宁夏枸杞叶对去势模型大鼠雌激素受体表达的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.15.007

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

枸杞：枸杞是茄科植物，人们日常食用和药用的枸杞子多为宁夏枸杞的果实“枸杞子”，而且宁夏枸杞是唯一载入《2010年版中国药典》的品种，与琼珍灵芝、长白山人参，东阿阿胶并称为中药四宝。宁夏枸杞在中国栽培面积最大，主要分布在中国西北地区，而其他地区常见的为中华枸杞及其变种。

激素受体：是一种蛋白质分子，它们较多地存在于靶器官的细胞内，可与激素发生特异性结合而形成激素-受体复合物，使激素发挥其生物学效应。

背景：前期实验发现枸杞叶主要成分枸杞多糖对成年去势雌性大鼠骨质疏松有明显的骨质改善作用。

目的：观察宁夏枸杞叶对去势大鼠血清雌激素和骨组织雌激素受体表达的影响。

方法：SD雌性未孕6月龄大鼠32只，分为3组。模型组和治疗组切除大鼠卵巢建立绝经后骨质疏松症动物模型。假手术组仅切除卵巢周围少许脂肪组织立即关闭切口。造模后8周后治疗组大鼠随机分为2组，分别饮水服枸杞叶500 mg/kg(治疗低剂量组)和枸杞叶1 000 mg/kg(治疗高剂量组)，每天1次，连续12周；模型组和假手术组给予等量的蒸馏水。用放射免疫法(RIA法)检测大鼠血清中的雌二醇的水平变化，运用免疫组织化学方法检测雌性大鼠各组骨组织中雌激素受体的变化。

结果与结论：与假手术组比较，模型组大鼠血清雌二醇明显降低(P < 0.01)；与模型组比较，药物治疗组可以明显提高血清雌二醇浓度(P < 0.01)，高剂量组明显。与假手术组比较，模型组大鼠血清雌激素受体α、雌激素受体β明显降低(P < 0.01)，模型组比较，治疗组雌激素受体α、雌激素受体β表达量增加，差异有显著性意义(P < 0.01)。结果说明，宁夏枸杞叶能提高去卵巢骨质疏松模型大鼠血清雌二醇水平和骨细胞雌激素受体α、雌激素受体β的表达，可能是治疗骨质疏松症的重要机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID:0000-0002-4333-9616(马锋)

关键词: 组织构建, 骨组织工程, 宁夏枸杞叶, 骨质疏松, 成骨细胞, 雌激素受体, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Lycium barbarum polysaccharide, the main active component of leaves of lycium barbarum, has a remarkable therapeutic effect on osteoporosis in adult ovariectomized female rats.
OBJECTIVE: To explore effects of leaves of Lycium barbarum on serum estradiol and bone estrogen receptor expressions in adult oxariectomized female rats．
METHODS: Thirty-two 6-month-od female rats were randomized into sham-surgery, model, and treatment groups, respectively. Rat models of postmenopausal osteoporosis were induced by ovariotomy followed by orally administration of water solution of leaves of Lycium barbarum (500 or 1 000 mg/kg) or distilled water once daily for consecutive 12 weeks in treatment and model groups, respectively. Serum estradiol level was detected by radiation immunoassay method. Estrogen receptor α, β immunoreactivities in bone tissue were determined by immunohistochemical staining．
RESULTS AND CONCLUSION: Serum estradiol level in the model group was significantly decreased compared with the sham-surgery group (P < 0.01), but that was significantly increased in the treatment groups, particularly at high dose, compared with the model group (P < 0.01). Estrogen receptor α, β immunoreactivities were weaker in the model group than the sham-surgery group (P < 0.01), and those were stronger in the treatment groups than the model group (P < 0.01). Our results suggest that leaves of Lycium barbarum treat osteoporosis through enhancing serum estradiol and estrogen receptor expressions in adult ovariectomized rats．
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Key words: Lycium, Osteoporosis, Osteoblasts, Receptors, Estrogen, Tissue Engineering

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图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析实验选用大鼠32只，分为4组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。大鼠建模流程图见图1。

