医用丝素蛋白皮肤再生膜的生物相容性评价

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.25.001

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
医用丝素蛋白皮肤再生膜：是一种由天然丝素蛋白(75%)和胶蛋白(25%)组成的高分子材料，主要用于不同程度损伤表面的覆盖，具有保护创面、诱导皮肤再生的作用。
生物相容性：指材料在机体的特定部位引起恰当的反应。生物相容性是指生命体组织对非活性材料产生反应的一种性能，一般是指材料与宿主之间的相容性。

摘要
背景：皮肤再生膜是与皮肤缺损表面接触的生物材料，必须考虑其对机体的毒性。
目的：综合评价丝素蛋白皮肤再生膜的生物相容性。
方法：①皮肤刺激实验：在新西兰大白兔皮肤缺损处分别敷贴医用丝素蛋白皮肤再生膜、涂抹甲醛、涂抹生理盐水，24，72 h后观察红斑和水肿情况。②急性全身毒性实验：通过小鼠尾静脉分别注射医用丝素蛋白皮肤再生膜材料浸提液、苯酚及生理盐水，注射后24，48，72 h，观察小鼠状态、毒性反应和死亡。③细胞毒性实验：分别以100%、50%、25%、10%浓度的材料医用丝素蛋白皮肤再生膜材料浸提液培养L-929细胞，培养后2，4，7 d，用紫外分光光度仪检测吸光度值；培养48 h，MTT法检测吸光度值。④以100%浓度的材料医用丝素蛋白皮肤再生膜材料浸提液培养L-929细胞，48 h后采用qPCR法检测细胞纤维连接蛋白mRNA表达。
结果与结论：丝素蛋白皮肤再生膜对皮肤缺损创面无不良反应，未对机体皮肤产生刺激，对机体无急性毒性作用，无细胞毒性，不影响体内细胞纤维连接蛋白的表达，具有较好的生物相容性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

ORCID: 0000-0002-1877-0383(徐保来)

关键词: 生物材料, 材料相容性, 医用丝素蛋白皮肤再生膜, 皮肤组织工程, 生物相容性, 纤维连接蛋白

Abstract:

BACKGROUND: Skin reproducing membrane is a biomaterial used directly in contact with skin defects, so its toxicity to the body must be taken into consideration.

OBJECTIVE: To systematically evaluate the biocompatibility of skin reproducing membrane of medical fibroin.

METHODS: Skin irritation test: the skin defect of New Zealand white rabbit was covered with the skin reproducing membrane of medical fibroin, formaldehyde or normal saline, respectively, and erythema and edema were observed at 24 and 72 hours after treatment. Acute systematic toxicity test: the mice were given extracts of skin reproducing membrane of medical fibroin, phenol and normal saline via tail vein injection; then status of mice, toxicity grade and death were recorded at 24, 48 and 72 hours after injection. Cytotoxicity test: L-929 cells were co-cultured with 100%, 50%, 25%, 10% skin reproducing membrane of medical fibroin extracts, and absorbance values were detected by ultraviolet spectrophotometry at 2, 4 and 7 days after culture, as well as by MTT assay after 48 hours of culture, respectively. Besides, L-929 cells were co-cultured with 100% skin reproducing membrane of medical fibroin extracts, and mRNA expression of fibronectin was determined by qPCR technology after 48-hour culture.

RESULTS AND CONCLUSION: Skin reproducing membrane of medical fibroin has no adverse reaction, acute cytotoxicity, skin irritation and systemic toxicity, and additionally, it does not affect mRNA expression of fibronectin. In general, skin reproducing membrane of medical fibroin has good biocompatibility.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Skin, Cytotoxicity Tests, Immunologic, Silk, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 4

