浓缩生长因子纤维蛋白与富血小板纤维蛋白体外降解的对比

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.14.017

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
浓缩生长因子纤维蛋白：是第3阶段血浆提取物，可以使生长因子聚集，与富血小板纤维蛋白相比，纤维蛋白更大、更密集，所包含的量也更多。由于浓缩生长因子纤维蛋白的特殊结构，使得其具有极强的可复制性，因此在一定程度上可以代替引导骨再生术中的隔膜。
富血小板纤维蛋白：主要结构是由纤维蛋白形成的疏松多孔的网状结构，血小板聚集被纤维蛋白紧紧包裹。在纤维蛋白纤溶过程中，再次激活聚集的血小板，持续释放生长因子，以利于骨组织和软组织的愈合。因此，对于富血小板纤维蛋白的生物学功能的发挥，其纤维蛋白基质起到了决定性作用。

背景：在引导骨再生手术临床应用中，生物材料的降解时间至关重要，目前国内外学者仅对浓缩生长因子纤维蛋白部分生物学特性及临床应用效果进行了初步探讨，有关其降解特性的研究尚未见报道。
目的：应用人工唾液对浓缩生长因子纤维蛋白和富血小板纤维蛋白进行降解，探讨浓缩生长因子纤维蛋白和富血小板纤维蛋白在人工唾液中的降解特性，比较两种生物制品的降解速度。
方法：选取10名志愿者各取静脉血18 mL，放入2个真空采血器中，分别置于 Medifuge离心加速机的转筒中，按照制备程序，依次制备出浓缩生长因子纤维蛋白和富血小板纤维蛋白标本各1份。分别将2种标本制备成块状和膜状，经过处理后，浸泡在人工唾液中，37 ℃恒温定时测量2种块状标本的质量和膜状标本的面积，记录浓缩生长因子纤维蛋白和富血小板纤维蛋白的降解过程。绘制降解曲线图，比较浓缩生长因子纤维蛋白和富血小板纤维蛋白标本的降解速度。
结果与结论：①实验开始后，浓缩生长因子纤维蛋白与富血小板纤维蛋白在实验第5天标本块的质量差异无显著性意义(P > 0.05)，第3，4，6天浓缩生长因子纤维蛋白块状标本的剩余质量显著大于富血小板纤维蛋白(P < 0.05)；②实验第1-6天，浓缩生长因子纤维蛋白膜状标本的剩余面积显著大于富血小板纤维蛋白(P < 0.05)；③综上，在人工唾液中，浓缩生长因子纤维蛋白块状标本和膜状标本的降解速度均较富血小板纤维蛋白慢；对于同样以纤维蛋白为框架的浓缩生长因子纤维蛋白和富血小板纤维蛋白，纤维蛋白含量越高，降解速度越慢，浓缩生长因子纤维蛋白降解速度较富血小板纤维蛋白降解速度慢，表明其纤维蛋白含量高，所能发挥的生物再造功能更强。

ORCID: 0000-0001-5035-1181(李永斌)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 浓缩生长因子, 富血小板纤维蛋白, 人工唾液, 组织再生, 降解

Abstract:

BACKGROUND: The degradation speed of biological materials is critical for the clinical use of guided bone regeneration. The partial biological characteristics and treatment efficacy of concentrate growth factor (CGF) fibrin have been explored preliminarily, but its degradation properties have not yet been reported.
OBJECTIVE: To explore the degradation properties of CGF fibrin and platelet-rich fibrin (PRF) in artificial saliva and compare the degradation speed of these two biological products.
METHODS: Ten volunteers were selected, and 18 mL of venous blood from each volunteer was extracted and stored in two vacuum blood collectors. The blood samples were then placed into the drum of the Medifuge centrifugal acceleration machine, to separate CGF fibrin and PRF specimens following the preparation process, respectively. Both CGF fibrin and PRF specimens were respectively made into bulk and membranoid, and were then immersed in artificial saliva under 37 ℃. The mass of the bulk specimens and area of the membranoid specimens were measured regularly, and the degradation processes of CGF and PRF were recorded. The degradation curves were drawn to compare the degradation speed of CGF fibrin and PRF.
RESULTS AND CONCLUSION: The mass of CGF fibrin and PRF showed no significant difference at the 5th day (P > 0.05), while the mass of CGF fibrin was higher than that of PRF at the 3rd, 4th and 6th days (P < 0.05). The residual area of CRF was significantly larger than that of PRF at posttreatment 1-6 days (P < 0.05). To conclude, the degradation speed of bulk or membranoid CRF is slow than that of PRF in artificial saliva. The higher the fibrin content is, the slower the degradation ability is, indicating the strong bioreproductive function.