2.2 模型方法的优点实验选择双侧卵巢切除法复制骨质疏松模型，该类模型成功率高、稳定性可靠、重复性好、适用范围广^[7]，前期实验已证实。

2.3 模型更接近人类或临床实践骨密度是诊断骨质疏松的标准，但是由于不同骨骼部位的骨丢失方式不同，其骨密度存在差异^[8]。目前的测量部位多选择在易发生骨折的腰椎和髋部，L₁_-₄正位和左侧股骨近端各部位，包括股骨颈、大转子、Ward’s三角区和全髋部，但究竟测定哪个部位的骨密度诊断敏感性好，国内的研究尚未达成共识。为增加模型成功的客观性，选择椎骨、股骨和胫骨3个不同的部位进行骨密度的检测分析，更接近绝经后骨质疏松的临床病理特点。

2.4 各组大鼠造模前、后椎骨、股骨及胫骨骨密度结果大鼠造模前，各组之间的椎骨、股骨、胫骨骨密度差异均无显著性意义(P > 0.05)；大鼠去卵巢造模8 周后，模型组低于假手术组、造模后低于造模前(P < 0.05)。见表1。

2.5 各组大鼠血清雌二醇浓度变化模型组大鼠与假手术组比较，血清雌二醇明显降低(P < 0.01)，较模型组比较，药物治疗组可以明显提高血清雌二醇浓度(P < 0.01)，高剂量组明显，但药物治疗组组间比较差异无显著性意义。见表2

2.6 宁夏枸杞叶对去势大鼠雌激素受体表达的影响免疫组织化学结果显示，椎体松质骨中雌激素受体α、雌激素受体β主要分布于骨小梁周围的成骨细胞、破骨细胞及骨髓基质细胞中，阳性颗粒为棕黄色，胞浆胞核均有表达，但胞核着色较深。从阳性细胞灰度的角度来看，相应各组大鼠雌激素受体α比雌激素受体β表达明显，差异有显著性意义(P < 0.01)，模型组大鼠雌激素受体α阳性表达较假手术组组明显降低(P < 0.01)，而治疗组与模型组相比显著增加(P < 0.01)，高剂量组改善明显，但药物治疗组组间比较差异无显著性意义。模型组大鼠雌激素受体β阳性表达较假手术组组明显降低(P < 0.01)，而治疗组与模型组相比显著增加(P < 0.01)，与雌激素受体α阳性表达比较改善更明显，但药物治疗组组间比较差异无显著性意义。见表3。

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引言

骨质疏松症是一种常见的全身性骨骼疾病，其发病与多种因素有关[1]，具体发病机制尚未清楚。美国的H M．Frost将参与骨重建的破骨细胞、成骨细胞的骨细胞称为一个基本的多细胞骨单位(BMU)。这个骨单位通过生物偶联机制进行不断的细胞活化-骨吸收-骨形成(A-R-F)，进行骨转换，构成一个个骨重建周期。成骨细胞不仅参与骨形成，而且还参与破骨细胞性骨吸收的调节，抑制破骨细胞分化成为成熟的多核破骨细胞，并能促使其凋亡失去破骨的功能，从而使骨吸收得到抑制[2]。在多种细胞因子的调控下，通过复杂分子机制完成骨代谢平衡[3]。雌激素参与人体骨骼系统生理和病理的相关过程，对骨的生长发育、成熟以及骨量的维持发挥着至关重要的作用。绝经后以及卵巢切除的妇女，由于雌激素的缺乏打破了骨形成与骨吸收偶联的动态平衡，吸收多而形成少，导致骨小梁结构的疏松化和骨量减少。
随着分子生物技术的的应用，在人们发现雌激素受体并深入研究后，获知雌激素属于类固醇激素，雌激素是通过通过细胞内雌激素受体发挥作用的，雌激素对骨代谢的作用点雌激素受体主要在成骨细胞。雌激素受体基因多态性与老年妇女骨密度与骨折的发生有一定的相关性[4]，可见雌激素和雌激素受体在骨质疏松发病机理中扮演重要角色，因此，本实验以雌激素受体作为靶点探讨地方特色植物对骨质疏松的防治作用。枸杞是茄科植物，回药名为“忽咱则”(阿语音译)，有中医学者用含有枸杞的方剂治疗骨质疏松[5]，经过课题组前期实验研究，枸杞叶的成分之一枸杞多糖可促进成骨细胞株的增殖和分化，可延缓去卵巢后的骨质丢失，做为地方特色的枸杞叶是否对骨质疏松模型的雌激素和雌激素受体有正性作用未见报道。鉴于临床实际的需要和目前的研究现状，此次研究以去势法复制动物骨质疏松模型，对去势大鼠模型以及去势后自然摄取宁夏枸杞叶溶液，观察血清雌激素的变化，以及以雌激素受体为靶点探讨宁夏枸杞叶对骨质疏松是否具有防治作用，找到宁夏枸杞叶对骨质疏松具有防治作用的理论依据将对骨质疏松的防治具有重要的意义。
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材料方法

