局部的炎症和毒性反应。X射线片显示组织工程骨组在术后24周时与宿主骨结合部基本愈合，而异种骨组术后24周与宿主骨愈合不满意。苏木精-伊红染色可观察到软骨化骨过程，免疫组织化学染色显示各时间点骨形态发生蛋白2染色阳性。体内实验结果表明兔骨髓间充质干细胞复合带部分松质骨的小牛皮质骨支架材料经体外诱导后具有在新西兰兔体内构建组织工程骨的能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0002-5393-3520(陈能)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, 带部分松质骨的小牛皮质骨, 骨形态发生蛋白2

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have confirmed that rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) can differentiate into osteoblasts under osteogenic induction in vitro, stably express the specific phenotype of osteoblasts and have osteogenic ability. Calf cortical bone scaffold with partial cancellous bone has good biocompatibility and degradability, which can be used as a carrier material of bone marrow mesenchymal stem cells.
OBJECTIVE: To combine rabbit BMSCs with calf bone composite according to the basic principles of bone tissue engineering and to observe the osteogenesis in the New Zealand white rabbits after implantation of BMSCs/calf bone composite into the ilium, thereby providing a direct evidence for preliminary clinical application of tissue-engineered bone products.
METHODS: BMSCs/calf cortical bone scaffold with partial cancellous bone (tissue-engineered bone group), simple calf heterogeneous bone (heterogeneous bone group) or autologous iliac bone (autologous iliac bone group) was randomly implanted into the rabbit ilium. The changes of implant surface and tissue reactions around the implant were observed. X-ray examination was performed to observe osteogenic changes at 4, 8, 12, 24 weeks after implantation. Immunohistochemistry staining was used to observe the expression of bone morphogenetic protein 2.
RESULTS AND CONCLUSION: After heterogeneous bone implantation, the wound healed well, and there were no systemic or local inflammation and toxicity reactions in all groups. The X-ray results showed that at postoperative 24 weeks, the implant was basically fused with the host bone in the tissue-engineered bone group, but the fusion was unsatisfactory in the heterogeneous bone group. The process of ossifications from cartilages was observed in all groups by hematoxylin-eosin staining, and bone morphogenetic protein 2 was positive for immunohistochemical staining. Findings from in vivo experiments indicate that rabbit BMSCs seeded onto the calf cortical bone scaffold with partial cancellous bone could construct tissue-engineered bone by osteoinductation in vitro in the rabbits.

Key words: Stem Cells, Bone Morphogenetic Proteins, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

陈能，邵云峰，刘傥，张湘生，熊光仲. 带部分松质骨小牛皮质骨复合骨髓间充质干细胞植入兔体内成骨及骨形态发生蛋白2的表达[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(17): 2684-2689.

Chen Neng, Shao Yun-feng, Liu Tang, Zhang Xiang-sheng, Xiong Guang-zhong. Osteogenesis and expression of bone morphogenetic protein 2 after bone marrow mesenchymal stem cells combined with calf cortical bone with partial cancellous bone implanted into rabbits[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(17): 2684-2689.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析 60只新西兰大白兔无脱落，全部进入结果分析。各组材料复合体植入兔髂骨后，伤口生长良好，没有全身和局部的炎症和毒性反应，伤口一期愈合。植入材料均未见明显炎症和排斥反应。

2.2 术后X射线片观察 于术后4，8，12，24周行X射线片检查，观察各组成骨情况。发现未复合骨髓间充质干细胞的异种骨组植入后与宿主骨愈合能力较组织工程骨组差，但组织工程骨与宿主骨的愈合能力差于自体髂骨移植，见图1。