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Key words: Saliva, Artificial, Guided Tissue Regeneration, Blood Palates, Fibrin, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 4

2.1 浓缩生长因子纤维蛋白和富血小板纤维蛋白块状标本质量比较见表2及图2。重复测量方差分析组内比较结果显示：随着时间的变化，组1与组3中标本块的质量都发生了明显的变化(F=1 430.816，P < 0.05)。组间比较结果显示，浓缩生长因子纤维蛋白与富血小板纤维蛋白标本块在相同时间点剩余质量差异有显著性意义(F=6.41，P < 0.05)。

组内进一步方差分析比较结果显示：浓缩生长因子纤维蛋白质量在实验前7 d，除第3天与第2天相比表现为平缓下降，其余时间点均表现为显著下降(P < 0.05)；从第8天开始，浓缩生长因子纤维蛋白质量残余量很少，同时维持不变(P > 0.05)；第10天浓缩生长因子纤维蛋白完全降解。富血小板纤维蛋白质量在实验前6 d随实验周期的推移表现显著下降(P < 0.05)，第7天时保持与第6天持平，第8天降解完全。

组间进一步t 检验比较结果显示：组1与组3中标本块的初始质量差异无显著性意义(P > 0.05)；实验开始后，浓缩生长因子纤维蛋白与富血小板纤维蛋白在实验第5天标本块的质量差异无显著性意义(P > 0.05)，其余时间点两者质量均表现为差异有显著性意义(P < 0.05)。

实验标本种类与实验周期之间存在交互作用(F=36.071，P <0.05)。

2.2 浓缩生长因子纤维蛋白和富血小板纤维蛋白膜状标本面积比较见表3及图3。

膜状标本重复测量方差分析组内比较结果显示：随着时间的变化，组2与组4中膜状标本的面积都发生了明显的变化(F=9 750.945，P < 0.05)。组间比较结果显示，浓缩生长因子纤维蛋白与富血小板纤维蛋白膜状标本在相同时间点剩余面积差异有显著性意义(F=3 369.460， P < 0.05)。

组内进一步方差分析比较结果显示：浓缩生长因子纤维蛋白膜状标本面积在实验前6 d表现为显著下降(P < 0.05)；实验第7天，浓缩生长因子纤维蛋白完全降解。富血小板纤维蛋白膜状标本面积在实验前4 d随实验周期的推移表现为显著下降(P < 0.05)，第5天时降解完全。

组间进一步t 检验比较结果显示：组2与组4中膜状标本的初始面积差异无显著性意义(P > 0.05)；实验开始后，浓缩生长因子纤维蛋白与富血小板纤维蛋白膜状标本剩余面积表现为差异有显著性意义(P < 0.05)。

实验膜状标本种类与实验周期之间存在交互作用(F=446.457，P < 0.05)。

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引言

对于人体组织的重建一直是医学领域的热点课题，在口腔领域，随着引导骨再生(guided bone regeneration)技术的引入^[1]，应用于骨再生技术的材料和生长因子的研究越来越受到关注^[2-4]。引导骨再生技术的开展与各种骨替代材料的应用密不可分，这些材料的主要作用是生物刺激或诱导成骨。事实上，对于组织重建，希望得到的是可以免费获取、循环使用的自体材料^[5]。因此，有关生长因子的研究愈来愈受到关注^[6-8]，其中血浆提取物在临床组织再造中已经被广泛应用^[9-11]。

血浆提取物的研究到目前为止，已经大致经历了富血小板血浆^[12]、富血小板纤维蛋白^[13]、集中生长因子3个阶段^[14]。作为第3阶段血浆提取物，浓缩生长因子纤维蛋白可以使生长因子聚集，并且不需要另外加入牛凝血酶或任何抗凝剂。另外，与富血小板纤维蛋白的析出过程相比，在所获得的血液样本中生长因子的成分有所改变。因为制取浓缩生长因子纤维蛋白的离心加速器设定为从2 400-2 700 r/min的速度，导致纤维蛋白比普通的富血小板纤维蛋白更大、更密集，所包含的量也更多^[15]。