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引言

皮肤作为人体最大的器官，生理结构复杂，可避免机体受到细菌和污物的侵袭，还能保证人体的水分不致逃逸，起着保护和维持机体内环境稳定的作用^[1]。如何对遭受严重创伤、感染或顽固性皮肤溃疡的大面积皮肤缺损进行重建与修复成为临床亟待解决的问题，尤其是怎么解决开放创面的皮肤感染问题^[2]。皮肤组织工程是一门新兴的边缘学科，也是目前最接近成功的组织学产品^[3]。皮肤组织工程是在工程学和生物学原理的基础上，构建出用于修复、改善和维持损伤组织功能的组织替代物的一门学科，其构建出的组织替代物称之为组织工程皮肤^[4-5]。组织工程皮肤作为一种较为完善的组织工程化组织，能够将细胞外基质替代物与真皮成纤维细胞混合成人工皮肤，移植上皮细胞覆盖或待自身上皮覆盖取代病损的皮肤。真皮结构不仅可改善创面愈合的外观和质地，还可给机体提供牢固的机械保护。而植入的组织工程皮肤会与成纤维细胞直接接触，成纤维细胞可合成作用于细胞黏着的纤维连接蛋白，刺激细胞分泌和增殖，造成植入物附近结缔组织增生，产生炎症和甚至毁容。

医用丝素蛋白皮肤再生膜是一种由天然丝素蛋白(75%)和胶蛋白(25%)组成的高分子材料，主要用于不同程度损伤表面的覆盖，具有保护创面、诱导皮肤再生的作用。由于该材料直接接触组织细胞或血细胞，在用于人体前必须考虑其生物安全性，特别是细胞相容性。近年来，利用体外培养细胞方法评价生物材料的细胞毒性，以及用动物血检测生物材料的毒性反应，已被认为是一种有效的检测技术。其中细胞毒性由于具有快速、灵敏、重复性好、操作简便、能在短期内检出受试材料对细胞新陈代谢的影响等特点，已被作为各种医疗器械和生物材料临床应用前的必选项目。丝素蛋白是蚕绢丝腺内壁上内皮细胞分泌、合成的天然高纯度蛋白质，其最终降解产物可被机体吸收，无不良反应，丝素蛋白的分子质量大小可通过改造丝蛋白的成分来调节，具有较好的可溶性和可结晶性。丝素蛋白较其他天然纤维机械特性好，可被加工成模支架形式^[6]。然而关于皮肤再生膜丝素蛋白膜生物相容性的研究较少，临床关于生物再生膜的应用存在争议^[7]。此次主要研究皮肤再生膜的生物相容性，为皮肤组织工程的研究和临床应用提供思路和方法。

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材料方法

1.1 设计观察性实验。

1.2 时间及地点实验于2014年1月至2015年6月在南阳理工学院中心实验室完成。

1.3 材料医用丝素蛋白皮肤再生膜购于江苏省医疗用品研究所；0.154 mol/L生理盐水(经高温灭菌后，置于4 ℃保存)；苯酚、MEM培养液(江苏省医疗用品研究所)；人L-929 细胞细胞购于上海细胞所。

实验动物：100 d龄雄性新西兰大白兔，体质量2.0-2.5 kg，由中国药品生物制品检定所动物繁殖中心提供，许可证号：SCXK(京)2014-2015；8周龄雄性小鼠，体质量20 g，由中国药品生物制品检定所动物繁殖中心提供，许可证号：SCXK(京)2014-2015。

1.4 实验方法

材料浸提液的制备：取已消毒的医用丝素蛋白皮肤再生膜，在无菌、37 ℃下采用MEM培养液浸提120 h，试样表面积/浸提介质=3 cm²/mL，得到100%浸提液，再以MEM培养液稀释成50%，25%，10%浓度浸提液，用于细胞毒性实验和RT-PCR实验。取已消毒的医用丝素蛋白皮肤再生膜，在无菌、37 ℃下采用生理盐水浸提120 h，试样表面积/浸提介质=3 cm²/mL，用于小鼠急性全身毒性实验。