2.3 苏木精-伊红染色结果 于术后4，8，12，24周处死动物，取材石蜡块包埋，切片行苏木精-伊红染色，行组织学观察。

(1)组织工程骨组：术后4周，可见组织工程骨周围有大量软组织紧密粘贴，与宿主骨结合处，形成骨痂。组织工程骨载体内部及边缘可见大量的间充质细胞、成纤维细胞和软骨细胞，表面有较多骨吸收陷窝，内有破骨细胞活动。骨痂内仍可见肥大、固缩、空白陷窝明显的发生退行性变的软骨细胞，以及不同发育阶段的软骨细胞，表现为软骨化骨的过程(图2A)；术后8周，组织工程骨周围及与宿主骨结合处骨痂比较成熟，可见编织骨，成熟骨小梁；术后12周，在组织工程骨周围及与宿主骨结合处有大量的骨痂包围，可见类骨组织、编织骨等。异种骨的内外表面有多量的陷窝，内含有骨细胞、破骨细胞等。横截面可见多量的扩大的哈佛氏管，其中参与成骨的细胞排列成“镶边状”，毛细血管增多、变粗；术后24周，在组织工程骨和宿主骨连接处可见大量的骨小梁形成，内外表面吸收陷窝继续增加，皮质骨内可见扩大的哈佛氏管继续增加，成骨及破骨活动更加活跃，有些部位见新形成板状骨和一些未吸收完全的异种骨。

(2)异种骨：术后4周，异种骨表面可见少量的软组织贴附，且不够紧密，载体边缘可见成纤维细胞、少量软骨细胞，载体内偶尔可见新生的毛细血管；术后8周，异种骨的表面见少量的骨吸收馅窝，皮质骨内部哈佛管无明显变化；术后12周，可见较多软骨细胞，未见类骨组织、编织骨，见新生毛细血管(图2B)；术后24周，皮质骨内部结构变化不明显，类编织骨出现，新生骨尚不成熟。

(3)自体髂骨组：术后4，8周与组织工程骨组类似；术后12周，移植自体髂骨与宿主骨基本愈合；术后24周，移植自体髂骨与宿主骨完全融合。

2.4 BMP-2免疫组化结果 于术后4，8，12，24周处死动物，取材石蜡块包埋，切片行BMP-2免疫组化。

(1)组织工程骨组：术后4周，组织工程骨-宿主骨结合处骨细胞强阳性表达。皮质骨扩大的哈佛氏管呈弱阳性表达，异种骨表面的骨吸收陷窝内阳性表达清晰，骨基质呈弱阳性表达；术后8周，异种骨周围及与宿主骨结合处骨痂内骨细胞阳性表达(图3A)；术后12周，组织工程骨的外周可见较强的BMP-2阳性表达，皮质骨内扩大的哈佛氏管内细胞成分增多，围绕内壁的细胞呈阳性表达，同时，哈佛氏管周围数个骨陷窝内的骨细胞阳性表达；术后24周，组织工程骨周边成熟的骨单位和正在发育中的骨单位BMP-2染色均呈阳性；周围骨细胞陷窝也呈阳性表达。

(2)异种组：各时间段均可观察到BMP-2阳性表达，但阳性表达明显较组织工程骨组弱(图3B)。

(3)自体髂骨组：术后4，8周与组织工程骨组类似，但阳性表达明显较组织工程骨组强；术后12周，移植自体髂骨与宿主骨基本愈合；术后24周，移植自体髂骨与宿主骨完全融合。

结果显示：BMP-2阳性表达存在于成骨细胞胞浆和及其分泌的类骨质中，异种骨本身、成熟软骨细胞、成熟骨小梁基质中未见BMP-2阳性表达。移植的异种骨哈佛氏管内新生的骨组织及其周围的类骨质BMP-2表达呈阳性。

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引言

近年来组织工程学的迅速发展使得利用其原理和方法再生组织或器官的特点和优势得到广泛认同。作为组织工程研究的重要领域，骨组织工程研究在多方面均取得了令人振奋的研究成果，并已在临床得到初步应用，被认为是组织工程中最具有前途和可行性的领域之一。骨组织工程的研究主要包括种子细胞的来源，支架材料，组织工程骨的构建三部分^[1-5]。在组织工程研究中，支架是种子细胞的温床，是工程化组织的骨架。组织工程支架材料是指能与组织活体细胞结合并能植入生物体的材料，它是构建组织工程的最基本构架。