作为自体移植材料，浓缩生长因子纤维蛋白具有促进组织生长和愈合能力，有利于所有再生组织的恢复。由于浓缩生长因子纤维蛋白的特殊结构，使得其具有极强的可复制性，因此在一定程度上可以代替引导骨再生术中的隔膜，但浓缩生长因子纤维蛋白在组织中的吸收时间以及隔离软组织向骨缺损区内部生长的时间和确切机制尚不明确。

在引导骨再生手术临床应用中，生物材料的降解时间至关重要，目前国内外仅对浓缩生长因子纤维蛋白部分生物学特性及临床应用效果进行了初步探讨^[16-18]，有关其降解特性的研究尚未见报道。实验是通过和富血小板纤维蛋白作对照研究，以了解浓缩生长因子纤维蛋白的体外降解特性，使用人工唾液模拟口腔环境，观察比较浓缩生长因子纤维蛋白和富血小板纤维蛋白的降解速度，从而进一步加深对浓缩生长因子纤维蛋白生物学特性的认识，评价其临床应用价值。

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材料方法

1.1 设计对比观察实验。

1.2 时间及地点于2012年9月至2013年3月在北京通州新华医院口腔科完成。

1.3 对象本实验选择10名志愿者，告知本实验的目的意义，经本人同意和伦理委员会审核。每名志愿者抽取静脉血18 mL分别进行浓缩生长因子纤维蛋白和富血小板纤维蛋白标本的制取。

本实验所选取的志愿者年龄分布为25-65岁，基本涵盖了可以实施引导骨再生手术的年龄阶层。具体分布为25-35岁4名，男2名，女2名；35-50岁4名，男1名，女3名；50岁以上2名，男女各1名。

选择标准：符合种植手术要求，无吸烟史，血常规、出凝血时间等指标正常，无影响种植手术的其他系统疾病。对实验目的知情同意。

1.4 方法

1.4.1 实验标本制备方法首先每名志愿者采集18 mL静脉血，分别注入2个专用真空试管中，注满后勿摇动，以免引起溶血反应。

随机取其中一个试管立即放入Medifuge(Silfradent 意大利)离心加速机的转筒中，生理盐水配重。设定制备浓缩生长因子纤维蛋白程序，旋转12 min后，可见试管中分为3层(最上层为血清，中间纤维蛋白层，底层为红细胞及血小板，见图1A)^[15]。去掉血清，保留少许血浆层，制得浓缩生长因子纤维蛋白标本。

另一个静脉血试管立即放入另一台Medifuge离心加速机的转筒中，同样生理盐水配重。设定为富血小板纤维蛋白制取程序，匀速离心12 min后，试管中血液也分为3层(最上层位贫血小板血浆PPP，中间层淡黄色凝胶为富血小板纤维蛋白，底层为红细胞碎片，见图1B)^[19]。弃去贫血小板血浆，保留少许红细胞层，得到富血小板纤维蛋白标本。

得到10组浓缩生长因子纤维蛋白和富血小板纤维蛋白标本，用蒸馏水冲洗干净，每件浓缩生长因子纤维蛋白和富血小板纤维蛋白平均分成2份，随机选取每组中浓缩生长因子纤维蛋白和富血小板纤维蛋白各1份应用专用工具压成膜状，另外1份保持原状。

1.4.2 实验标本的体外降解研究

人工唾液配置：见表1。所用化学试剂均为国产分析纯试剂。按上述配方配制人工唾液，在125 ℃，0.15 MPa的条件下消毒20 min。

浓缩生长因子纤维蛋白和富血小板纤维蛋白标本的分组与测量：将每组标本中的浓缩生长因子纤维蛋白块状标本列为第1组(组1)，浓缩生长因子纤维蛋白膜状标本列为第2组(组2)；将每组标本中的富血小板纤维蛋白块状标本列为第3组(组3)，富血小板纤维蛋白膜状标本列为第4组(组4)。

将浓缩生长因子纤维蛋白和富血小板纤维蛋白标本用蒸馏水冲洗干净，无菌纱布吸干至恒重，块状标本用电子天平(精确度0.01 g)分别称质量3次，取平均值，记录初始质量；膜状标本测量3次表面积，取平均值，计录初始面积。

所有标本均用人工唾液浸泡于试剂瓶中，放入37 ℃恒温水浴箱中^[21]。每日将标本取出，蒸馏水冲洗，无菌纱布吸干至恒重，块状标本用电子天平称重3次，取平均值，记录剩余质量；同样处理，测量膜状标本记录膜的面积变化。