皮肤刺激实验：取新西兰大白兔12只，随机分成实验组、阴性对照组与阳性对照组，每组4只。剪掉12只兔背部脊柱两侧毛，去毛范围左、右各约3 cm×3 cm，其中左侧破损表皮，实验组贴敷医用丝素蛋白皮肤再生膜，阳性对照组涂抹5%甲醛0.5 mL，阴性对照组涂抹生理盐水0.5 mL；右侧不可损伤表皮。分别在24 h和 72 h观察双侧皮肤红斑情况和水肿情况，进行皮肤反应评分，以受试动物积分的平均值进行综合评价，根据24，72 h观察时点最高积分均值，判定皮肤刺激强度，≤0.5分表示无刺激，0.5-2.0分为轻度刺激，2.0-6.0分表示中度刺激，6.0-8.0分表示强刺激。

急性全身毒性实验：将15只小鼠随机分为实验组、阴性对照组和阳性对照组，每组5只。实验组小鼠尾静脉注射材料浸提液50 mL/kg，阴性对照组小鼠尾静脉注射等体积生理盐水，阳性对照组小鼠尾静脉注射等体积0.64%苯酚；注射速度≤0.1 mL/s，注射后24，48，72 h，观察小鼠状态、毒性反应和死亡动物数。

细胞毒性实验：①紫外分光光度仪检测：将对数期L-929细胞置于6孔板培养，每孔1×10⁵个细胞，分别给予不同浓度材料浸提液(100%，50%，25%，10%)刺激，于培养后2，4，7 d用紫外分光光度仪588 nm 波长测其吸光度值(A值)。每组实验重复3次，取平均值，通过计算得出细胞相对增殖率和细胞毒性分级。②MTT法检测：收集对数期L-929细胞，调节细胞悬液浓度为 5×10⁶ L^-1，接种于96 板培养，分别加入不同浓度材料浸提液(100%、50%、25%、10%)，培养48 h，经5 g/L MTT和二甲基亚砜处理后，用酶联仪(BIO-RAD 450 型)在490 nm 波长测其吸光度值，取平均值。通过计算得出细胞相对增殖率和细胞毒性分级。细胞相对增殖率<1%，毒性为5级；1%-24%为4级；25%-49%为3级；50%-74%为2级；75%-99%为1级；>100%，毒性为0级。细胞相对增殖率=实验组A值/对照组A值×100%；对照组为未加浸提液处理。

细胞纤维连接蛋白mRNA表达：将L-929细胞分别置于7 cm×4 cm的培养瓶中，调整细胞浓度为1×10⁷ L^-1，实验组给予100%材料浸提液刺激，阳性对照组给予0.64%苯酚刺激，空白对照组常规培养。培养48 h，每组重复实验4次，按照Trizol说明书抽提细胞总RNA。运用紫外分光光度仪测定RNA样品的A_{280 nm}值并定量。以反转录酶催化合成cDNA，并在聚合酶催化下进行PCR扩增。扩增条件为95 ℃ 1.5 min，55 ℃ 40 s；75 ℃ 40 s，共40个循环；75 ℃延长15 min，4 ℃终止反应。在2.0%琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统上自动成像并进行定量分析。PCR的引物序列如下：纤维连接蛋白的上游引物序列为5’-ACT GAA AGA CCA GCA GAG GC-3’，下游引物序列为5’-CCA ACG GCA TAA TGGGAA A-3’；GAPDH的上游引物序列为5’-TTG TTT TCT GCG CAA GTT AG-3’，下游引物序列为5’-ACGGCT GCT TCC AGC TCC TC-3’。以GAPDH为内参，目的基因cDNA条带积分吸光度值与GAPDH条带积分吸光度值之比为所测mRNA表达相对值。

1.5 主要观察指标丝素蛋白皮肤再生膜的生物相容性。

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0对数据进行统计学分析，计数资料采用χ²检验，计量资料采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

皮肤是机体最大的器官，随着组织工程学研究的不断扩展，利用组织工程原理构建皮肤替代物，可有效解决机体皮肤大面积烧伤、严重创伤及慢性皮肤溃疡等难题^[8]。目前临床常常采用皮肤细胞本身作为皮肤替代物修复缺损，但由于组织工程皮肤没有血管系统供给营养，表面的上皮极易坏死^[9]。成功的人工皮肤应该能够快速促进血管生成活性，快速诱导内皮分化，同时不会抑制附着细胞血管生长因子的分泌^[10]。近年来在皮肤组织工程生物材料中，丝素蛋白被广泛关注，主要因为丝素蛋白具有较好的机械特性，可与许多高性能的纤维相媲美，能够支持多种细胞的增殖分化，其降解产物对机体没有毒害作用^[11]，在皮肤组织工程的应用中具有更多的优点和潜力。