团队前期研究已证实兔骨髓间充质干细胞在体外成骨诱导培养下可定向成骨分化，并能够稳定表达成骨细胞的特异性表型，具有成骨能力^[4]；且已证实带部分松质骨的小牛皮质骨支架材料具有良好的生物相容性和降解性，可作为骨髓间充质干细胞的载体材料^[5]。

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是一种存在于骨基质中的糖蛋白多肽，在生物体内的一项重要生物学作用是诱导未分化的间质细胞分化成为软骨和骨，它是唯一能够单独诱导骨组织形成的局部生长因子。BMP各成员的诱导成骨能力不同，其中以BMP-2的成骨能力最强，因此目前被广泛研究^[6-11]。BMP-2有促进成骨细胞分化和诱导体外成骨的能力，同时具有使成骨细胞的前体细胞定向分化为成骨细胞的能力^[12-17]。

本实验以新西兰大白兔作为研究对象，将骨髓间充质干细胞复合带部分松质骨的小牛皮质骨支架体外定向成骨诱导后植入新西兰大白兔髂骨，观察BMP-2表达，进一步研究是明确其在体内是否能稳定良好的表达成骨特征，以便为以后最终的组织工程骨奠定实验基础。

材料方法

1.1 设计 随机对照分组，动物体内植入实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年4月至2016年8月在中南大学湘雅二医院动物实验室与中心实验室完成。

1.3 材料

实验动物：健康3月龄新西兰大白兔60只，雌雄不限，体质量为1.5-2.0 kg，用于不同材料植入髂骨兔模型的制备；健康1月龄新西兰大白兔3只，雌雄不限，体质量0.7 kg左右，用于分离培养骨髓间充质干细胞。所有实验用新西兰大白兔由中南大学湘雅二医院实验动物部提供。

异种骨来源：带部分松质骨的小牛皮质骨取自1岁左右的小牛骨，是参照以往文献^[5]，由湖南株洲天健科技开发有限公司制备提供，松质骨和皮质骨体积比为1︰1，骨板制成长方体形，大小为9 mm×7 mm×2 mm。

实验用主要试剂及仪器：DMEM低糖培养基(Gibico，American)，Percoll分离液(天津颧洋公司)，胎牛血清(Gibico，American)，PBS(北京中杉金桥公司)，BMP-2兔抗兔单克隆抗体(武汉博士德公司)，恒温二氧化碳培养箱(ThermoForma公司，American)，倒置相差显微镜(Olimpus，Japan)。

1.4 实验方法

1.4.1 兔骨髓间充质干细胞的分离培养 按作者前期研究方法分离培养兔骨髓间充质干细胞^[18]，具体方法如下：空气栓塞法处死1月龄新西兰大白兔，用体积分数75%乙醇浸泡20-30 min消毒，取兔的股骨和胫骨并去除软组织及骨骺端，用5 mL D-Hanks液将骨髓冲出，制成单细胞悬液，将装有单细胞悬液的无菌离心管在25 ℃条件下离心10 min (1 000 r/min)，离心后弃上清，再加5 mL D-Hanks液，吹打制成单细胞悬液。取另一个装有5 mL单核细胞分离液的离心管，用毛细吸管将5 mL单细胞悬液沿管壁缓慢注入到单核细胞分离液上面，离心分离细胞(2 000 r/min，20 min)；用毛细吸管吸取中层云雾状白色物质至另一离心管，D-Hanks液冲洗悬浮细胞，离心(1 000 r/min，10 min)，离心后弃上清，留约1 mL，制成单细胞悬液，加入8 mL D-Hanks液，充分混匀细胞，离心(1 000 r/min，10 min)，离心后弃上清，再加入5 mL 含血清的培养基，吹打混匀细胞，将细胞种植到培养瓶，置于37 ℃，含体积分数5%CO₂饱和湿度的培养箱中培养，每隔1 d换培养基，弃去未贴壁细胞，贴壁细胞融合达90%进行细胞传代。