1.5 主要观察指标每天中午12点对标本进行测量。组1、组3干燥后，用电子天平称质量；组2、组4干燥后，测量表面积。

1.6 统计学分析所有数据结果均应用SPSS 18.0统计软件进行处理，组1与组3，组2与组4分别采用重复测量设计资料的方差分析，4组进一步组内比较采用方差分析，组间进一步比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

3.1 试剂的选择对于口腔环境的人工口外模拟装置称为人工口腔，包括细菌、牙体组织、温度、pH值和Eh值、唾液、食物、咀嚼运动等几方面的调节。本实验选择了与纤维蛋白降解相关的温度、pH值和唾液三方面，采用相同的条件，其作用是模拟口腔环境对标本的降解影响。温度定为37 ℃恒温，与口腔环境温度相近。pH值为6.8，接近口腔唾液环境。选取的唾液模拟物为人工唾液，是通过科学的方法严格依据人体代谢产物唾液的成份研制出来的一种人工合成检测试剂，是人为配制的一种溶液，其化学成分类似于人的唾液。人工唾液中水分占99.4%，固体物质占0.6%，还有少许二氧化碳。

3.2 富血小板纤维蛋白的生物学特性本实验富血小板纤维蛋白的制备采用的是2 700 r/min，定速离心12 min取得。有研究显示，富血小板纤维蛋白的主要结构是由纤维蛋白形成的疏松多孔的网状结构，血小板聚集被纤维蛋白紧紧包裹^[22]。在纤维蛋白纤溶过程中，再次激活聚集的血小板，持续释放生长因子，以利于骨组织和软组织的愈合。因此，对于富血小板纤维蛋白的生物学功能的发挥，其纤维蛋白基质起到了决定性作用。

对于富血小板纤维蛋白结构和生长因子的作用机制，有学者认为纤维蛋白的作用是诱导移植组织的血管化，支持免疫反应，影响组织愈合中上皮细胞和成纤维细胞的新陈代谢^[13]。

3.3 浓缩生长因子纤维蛋白的主要成分及生物学特性浓缩生长因子纤维蛋白是由高浓度的各类生长因子及纤维蛋白原所形成的纤维网状支架构成。浓缩生长因子纤维蛋白中生长因子的聚集，原理是在制备浓缩生长因子纤维蛋白过程中，采用特殊的变速离心使得血小板被激活，血小板α颗粒释放出各种生长因子，包括血小板衍生生长因子^[23-24]、转移生长因子β^[25-26]、类胰岛素生长因子^[27-28]、血管内皮生长因子^[29-30]、表皮生长因子以及骨形成蛋白等^[31-32]，其功能如下：①血小板衍生生长因子：血小板衍生生长因子是最早出现在伤口的生长因子，可促进结缔组织的修复和再生^[12]。血小板衍生生长因子主要具有丝裂原作用，促进细胞趋化、增殖，并且可增加胶原蛋白的合成能力^[33]；②转化生长因子β：有学者认为转化生长因子β是能支持长期组织愈合的骨再生因子。转化生长因子的主要功能是促进前体成骨细胞趋化和有丝分裂。促使伤口处胶原基质中的成骨细胞聚集。此外，转化生长因子可以抑制破骨细胞形成和骨吸收，使得骨形成大于骨吸收；③类胰岛素生长因子：类胰岛素生长因子对多种细胞具有促进有丝分裂的作用，可以抑制许多细胞在成熟之前的凋亡。它还参与皮肤、骨骼和神经系统的发育和分化^[34]；④骨形成蛋白：诸多因子中惟一能够单独诱导骨组织异位成骨^[35]。以骨形成蛋白2为中心，构成网络，诱导成骨分化，在新骨形成中重要作用^[36]。

浓缩生长因子纤维蛋白纤维蛋白原所形成的纤维网状支架可有效的滞纳血小板及各种循环分子(如细胞因子)。因为采用变速离心方式进行精准的分离处理，浓缩生长因子纤维蛋白能够获得三维聚合物网络式的蛋白结构，其纤维蛋白为富含弹性的有机纤维蛋白网格，柔软而纤薄。浓缩生长因子纤维蛋白的弹性和便于渗透的网状结构使得各种细胞、抗体和血小板易于聚集、增殖。

在口腔临床应用中，浓缩生长因子纤维蛋白的使用多应用于引导骨再生术中的填充材料，单独使用或与其他人工材料相混合，能够显著缩短成骨时间以及提高成骨程度^[37-38]。因其良好的抗剪切性和拉伸强度，也能作为引导骨再生手术的屏障膜使用。浓缩生长因子纤维蛋白作用的发挥有赖于其高浓度的各类生长因子及纤维蛋白原所形成的纤维网状支架。

