低聚乙二醇富马酸酯水凝胶中骨髓来源间充质干细胞的生物学行为

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.16.016

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (16): 2397-2404.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.16.016

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低聚乙二醇富马酸酯水凝胶中骨髓来源间充质干细胞的生物学行为

魏丽君¹，曹均凯¹，李俊杰²，冯兰兰²

1解放军总医院口腔科，北京市 100853；2军事医学科学院基础医学研究所，北京市 100850

收稿日期:2016-03-14 出版日期:2016-04-15 发布日期:2016-04-15
通讯作者: 曹均凯，硕士，主任医师，副教授，解放军总医院口腔科，北京市 100853
作者简介:魏丽君，女，1988年生，青海省西宁市人，汉族，解放军总医院在读硕士。研究方向是骨组织工程。
基金资助:
国家自然科学基金(31271054)

Biological behavior of rat bone marrow mesenchymal stem cells in oligo(poly(ethylene glycol)fumarate) hydrogel

Wei Li-jun¹, Cao Jun-kai¹, Li Jun-jie², Feng Lan-lan²

1Department of Stomatology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China; 2Institute of Basic Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China

Received:2016-03-14 Online:2016-04-15 Published:2016-04-15
Contact: Cao Jun-kai, Master, Chief physician, Associate professor, Department of Stomatology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China
About author:Wei Li-jun, Studying for master’s degree, Department of Stomatology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31271054

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

水凝胶：是以水为分散介质的凝胶，具有网状交联结构的水溶性高分子中引入一部分疏水基团和亲水残基，亲水残基与水分子结合，将水分子连接在网状内部，而疏水残基遇水膨胀的交联聚合物。是一种高分子网络体系，性质柔软，能保持一定的形状，能吸收大量的水。凡是水溶性或亲水性的高分子，通过一定的化学交联或物理交联，都可以形成水凝胶。这些高分子按其来源可分为天然和合成两大类。天然的亲水性高分子包括多糖类(淀粉、纤维素、海藻酸、透明质酸，壳聚糖等)和多肽类(胶原、聚L-赖氨酸、聚L-谷胺酸等)。合成的亲水高分子包括醇、丙烯酸及其衍生物类(聚丙烯酸，聚甲基丙烯酸，聚丙烯酰胺，聚N-聚代丙烯酰胺等)。

低聚乙二醇富马酸酯水凝胶：是由聚乙二醇和延胡索酸酯与聚乙二醇二丙烯酸酯化学交联而成，具有良好的组织相容性和生物可降解性。实验证明低聚乙二醇富马酸酯水凝胶随着相对分子质量的升高其溶胀度降增加，溶胀比增加引起水凝胶降解速度加快及力学强度减弱。故研制与筛选具有合适溶胀比的低聚乙二醇富马酸酯水凝胶材料是进行骨组织工程支架材料研究的前提。

背景：低聚乙二醇富马酸酯水凝胶是一种具有良好生物相容性及可注射性和可降解性的生物材料。不同相对分子质量水凝胶之间的特性有所差异，将骨髓间充质干细胞包裹其中并诱导细胞成骨分化，相对分子质量相当的水凝胶更有利于细胞增殖和分化，所以采用该材料为骨组织工程支架提供了新的选择。

目的：探讨不同相对分子质量的低聚乙二醇富马酸酯水凝胶材料体外包裹大鼠骨髓间充质干细胞的增殖和分化的影响。

方法：低聚乙二醇富马酸酯通过氧化还原基团引发系统产生交联，制备出相对分子质量为1000，3000，10000，35 000的低聚乙二醇富马酸酯水凝胶，对水凝胶的溶胀和降解性能进行检测。将骨髓间充质

干细胞包裹到4种相对分子质量的水凝胶中，在成骨培养液中诱导1-3周，通过组织学染色(苏木精-伊红染色和茜素红染色)和免疫荧光染色检测水凝胶材料对骨髓间充质干细胞形态的影响以及成骨分化的效果。
结果与结论：①随着水凝胶相对分子质量的增加，成胶时间变短，凝胶的溶胀度明显增加，且随着时间的推移，水凝胶的降解速率与相对分子质量成正比；②细胞复合水凝胶支架材料的组织学与免疫荧光染色结果表明，细胞经过诱导后，在具有适当溶胀与降解特性的相对分子质量为3 000与10 000的水凝胶中所形成的矿化结节数量显著多于在其它两种相对分子质量中的，说明有利于细胞的增殖与分化；③结果表明，低聚乙二醇富马酸酯水凝胶具有良好的生物相容性，且相对分子质量为3 000与 10 000的水凝胶对间充质干细胞的成骨分化有一定的良性调节作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
ORCID: 0000-0002-0616-3754(魏丽君)