1.1 造模动物及材料实验于2014年6月至2015年8月在宁夏医科大学中心实验室完成。

实验动物：SD雌性未孕6月龄大鼠32只，由宁夏医科大学实验动物中心提供。

枸杞叶：购于宁夏银川育新枸杞种业有限公司。

主要试剂和仪器：医学图像分析管理系统(北航CMIAS99系列)；SN695型放射免疫计数器(上海日环仪器厂)；LEICA EG 1150H 包埋机(德国徕卡公司)；HM-340E 恒冷箱切片机(德国徕卡公司)；兔抗雌激素受体α(MC-20)sc-542(Santa Cruz产品)；山羊抗雌激素受体β(L-20)sc-6822(Santa Cruz产品)；ABC试剂盒(北京中山生物试剂公司)；雌二醇放免试剂盒(北京北方生物技术研究所)；X-RAY 分析仪(规格: carestream FXPRO)，购买于美国 Lunar 有限公司。

1.2 造模方法

1.2.1 动物分组雌性未孕6月龄SD大鼠32只，饲养于12 h明暗交替、室温(24±2) ℃环境中，按体质量编号后随机分为假手术组、模型组、治疗低剂量组、治疗高剂量组，每组8只。

1.2.2 建立去势大鼠模型大鼠分组后，适应性喂养1周后，体积分数8%水合氯醛(5 mL/kg)腹腔注射麻醉，腹位固定，无菌条件下行背部两侧腰椎旁1.5 cm处纵行切口入腹，切除双侧卵巢，结扎双侧卵巢动脉，假手术组大鼠仅切除卵巢周围少许脂肪组织立即关闭。术后连续3 d大腿肌肉注射青霉素，每只大鼠40 kU/kg。

1.3 造模成功的检测标准各组大鼠造模7周后，分笼，观察1周，测定大鼠在造模前、造模后8周的骨密度^[6]，结果示造模后8周模型组与假手术组比较骨密度明显降低，证明造模成功。

1.4 枸杞叶溶液的制备依据课题组前期的研究结果^[6]，取干燥枸杞叶10 g，加蒸馏水100 mL，用豆浆机磨碎，即为浓度相当于生药量100 g/L的枸杞叶水溶液。

1.5 枸杞叶溶液的服用各组大鼠造模7周后，每组分为2笼，每笼4只，观察1周每只大鼠每天饮水量(选用盖、嘴完好的500 mL鼠用饮水瓶，用250 mL量筒分别加入200 mL自来水，每天换水1次，换水时分别量取每瓶中剩余水量，计算出饮水量)之后各组大鼠自由饮水服用药物，治疗组低剂量组为500 mg/kg，高剂量组为枸杞叶1 000 mg/kg，1次/d，连续12周，假手术组给予等量的蒸馏水。每天上午9点开始断水，至下午7点加入各自剂量药物于饮水瓶中(饮水量为每只大鼠每天饮水量的一半) ，至晚上11点观察剩余饮水量，如果基本无剩余，则补足每只大鼠每天饮水量，如果剩余较多，可适当减少(要确保大鼠在每天下午7-10点的时间内摄取每天所需药量)。

1.6 激素测定检测大鼠血清中的雌二醇的水平变化。采用放射免疫法(RIA法)^[7]，按试剂盒说明书进行操作。

1.7 腰椎雌激素受体α和雌激素受体β的免疫组织化学检测分离大鼠第1腰椎，将腰椎上的肌肉剔除，固定于100 g/L的多聚甲醛中，1周后放于8%的中性EDTA中，4 ℃脱钙，每周更换脱钙液1次，待腰椎脱钙完全如橡胶感后，常规石蜡包埋切片，切片脱蜡后用1%甲醇一过氧化氢液处理30 min后，0.01 mol/L的PBS冲洗，将切片放入盛有枸橼酸钠缓冲液的修复盒中，置微波炉内使容器内液体温度保持在92-98 ℃并维持12 min。冷却后经0.01 mol/L的PBS充分冲洗，山羊血清处理 30 min后，采用SPTM试剂盒进行染色，加入兔抗雌激素受体α或山羊抗雌激素受体β后置于4 ℃冰箱过夜，再加入生物素标记的二抗(37 ℃)，60 min后加入辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，孵育30 min后，二甲氨基偶氮苯(DAB)一过氧化氢显色约5 min，用0.01 mol/L的PBS充分冲洗以终止反应。