3.4 纤维蛋白的降解综上所述，浓缩生长因子纤维蛋白和富血小板纤维蛋白的生物功能，与其纤维蛋白结构和含量密不可分，纤维蛋白降解速度越慢，其所释放的生长因子发挥生物再造功能的作用时间就越长，反之亦然^[39^-49^]。

纤维蛋白的降解来源于纤溶酶原的活化，纤溶酶和凝血酶一样，也是蛋白酶，但是它对纤维蛋白原的作用与凝血酶不同。凝血酶只是使纤维蛋白原从其中2对肽链的N-端各脱下一个小肽，使纤维蛋白原转变成纤维蛋白。纤溶酶却是水解肽链上各单位的赖氨酸-精氨酸键，从而逐步将整个纤维蛋白或纤维蛋白原分割成很多可溶的小肽，即纤维蛋白降解产物。

纤溶酶原的活化共有3种途径：内源活化途径(凝血接触活化系统)、外源活化途径(尿素酶型纤溶酶原活化物或组织型纤溶酶原活化物)和外生性活化途径(溶栓类药物或一些细菌蛋白)激活^[⁵⁰^]。

有研究显示，过早暴露于口腔中的生物膜，其降解速度加快，增加膜下新生组织感染概率^[⁵^1]。其原因是暴露于口腔中的膜表面定植了大量细菌，在成骨过程中，定植于屏障膜上的细菌产生特异性和非特异性的蛋白酶，而加速了以胶原为主的生物膜的降解速度。在本降解实验中，人工唾液经过严格消毒灭菌，防止了外生性活化途径对于纤溶酶原的激活。

3.5 浓缩生长因子纤维蛋白体外降解规律因为浓缩生长因子纤维蛋白在组织中的吸收时间以及隔离软组织向骨缺损区内部生长的时间和确切机制还尚不明确。有关口腔环境对于浓缩生长因子纤维蛋白作用的影响，国内外文献也无报道。本实验希望通过唾液等模拟口腔环境因素，对浓缩生长因子纤维蛋白和富血小板纤维蛋白降解进行对照分析，比较浓缩生长因子纤维蛋白和富血小板纤维蛋白的降解规律，加深对浓缩生长因子纤维蛋白降解规律的认识，以供临床参考。

本实验中浓缩生长因子纤维蛋白和富血小板纤维蛋白标本的降解主要表现为纤维蛋白的降解，可以看到比较明显的形态改变。浸泡于人工唾液中的浓缩生长因子纤维蛋白和富血小板纤维蛋白标本，从第2天开始呈现胶冻状改变(包括块状和膜状标本)，透明，形态保持性差，可见纤维蛋白含量降低。本实验中于第5天开始，富血小板纤维蛋白膜状标本逐步变为松解不成形，呈现为悬浊液形式，这种状态下标本已经不能测量面积，数据定位为已降解。反观浓缩生长因子纤维蛋白标本变化较慢，颜色渐呈白色，形态保持较好，仍能够保持一定的韧性，纤维蛋白降解慢。浓缩生长因子纤维蛋白和富血小板纤维蛋白降解是不可逆的趋势，无论是块状还是膜状标本，最后都能够完全降解。分析其原因是人工唾液为等渗盐溶液，基本没有缓冲能力，浓缩生长因子纤维蛋白和富血小板纤维蛋白降解解产物易局部蓄积，引起纤溶酶原的内源活化，产生纤维蛋白的加速降解。比较而言，膜状标本的降解周期短于块状标本，富血小板纤维蛋白膜最短时间为4 d，最长时间为6 d降解完成，其原因推测为，膜标本本身含有的液体量较少，容易吸纳浸泡溶液，因此与周围溶液的接触面积大，降解周期短于块状标本。

本实验为口外模拟实验，所应用的人工唾液并不能完全替代口腔的环境，因此所得数据有局限性。再有本实验只考虑了浓缩生长因子纤维蛋白和富血小板纤维蛋白的纤维蛋白含量的区别，没有更多生物学特性的组织再生的研究，并不能全面的比较浓缩生长因子纤维蛋白和富血小板纤维蛋白的生物诱导功能。今后的实验准备在动物的口腔中进行，所得结果将更加准确，能够为临床应用提供更为可靠的依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程