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 水凝胶, 聚合作用, 间充质干细胞, 成骨分化, Ⅰ型胶原, 增殖, 矿化作用, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Oligo(poly(ethylene glycol)fumarate) (OPF) hydrogel is a kind of biomaterial with good biocompatibility, injectability, and biodegradability. It is known that there are differences in the characteristics of hydrogels with different molecular weights. Under osteogenic induction, bone marrow mesenchymal stem cells encapsulated in the suitable molecular weight hydrogel have better proliferation and differentiation. Therefore, the use of OPF hydrogel provides new options for bone tissue-engineered scaffold.

OBJECTIVE: To investigate the effect of OPF hydrogel with different molecular weights on the proliferation and differentiation of encapsulated rat bone marrow mesenchymal stem cells in vitro.

METHODS: Four kinds of OPF hydrogels with molecular weights of 1 000, 3 000, 10 000 and 35 000 were developed by OPF crosslinking with a redox radical initiation system. Hydrogel swelling and degradation properties were detected. Afterwards, bone marrow mesenchymal stem cells encapsulated in different hydrogels were cultured in osteogenic medium for 1-3 weeks. The effects of hydrogels on morphplogy of bone marrow mesenchymal stem cells and osteogenic differentiation were detected via histological staining (hematoxylin-eosin staining and alizarin red staining) and immunofluorescence staining.

RESULTS AND CONCLUSION: With the increase of molecular weight of hydrogels, the gelation time was shortened, the swelling ratio significantly increased, and the hydrogel degradation rate was proportional to the molecular weight. In addition, the number of mineralized nodules formed in 3 000 and 10 000 molecular weight hydrogels was more than that in the other hydrogels, indicating that hydrogels with appropriate swelling and degradation properties are beneficial to cell proliferation and differentiation. In conclusion, OPF hydrogels have good biocompatibility and hydrogels with 3 000 and 10 000 molecular weight play active regulatory roles in osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Gels, Mesenchymal Stem Cells, Tissue Engineering

魏丽君，曹均凯，李俊杰，冯兰兰. 低聚乙二醇富马酸酯水凝胶中骨髓来源间充质干细胞的生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(16): 2397-2404.

Wei Li-jun1, Cao Jun-kai1, Li Jun-jie2, Feng Lan-lan2 . Biological behavior of rat bone marrow mesenchymal stem cells in oligo(poly(ethylene glycol)fumarate) hydrogel[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(16): 2397-2404.

图/表（结果） 8

2.1 间充质干细胞的鉴定结果倒置相差显微镜下，第4代间充质干细胞贴壁生长良好，细胞呈梭形，聚集成网状(图1A)。流式细胞仪检测结果显示，CD90与CD29阳性率分别为96.95%和99.91%，CD45与CD34阳性率分别为0.22%和0.16%(图1B)，说明培养的细胞为骨髓来源的间充质干细胞，而非造血干细胞，可用于进一步实验。

间充质干细胞通过成脂分化诱导3 d和7 d后，油红O染色诱导的细胞存在明显的红色脂滴，与脂肪组织内的脂肪空泡相似(图2A)。细胞成骨分化7 d和14 d后，茜素红染色可见红色钙化结节(图2B)，证明所培养的细胞具有向成脂和成骨分化的能力。

2.2 水凝胶材料的特性低聚乙二醇富马酸酯在常温下为粉末状物质，常聚集成块状，从图3中看出随着相对分子质量的增大水凝胶的颜色逐渐变浅，在37 ℃孵箱中，不同相对分子质量的低聚乙二醇富马酸酯水凝胶具有不同的成胶时间(表1)，相对分子质量为35 000 低聚乙二醇富马酸酯成胶时间总体较其他组短，其次是相对分子质量为10 000的低聚乙二醇富马酸酯在8 min可凝固，而相对分子质量为1 000的低聚乙二醇富马酸酯约在35 min时可以形成凝胶。

图4A可见，随着低聚乙二醇富马酸酯相对分子质量的增加，凝胶的溶胀度明显增加。相对分子质量为3 000的水凝胶溶胀度较相对分子质量为1 000的上升近1倍，相对分子质量为35 000的水凝胶溶胀度与相对分子质量为10 000的水凝胶差异无显著性意义。造成这种差异性是因为交联度随着相对分子质量逐渐上升，所形成的凝胶内部网孔逐渐增大，导致吸水性逐渐增强，溶胀度呈上升趋势^[18]。