以上各步骤之间均用0.01 mol/L的PBS冲洗3次，每次5 min，阴性对照用0.01 mol/L的PBS替代第一抗体。每组动物选6只，每张切片选5个视野，应用医学图像分析仪测定阳性细胞灰度值。

1.8 主要观察指标 ELISE法测定血清雌二醇水平；免疫组织化学法检测雌激素受体α、雌激素受体β蛋白的表达。

1.9 统计学分析采用SPSS 22.0统计软件进行分析，实验结果以x(_)±s表示，进行单因素方差分析。

讨论

经典的手术切除双侧卵巢造模是目前模拟绝经后骨质疏松症比较常用的动物模型，该模型很好地模拟出人体雌激素下降造成的破骨细胞活动加速、成骨细胞功能代偿性增强的高转换型骨代谢等特点^[9]。合适月龄的选择对于绝经后骨质疏松症的实验研究十分关键，理论上去势处理后一两个月内即可进行药物干预，大多学者采用3-9个月龄的大鼠进行实验，由于成年大鼠的骨重建周期为30-40 d^[10]，但6-8个月龄大鼠更符合绝经后女性的变化规律。刘晓青等^[11]通过去势后4，12和18周的观察，发现去卵巢前4周时间内骨量降低最快，随后速度减慢。另外，己产仔的雌性大鼠，因动物在孕期和哺乳过程中，体内对钙需求高于正常，多有可能出现骨骼生长缓慢，以及影响实验中相关指标的测量。为避免上述因素的干扰，实验选择未孕6月龄大鼠去势8周后进行药物干预，骨密度测定目前是骨质疏松诊断的金标准，实验结果证实去势8周，模型组骨密度明显降低，符合人体骨质疏松病理特点。

绝经后妇女雌激素水平降低，骨量的丢失速度加快，说明雌激素在骨代谢中扮演一定角色。雌激素替代疗法已经用于临床，补充雌激素可有效地预防绝经后雌激素降低所致的骨质疏松并骨折的危险性，但同时带来一些不良反应，尤其对子宫内膜和乳腺的影响^[12]，因此，以绿色植物为出发点，结合地方特色，筛选对骨质疏松具有防治作用的植物将对骨质疏松的防治产生深远的临床和实际意义。

雌激素是人体内重要的性激素，也是重要的调节骨代谢的激素之一。妇女绝经后不光雌激素水平降低，引起雌激素受体2个亚型雌激素受体α和雌激素受体β的表达水平下降，尤其是雌激素受体α下降更为明显，进而基因转录活性进一步下降，成骨细胞凋亡加速。成骨功能减低，骨代谢偶联失衡，导致绝经后骨质疏松症的发生。英国科学家认为，雌激素受体α对维持骨骼的强度很重要，绝经后的女性骨量下降，可能是由于体内缺少雌激素受体α。人骨组织上雌激素受体的数量在一定程度上决定是否发生骨质疏松及发病的严重程度。雌激素受体数量减少越多，骨质疏松的程度就越严重^[13]。目前，对于成骨细胞雌激素受体的2个亚型与骨代谢的密切联系作了部分研究^[14]，雌激素受体以雌激素受体α和雌激素受体β2种亚型广泛存在于人体内，雌激素根据其结合的受体亚型，选择性激活细胞内信号传导途径，表现出多种生物学活性。骨稳态的维持依赖于骨形成和骨吸收之间的平衡，成骨细胞主要负责骨形成，破骨细胞主要负责骨吸收。雌激素通过与成骨细胞上的雌激素受体特异性结合，能直接促进成骨细胞功能从而促进骨形成，调节着雌激素与骨吸收、骨形成之间的关系，从而对骨代谢及骨重建起重要的调控作用。