1.4.2 兔骨髓间充质干细胞与异种骨的复合及成骨诱导 收集第3代兔骨髓间充质干细胞，调整细胞悬液浓度为3.0×10⁹ L^-¹，应用微量移液器将细胞悬液接种在异种骨的松质骨面，每块异种骨支架滴加50 μL细胞悬液，随后放置于37 ℃，体积分数5%CO₂、饱和湿度的培养箱中孵育4 h以利于细胞在支架上的进一步黏附，小心加入含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基，1 d后更换为成骨诱导培养基进行成骨诱导。1周后备用^[4-5]。

1.4.3 动物体内实验 将60只3月龄新西兰大白兔随机分为3组，每组20只。所有兔用3%戊巴比妥钠1 mg/kg静脉麻醉。沿髂棘下缘做一弧形切口，逐层切开皮肤，分离皮下组织，暴露臀肌；沿髂棘缘肌肉附着处切开肌肉，予以剥离，暴露髂骨翼，于左、右髂骨做同样处理，然后3组植入制备好的不同材料：①组织工程骨组：植入异种骨复合成骨诱导后兔骨髓间充质干细胞的复合体；②异种骨组：植入单纯异种骨；③自体髂骨组：植入自体髂骨。各组材料植入完毕后，分层严密缝合肌肉、皮下组织和皮肤。术后予以青霉素80×10⁴ U肌注3 d预防感染。

1.5 主要观察指标

1.5.1 术后X射线片观察成骨情况 术后4，8，12，24周行X射线片检查，观察X射线片变化情况。

1.5.2 苏木精-伊红染色组织学观察 分别于术后4，8，12，24周每组取5只大白兔，处死后取材，送中南大学湘雅二医院病理科行石蜡包埋切片。切片脱蜡水化后，于Weigert氏苏木素浸染5 min；流水冲洗，1%盐酸乙醇分化30 s；流水冲洗，浸于伊红染液2 min；流水冲，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封固，光学显微镜下观察。

1.5.3 免疫组织化学检测骨形态发生蛋白2表达 分别于术后4，8，12，24周取材，送中南大学湘雅二医院病理科行石蜡包埋切片后行免疫组织化学染色，观察BMP-2的表达情况。

1.6 统计学分析 本文结果中X射线片观察、苏木精-伊红染色组织学观察及形态发生蛋白2免疫组织化学检测均为语言描述做定性分析。

讨论

组织工程中，理想的支架材料应具备：①良好的生物相容性、生物可降解性；②良好的骨诱导性和骨传导性；③具有负荷最大量的细胞的高渗透性；④支持细胞生长和功能分化的表面化学性质与微结构；⑤可与其他活性分子如骨形态发生蛋白、成纤维转化因子等复合共同诱导骨的发生^[19-26]。

异种骨作为一种生物组织，骨源丰富，目前异种松质骨应用较为多见，皮质骨因其难以降解，孔隙率低等原因限制了其使用。但皮质骨具有许多松质骨不具备的优越性，如生物力学方面，如何开发利用皮质骨是本课题研究的重点。国内的李莹等^[27]用深低温冷冻皮质骨板移植在兔体内提示:异种皮质骨板主要靠宿主骨痂包绕其边缘而愈合，异种骨板与宿主相接内侧被替代，具有新骨生长。汤亭亭等^[28]用家兔做实验探讨不同力学环境下同种皮质骨移植生物力学性能的变化呈较快下降再缓慢上升，生理载荷的刺激有利于同种异体皮质骨的生物力学的恢复和改善。本实验采用带部分松质骨的小牛皮质骨作为支架材料，经过脱脂、脱蛋白处理，然后在松质骨面复合骨髓间充质干细胞，取得了实验成功。