溶胶分数的结果表明随着时间的推移，所有组的水凝胶都呈现降解趋势(图4B)。相对分子质量为35 000低聚乙二醇富马酸酯水凝胶拥有最快的降解速率，在14 d，溶胶分数已达到83%，与相对分子质量为35 000的水凝胶相比，在14 d，相对分子质量为10 000的水凝胶溶胶分数只有76%，而相对分子质量为3 000和1 000的水凝胶表现为相对较低，仅为60%和68%，这是由于随着相对分子质量的逐渐降低，凝胶的网孔尺寸也随之降低，从而水分进入的较少，故降解速率缓慢。

2.3 细胞毒性试验 CCK-8结果显示，随着时间的增加，细胞数量逐渐增多，各组细胞数量与对照组接近(图5)，表明4种相对分子质量的低聚乙二醇富马酸酯水凝胶均无细胞毒性。从图中可见，在第1天时，相对分子质量为3 000与10 000水凝胶浸提液组中细胞的数量均大于其他两组，且差异有显著性意义(P < 0.05)；第2天时，4组之间差异无显著性意义(P > 0.05)；第3和4天时，相对分子质量为3 000组与10 000组细胞数量的平均值均高于其他2组，说明相对分子质量为3 000组与10 000水凝胶具有良好的生物相容性。

2.4 细胞形态成骨诱导21 d时，苏木精-伊红染色显示，4组细胞生长状态良好，细胞核深染，相对分子质量为3 000与10 000组细胞多于其他2组；茜素红染色显示进一步说明在相对分子质量为3 000与10 000软硬度适中的水凝胶基质中，更有利于成骨诱导液中的物质交换，促进干细胞成骨分化(图6)。

2.5 Ⅰ型胶原的表达图7免疫荧光染色结果显示，随着时间延长，各组细胞中Ⅰ型胶原表达增强，其中相对分子质量为10 000组显示成骨表达量最高，相对分子质量为3 000组较10 000组有所降低，而相对分子质量为1 000与35 000组显著低于10 000组。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞观察性实验。

1.2 时间及地点实验于2015年2至12月在军事医学科学院基础医学研究所完成。

1.3 材料

低聚乙二醇富马酸酯水凝胶干预骨髓来源间充质干细胞使用的主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
胎牛血清、两性霉素B、氨苄青霉素、庆大霉素、胰蛋白酶-EDTA	Gibco公司
硫酸铵、N，N，N’，N’-四甲基乙二胺、地塞米松、β-甘油磷酸酯、维生素C、茜素红染液	Sigma Aldrich公司
CCK-8溶液	碧云天公司
茜素红染液、CY3荧光素标记的二抗	Abcom公司
OCT冰冻包埋剂	美国Sakura Finetek公司
流式细胞仪(FACSCalibur)	美国BD公司
阳离子防脱载玻片	北京中杉金桥生物技术有限公司
酶标仪、切片机(CM1850)、荧光显微镜	德国Leica公司
倒置相差显微镜	日本Olympus公司

6只出生24 h内SPF级SD大鼠由军事医学科学院基础医学研究所组织工程中心提供，动物许可证号为SCXK-(军)2012-0004，所有的操作步骤包括实验动物均经过动物保护机构和军事医学科学院委员会的批准认可。

相对分子质量为1 000，3 000，10 000，35 000的低聚乙二醇富马酸酯由美国Rice大学Mikos教授惠赠。

1.4 方法

1.4.1 间充质干细胞的分离、培养与鉴定取6只新生大鼠，在无菌条件下，切断新生鼠双后肢，分离剔除结缔组织、筋膜与肌肉组织，用PBS清洗股骨与胫骨2遍并在无菌条件下剪碎成肉糜状，随后将骨组织碎片转移至100 mm培养皿中，加入DMEM低糖培养基(含有体积分数10%胎牛血清、250 μg/L两性霉素B、100 mg/L 氨苄青霉素及50 mg/L庆大霉素)，置于37 ℃，体积分数5%CO₂，95%相对湿度的孵箱中进行预培养。大鼠骨髓间充质干细胞可从骨碎片中爬出伸展并黏附于培养皿底部。通过每2 d更换一次新鲜的培养基以去除未黏附的细胞，直到细胞达到培养皿底面积的80%-90%，用0.25%胰蛋白酶-EDTA分离消化细胞并传代。首先，通过流式细胞仪检测所分离的细胞后传至第4代，后期用于本实验研究。其次，将间充质干细胞分别定向诱导分化，在不同时间点去除成脂诱导液和成骨诱导液，水洗后40 g/L多聚甲醛固定30 min，水洗2遍，在孔板中加入配制好的油红O染液，静置5 min，水洗；在另一孔板中加入茜素红染液，在37 ℃孵育30 min，水洗，光学显微镜下观察诱导后的结果并拍照。