体外实验的研究证明，雌激素通过其受体对成骨细胞的增殖、分化、对机械应变的适应性应答及其基质蛋白的合成有直接促进作用，而且成骨细胞上雌激素受体的表达依赖于细胞周期^[15]。雌激素对骨吸收的调控作用是通过某些细胞因子的介导和直接对破骨细胞调节完成的。雌激素通过雌激素受体直接诱导破骨细胞的凋亡、抑制破骨细胞的骨吸收活性^[16]。有研究给普通实验鼠注射雌激素，结果破骨细胞中启动细胞凋亡的基因变得活跃，最终导致破骨细胞死亡。而没有雌激素受体的实验鼠，其破骨细胞中的基因活动无变化，破骨细胞始终“健在”。表明雌激素借助雌激素受体作用于破骨细胞，可缩短破骨细胞的寿命，进而维持骨钙含量^[17]。可见雌激素受体在骨质疏松症的发生过程中起枢纽作用。在骨的新陈代谢中，雌激素能刺激软骨的发生、骨骺生长板融合和骨的成熟^[18-19]。

雌激素受体在骨骼细胞水平上的定位主要于成骨细胞和生长板的软骨细胞中，胞质、胞核中均有表达，而在破骨细胞和骨细胞中的表达水平较低^[20]，对成骨细胞和破骨细胞有双向调节。敲除小鼠体内雌激素受体α基因表达，可以导致小鼠骨密度明显下降^[21-22]。RLX 治疗1年可以提高绝经后女性骨质疏松症患者骨密度和降低骨转换指标，ESR1的rs3844508 位点可能与RLX 的疗效有关^[23]。因此本实验重点以雌激素受体为靶点探讨地方特色枸杞叶对骨质疏松的作用。

雌激素受体在组织水平上的分布主要在松质骨，在皮质骨中雌激素受体的表达极低，这可以解释为什么绝经后松质小梁骨的受累程度远超过皮质骨而容易造成骨折的原因。因此，本实验从松质骨占主要比重的椎体骨为实验对象研究骨质疏松显得较为科学。

枸杞是茄科植物，是补肾益精，养肝明目的中药材，其本身毒副作用小，长期以来被中医工作者们用含有枸杞的方剂治疗骨质疏松，其主要成分为枸杞多糖。近年来，枸杞多糖在治疗骨质疏松方面也引起了国内外学者的广泛关注，本课题组研究显示枸杞多糖可促进成骨细胞株的增殖和分化^[24]，枸杞多糖可能通过影响细胞内 Ca²⁺水平及Ⅰ型胶原蛋白合成防治骨质疏松症^[25]，可延缓去卵巢后的骨质丢失^[6]。枸杞叶其药效成分除枸杞多糖外，还含有黄酮类、生物碱、萜类、甾类等多种生物活性的物质^[26]。针对雌激素和雌激素受体在骨质疏松过程中的重要作用，本实验采用了放射免疫法(RIA法)检测大鼠血清中的雌二醇的水平变化和免疫组织化学法检测成骨细胞雌激素受体的表达，观察宁夏枸杞叶干预后的指标变化，具有正性作用，从分子水平进一步探讨宁夏枸杞叶有效防治绝经后骨质疏松症的作用机制。

实验结果显示去卵巢大鼠伴随体内雌激素浓度的降低，骨组织中雌激素受体α及雌激素受体β表达明显低下，说明雌激素对雌激素受体的表达具有明显的促进作用。宁夏枸杞叶可明显提高大鼠血清中雌二醇的含量。前期课题组实验证实其可明显改善骨质疏松的临床金标准骨密度，通过此次实验分析其可能的作用机制是由于宁夏枸杞叶含有黄酮，具有雌激素样作用，同时可以上调雌二醇水平，可以与雌激素受体结合，对骨代谢产生直接作用或调节骨代谢相关因素，减少骨的吸收，增加肠钙吸收增加，强化骨的形成，从而维护骨代谢平衡。还可以提高成骨细胞雌激素受体α、雌激素受体β的表达，说明其可能是通过多途径来实现其作用，推测宁夏枸杞叶可能通过提高血清雌激素水平和成骨细胞雌激素受体表达的联合作用，直接促进成骨细胞形成新骨，提高成骨细胞数量，或间接地介导胞外信号调控激酶快速激活，增加成骨细胞增殖，促进成骨细胞的分化，抑制成骨细胞凋亡，调节着雌激素与骨吸收、骨形成之间的关系，从而对骨代谢及骨重建起重要的调控作用，对因雌激素水平下降而出现成骨细胞和破骨细胞的脱偶联现象起到一定的调节作用，这可能是其防治绝经后骨质疏松症机理的一个环节。
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