生物材料的细胞相容性评价在生物材料生物安全评价体系中是最重要的检测指标之一，因为细胞相容性能对毒性物质有较大的敏感性^[12-14]。细胞毒性实验可通过检测生物材料或其浸提液对细胞生长的影响来评价生物材料对细胞的毒性，是一种检测生物相容性比较价廉、快速且具有较好重复性的方法，该检测方法已被国际认可^[16]。皮肤再生膜是与皮肤缺损表面接触的生物材料，因此此次实验选择了细胞毒性实验，更好地观察生物材料对成纤维细胞是否具有毒副作用。细胞毒性实验结果显示，L-929细胞与医用丝素蛋白皮肤再生膜浸提液共培养后，细胞相对增殖率无明显差异且细胞毒性分级为0级，提示医用丝素蛋白皮肤再生膜无细胞毒性。

医用丝素蛋白皮肤再生膜作为皮肤替代物修复缺损生物材料，要考虑对皮肤刺激作用的影响^[15]。皮肤刺激实验结果显示，丝素蛋白皮肤再生膜对皮肤破损皮肤刺激反应计分与完整皮肤刺激反应计分均为0，提示丝素蛋白皮肤再生膜无皮肤刺激作用。主要是因为丝素蛋白皮肤再生膜与机体具有较好的亲和性，尤其是用作人工皮材料，丝素蛋白内含有18种氨基酸，本身具有较好的理化特性，对机体缺损皮肤无刺激^[18-20]。另外，丝素蛋白皮肤再生膜的透气性和透水性较好，对皮肤缺损创面有较强的黏合力，不会影响皮肤再生膜覆盖下机体自身皮肤的生长。

皮肤再生膜是与皮肤缺损表面接触的生物材料，必须考虑皮肤再生膜对机体毒性的影响。实验结果显示，实验组小鼠注射医用丝素蛋白皮肤再生膜浸提液后，状态正常，无中毒和死亡，与阴性对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。该结果也进一步证实了丝素蛋白皮肤再生膜是一种健康安全的皮肤再生膜，对机体无不良反应^[17]。

组织工程皮肤能够将细胞外基质替代物与真皮成纤维细胞混合成人工皮肤，移植上皮细胞覆盖或待自身上皮覆盖取代病损的皮肤。而植入的组织工程皮肤会与成纤维细胞直接接触。成纤维细胞可合成作用于细胞黏着的纤维连接蛋白，刺激细胞分泌和增殖，造成植入物附近结缔组织横生，造成瘢痕。L-929细胞与医用丝素蛋白皮肤再生膜浸提液共培养后，需用qPCR检测刺激后细胞纤维连接蛋白FN mRNA的表达，结果显示，医用丝素蛋白皮肤再生膜浸提液处理后，纤维连接蛋白mRNA表达未受到不良影响，提示医用丝素蛋白皮肤再生膜具有很好的生物相容性，不会过于刺激纤维连接蛋白，造成明显疤痕。

另外有关研究显示，丝素蛋白液对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的生长具有明显抑制作用，丝素蛋白的这一特性也会有助于降低皮肤缺损创面感染，加速细胞增殖^[21-22]。姚敏等^[23]的研究也证实，丝素蛋白能够有效促进表皮细胞的生长。实验结果显示，各组细胞纤维连接蛋白mRNA基因表达均未受到不良影响。说明丝素蛋白皮肤再生膜不会影响机体内细胞纤维连接蛋白mRNA基因的表达，具有较好的生物相容性。

综上所述，丝素蛋白皮肤再生膜对皮肤缺损创面无不良反应，不会对机体皮肤产生刺激，能够促进细胞的增殖和分化，具有较好的生物相容性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程