1.4.2 低聚乙二醇富马酸酯水凝胶的制备将150 mg的不同相对分子质量的低聚乙二醇富马酸酯(1 000， 3 000，10 000和35 000)与75 mg的平均相对分子质量为2 000的聚乙二醇二丙烯酸酯(Sigma Aldrich公司)溶于860 μL PBS中混匀。然后在聚合物溶液中先后加入 70 μL的0.3 mol/L过硫酸铵和0.3 mol/L N，N，N’，N’-四甲基乙二胺的PBS溶液。温和混匀后，快速注射到96孔板中(每孔100 μL)，在37 ℃孵育致使交联完全，不同时间点观察成胶的情况。

1.4.3 水凝胶材料的溶胀与降解特性对制备好的无细胞的水凝胶共4组进行溶胀和降解测试。每组选取5个样本，将交联后的水凝胶称质量(W_i)，完毕后在去离子水(ddH₂O)中溶胀16 h达到平衡再次称质量(W_s)，将得到的水凝胶置于37 ℃干燥过夜后称取干质量(W_d)。根据如下方程计算水凝胶的溶胀比：溶胀比=(W_s- W_d)/ W_d。

随后，将不同相对分子质量的低聚乙二醇富马酸酯水凝胶圆柱体小体分别放置到盛有2 mL PBS的24孔板中，置于37 ℃细胞培养箱中孵育。不同时间点观察其体外降解情况。根据如下方程计算水凝胶降解的溶胶分数：溶胶分数=(W_i-W_d)/ W_i。
1.4.4 间充质干细胞的包裹与培养将1.3×10¹⁰ L^-1间充质干细胞168 μL包裹于不同相对分子质量的低聚乙二醇富马酸酯支架中，交联后迅速注射到96孔板中(每孔100 μL)，孵箱培育8 min，交联后的细胞与凝胶复合物无菌转移到至24孔板，每孔加入1 mL DMEM低糖培养基。3 h内，培养基更换2次以确保移除残余的凝胶液体。培养1 d后更换为成骨诱导液(含1×10^-8mol/L地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸酯，50 mg/L维生素C的DMEM低糖培养基)。

在诱导21 d内，每2 d或3 d更换一次培养基。在培养3，7，14，21 d后，样品移出培养基用于组织学分析。将不同时间点的样品冰冻包埋，切取7 μm厚度置于阳离子防脱载玻片表面，固定，进行苏木精-伊红染色、茜素红染色以及免疫荧光染色，拍照。

1.4.5 CCK-8毒性试验将制备好的低聚乙二醇富马酸酯水凝胶浸泡于5 mL DMEM低糖培养基中，在孵箱中培养24 h，收集浸提液至无菌EP管中。在96孔板，每孔加入细胞浓度为5×10⁷L^-1的第4代间充质干细胞悬液，待细胞贴壁后，加入相应的浸提液，到达不同的时间点后每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h，用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度值。

1.4.6 细胞形态观察取包裹有间充质干细胞的低聚乙二醇富马酸酯水凝胶样品冰冻切片，OCT冰冻包埋剂包埋样品，切片机切取7 μm厚度的切片置于防脱载玻片表面，染色之前将切片置于冷丙酮中固定10 min，后做苏木精-伊红染色。苏木精浸染约3 min，水洗、体积分数1%盐酸分色1 s、水洗、氨水复蓝2 s，水洗后再次用伊红浸染约15 min。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。光学显微镜下观察细胞形态。

取包裹有间充质干细胞的低聚乙二醇富马酸酯水凝胶样品冰冻切片表面滴加配制好的茜素红染液，在 37 ℃孵育30 min，水洗切片，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。光学显微镜下观察细胞形态变化及矿化结节形成情况。

1.4.7 免疫荧光染色将贴附于载玻片上的样品室温干燥30 min，冷丙酮固定10 min；PBS漂洗3次，每次 5 min；加入0.3%TritonX-100作用30 min；加入体积分数5%山羊血清37 ℃封闭30 min，弃封闭液；加入羊抗兔Ⅰ型胶原抗体工作液(1∶100)，4 ℃湿盒中孵育过夜；PBS漂洗3次，每次3 min，以除去一抗；加入CY3荧光素标记的二抗(1∶100)室温避光孵育1 h，PBS漂洗3次，每次5 min；加入Hoechst33258室温孵育15 min，复染细胞核；后PBS漂洗3次，每次3 min；甘油封固，荧光显微镜下观察染色情况。