从组织学观察发现组织工程骨及异种骨组术后4周开始，随着移植骨表面和宿主骨-移植骨结合部分产生骨基质和骨化，移植骨逐渐被吸收，吸收后的空隙由新生骨填充取代，表明异种骨能植入兔体内成骨。材料被逐渐吸收证明，异种骨植入兔体内后需通过“爬行替代”的方式先吸收植入骨，然后在吸收的空腔内形成新骨的方式成骨，因而往往从植入骨与宿主骨的桥接部位开始成骨。我们观察还发现，组织工程骨组术后４周表面和孔隙中出现大量不同阶段软骨细胞形成，异种骨组仅骨表面有少量软骨细胞。术后第8，12，24周实验材料表面和孔隙发现有骨样组织、编织骨和板层骨形成，而异种骨仅在材料与宿主骨的桥接部形成骨样组织和新生骨，说明单纯异种骨移植材料在兔体内是通过“爬行替代”的方式成骨，而复合骨髓间充质干细胞的异种骨植入兔体内后，不仅桥接部有成骨，而且移植骨中部表面及孔隙内也有新骨形成，可能的解释是：①骨髓间充质干细胞在一定结构诱导下转化为软骨细胞，开始软骨成骨；②骨髓间充质干细胞植入体内后分化为成骨细胞，并分泌基质和成骨性因子，形成新骨。这种成骨方式因为多个位点同时成骨，成骨细胞丰富，因而比“爬行替代”的方式成骨更为迅速。

骨诱导作用在异种骨愈合中发挥多大作用尚有一些争论。Urist^[29]在对未经脱钙的同种异体骨移植入动物骨骼肌内很难观察到骨诱导现象，认为钙盐与基质蛋白的紧密结合，抑制了BMP的释放有关，也可能是与未脱钙骨中存在着某种BMP抑制因子。尽管移植骨自身无BMP表达，但不能否定骨诱导在移植骨中发挥作用。本实验BMP阳性表达在异种骨愈合的全过程均可看到，其阳性表达与新骨形成一致，主要表达在不成熟的骨细胞、成骨细胞、软骨细胞的胞浆及其分泌的基质中，特别是在一些由骨吸收陷窝新形成的管状结构中，而且在植入后8周时表达最强，这可能因为术后8周为成骨最为活跃有关。由此可知，骨形态发生蛋白在异种骨移植愈合的早期发挥重要作用，当早期的编织骨被成熟的板层骨代替后，骨形态发生蛋白的表达便显著下降。从组织学可观察到，异种骨愈合的过程是异种骨周围血管、间质组织不断向异种骨中央生长而异种骨不断被吸收、骨形成的过程，其骨形态发生蛋白表达阳性，说明在骨吸收的同时有诱导成骨同时进行。从BMP-2表达的细胞分布、表达时间可见，内源性BMP-2通过诱导间充质细胞等分化为软骨、骨细胞而产生新骨，新骨中的成骨细胞又可分泌BMP-2，形成良性循环。由此可见，大段移植骨愈合过程，主要是依靠骨传导，其次才是骨诱导，且由新生骨产生BMP发挥诱导作用，并非为异种骨段本身。因此，在异种骨移植中，在其表面复合BMP和采取正确方法制备异体骨，均有利于发挥BMP的诱导作用，促进移植骨修复。

结论：兔骨髓间充质干细胞复合带部分松质骨的小牛皮质骨支架材料经体外诱导后具有在新西兰兔体内构建组织工程骨的能力，因而认为带部分松质骨的小牛皮质骨支架材料是一种理想的骨组织工程支架材料，在组织相容性、力学性能及成骨效果等方面均令人满意。

带部分松质骨小牛皮质骨复合骨髓间充质干细胞植入兔体内成骨及骨形态发生蛋白2的表达

Osteogenesis and expression of bone morphogenetic protein 2 after bone marrow mesenchymal stem cells combined with calf cortical bone with partial cancellous bone implanted into rabbits

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