1.5 主要观察指标 4种不同相对分子质量低聚乙二醇富马酸酯水凝胶的溶胀和降解性能；间充质干细胞在水凝胶中经过诱导后的组织学染色和免疫荧光染色结果。

1.6 统计学分析采用SPSS 13.0统计软件进行分析，数据以x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

修复重建骨缺损一直是临床面临的焦点问题，骨组织缺损后虽然具有一定的再生和自我修复能力，但是对于大面积的骨缺损，在单纯依靠骨组织自身无法愈合时，则需要采取外科植骨治疗，但传统的骨移植方法存在着取材有限、免疫排斥反应等缺点，限制了其在临床中的应用^[19-20]。为避免以上问题，作者可通过骨组织工程修复^[21-22]。因来源于中胚层的间充质干细胞具有易于分离、培养扩增和多向分化能力^[23-25]，实验首选骨髓间充质干细胞为种子细胞，其能在多种三维支架上黏附、生长、增殖和分化，并复合三维支架材料移植修复组织缺损^[26-27]，然后以具有良好生物相容性及可降解性的低聚乙二醇富马酸酯水凝胶作为组织工程三维支架材料^[28]，成功制备出不同相对分子质量的水凝胶/细胞复合物。

实验将人工合成的水凝胶作为细胞的支架，模拟细胞微环境，目的是为了评估在不同相对分子质量的低聚乙二醇富马酸酯水凝胶中对间充质干细胞生物学行为的影响。众所周知，水凝胶的凝胶时间、溶胀率、降解速率和弹性强度与凝胶前驱体相对分子质量及浓度密切相关^[29]。对于低聚乙二醇富马酸酯水凝胶而言，其相对分子质量越大，凝胶时间越短，溶胀率越高，降解速率越快，水凝胶弹性强度越小。实验所得最大相对分子质量与最小相对分子质量的水凝胶成胶时间相差较大，且水凝胶的溶胀率和降解速率会影响干细胞的生长行为，尤其是间充质干细胞的表型、增殖及分化，间充质干细胞在软基质中更倾向于分化为神经细胞，在硬基质中倾向于分化为成骨细胞^[30]，但是由于水凝胶的相对分子质量较大时降解速率较快，而相对分子质量较小时，降解速率缓慢，故软硬适中的基质(3 000与10 000组)更有利于干细胞增殖和分化。

通过此次实验的初步研究，对4种不同相对分子质量的低聚乙二醇富马酸酯水凝胶进行了溶胀比和降解速率基本性能的表征，这是影响低聚乙二醇富马酸酯水凝胶物理与化学性质的重要因素，结果表明交联度会随着相对分子质量的增大，所形成的凝胶内部网孔结构逐渐增大，将导致吸水性逐渐增强，溶胀度会呈现上升的趋势，同时随着时间的推移，各组的水凝胶都呈现降解趋势，结果显示随着相对分子质量的逐渐降低，凝胶的网孔尺寸也随之降低，从而进入孔内的水分较少，故降解速率相对缓慢。水凝胶浸提液对细胞毒性实验的结果可见，各组细胞数量与对照组相比，均为增长趋势，在第1天时，相对分子质量为3 000组与10 000水凝胶浸提液组中细胞的数量超过1 000和35 000组，并且差异有显著性意义(P < 0.05)；后期平稳增长，到达第3和4天时，3 000组与10 000组细胞数量的平均值均高于其它两组，说明低聚乙二醇富马酸酯水凝胶具有良好的生物相容性。对三维水凝胶中间充质干细胞的增殖和分化状况进行评估，通过苏木精-伊红染色，可看出细胞生长状态良好，细胞核清晰，细胞质较为饱满，茜素红染色以及Ⅰ型胶原免疫荧光染色进一步说明水凝胶支架材料对细胞提供了良好的生长微环境，经过成骨诱导后，达到了预期的成骨效果，此次实验筛选并获得了具有良好性能的水凝胶，为下一步的体内研究和临床应用打下坚实的基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

低聚乙二醇富马酸酯水凝胶中骨髓来源间充质干细胞的生物学行为

Biological behavior of rat bone marrow mesenchymal stem cells in oligo(poly(ethylene glycol)fumarate) hydrogel

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