纳米羟基磷灰石对缺损骨再生的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.08.002

摘要/Abstract

摘要：

背景：羟基磷灰石材料的空间结构及硬度等物理特性非常接近天然骨基质，但由于早期工艺技术问题导致其孔隙及降解性存在一定问题。

目的：比较纳米羟基磷灰石与羟基磷灰石修复大鼠胫骨离断性缺损的效果。

方法：将36只SD大鼠随机均分为4组，制作左侧胫骨5 mm离断性缺损模型，实验组于缺损处植入骨髓间充质干细胞/纳米羟基磷灰石复合体，对照组于骨缺损处植入骨髓间充质干细胞/羟基磷灰石复合体，细胞组于骨缺损处植入骨髓间充质干细胞，空白对照组不植入任何物质。术后2，8，12周时，X射线检测缺损区骨修复情况，苏木精-伊红染色观察成骨情况，免疫印迹技术检测修复区域Ⅰ型胶原蛋白表达情况。

结果与结论：术后12周，实验组可见新生骨痂覆盖整个缺损区且形成明显的桥接，材料大部分已降解，可见大量的骨样组织并形成小梁，已形成板层骨样结构，Ⅰ型胶原蛋白大量表达；对照组骨缺损处骨痂形成增多，断端整合性不佳，有骨质硬化现象，仍然有较多材料未降解，可见骨小梁样结构，亦有板层骨结构，Ⅰ型胶原蛋白大量表达，但弱于实验组；细胞组、空白对照组骨缺损处未见骨性修复，Ⅰ型胶原蛋白弱表达。表明纳米羟基磷灰石促进骨缺损修复效果优于羟基磷灰石。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 骨生物材料, 羟基磷灰石, 支架, 大鼠, 骨髓间充质干细胞, 骨缺损

Abstract:

BACKGROUND: Hydroxyapatite materials have similar spatial structure and hardness to the natural bone matrix, but due to the imperfect early technology, there are some problems in the pore and degradation.

OBJECTIVE: To compare the effects of nano-hydroxyapatite materials and hydroxyapatite materials in the repair of disconnected defects of the tibia in rats.

METHODS: Thirty-six Sprague-Dawley rats were randomized into four groups, and a 5 mm disconnected defect model was established in the left tibia. Bone marrow mesenchymal stem cells/nano-hydroxyapatite complex was implanted into the experimental group, bone marrow mesenchymal stem cells/hydroxyapaptite complex into the control group, and bone marrow mesenchymal stem cells into the cell group. There was no treatment in the blank control group. At 2, 8, 12 weeks after implantation, X-ray measurement, hematoxylin-eosin staining, western blot assay were used for observation of bone repair, osteogenesis, and expression of type I collagen in the repair area.

RESULTS AND CONCLUSION: After 12 weeks of implantation, in the experimental group, the newborn calluses covered the whole defect region and formed visible bridge connections, the scaffold was degraded mostly, a great amount of osteoid tissues were visible to form the bone trabecula with lamellar bone structure, and there were a lot of type I collagens; in the control group, the number of calluses in the defect area was increased, poor integration was found at the broken end, bone sclerosis developed, the scaffold was not completely degraded, bone trabecula and lamellar bone formed, and a large amount of type I collagen was visible but lower than that in the experimental group; in the cell group and blank control group, no obvious bone regeneration was seen, and the expression of type I collagen was weak. These findings suggest that nano-hydroxyapatite is better than hydroxyapatite to promote bone regeneration.

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Key words: Nanoparticles, Hydroxyapatites, Stem Cells

中图分类号:

R318

宋华，任向前，未东兴. 纳米羟基磷灰石对缺损骨再生的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(8): 1155-1159.

Song Hua, Ren Xiang-qian, Wei Dong-xing. Nano-hydroxyapatite effects on bone regeneration[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(8): 1155-1159.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析 36只SD大鼠均进入结果分析。

2.2 纳米羟基磷灰石支架材料内部结构特征 纳米羟基磷灰石支架材料表面光滑，微粒结合紧密，彼此对齐，外观规则，其弹性、柔韧性及连续性较好，质地均匀。扫描电镜观察材料的内部结构发现，内部充满大小较为均一、球形的孔隙，孔隙直径为140-190 μm；孔与孔间还可见更小的孔隙互为连接贯通，其直径为10-35 μm，平均22 μm；孔壁为质地均匀的羟基磷灰石颗粒，紧密且连续(图1)。

2.3 术后骨缺损区形态学及组织学观察

术后2周时：实验组、对照组支架网孔内可见大量细胞，细胞组、空白对照组未见有任何成骨样结构，有少量结缔组织。

术后8周时：实验组、对照组移植物内开始有新生微血管生成，可看到成熟的骨组织向内部生长，同时出现骨髓结构和血管，支架材料已经部分降解，可见新生的类骨质形成，骨单位结构清晰，可见骨细胞发育良好，细胞排列紧密，并出现骨陷窝；细胞组、空白对照组缺损处除有结缔组织长入外，没有明显的成骨痕迹。

术后12周时：实验组支架材料大部分已降解，可见大量的骨样组织并形成小梁，已经形成板层骨样结构(图2A)；对照组仍然有较多支架材料未降解，出现骨小梁样结构，亦有板层骨结构(图2B)；细胞组仅在边缘有少量骨板形成，可见大量结缔组织填充(图2C)；空白对照组缺损处几乎全部被纤维组织填充，缺损处仍无骨组织(图2D)。

2.4 术后骨缺损区X射线结果 实验组术后2周时胫骨缺损处略见骨痂形成，呈薄云雾状；8周时缺损区两端可见明显的新生骨痂，12周时整个缺损区均可见新生骨痂且新骨密度增高，形成明显骨缺损区的桥接(图3A)。对照组术后2周时骨缺损区无明显变化，8周时仅在两断端有少量的云雾状骨痂形成，12周时骨缺损区骨痂形成增多，但仍未出现桥接，可见两端有骨质硬化现象(图3B)。细胞组、空白对照组骨缺损处未见骨性修复(图3C)。

2.5 免疫印记检测结果 术后2周时，实验组、对照组可见Ⅰ型胶原蛋白表达，细胞组、空白对照几乎没有表达； 8周时，实验组、对照组Ⅰ型胶原蛋白表达明显增加，细胞组Ⅰ型胶原蛋白表达较弱，D组未检测到，Ⅰ型胶原蛋白表达量实验组> 对照组> 细胞组> 空白对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；12周时，实验组、对照组可见大量的Ⅰ型胶原蛋白阳性表达，细胞组、空白对照组Ⅰ型胶原蛋白表达较弱(图4)，各组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

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引言

材料方法

设计：随机分组动物对照实验。

时间及地点：实验于2013年12月至2014年8月在辽宁医学院人体解剖学实验室完成。

材料：

实验动物：4月龄健康雄性SD大鼠36只，SPF级，体质量210-240 g，由辽宁医学院实验动物中心提供。实验动物使用符合国际实验动物管理规定。将36只大鼠随机均分为4组，分别为实验组、对照组、细胞组与空白对照组。

实验方法：

大鼠骨髓间充质干细胞培养：将购买的大鼠骨髓间充质干细胞按说明书要求进行复苏，按1×10⁸L^-1细胞浓度置于含有体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基中，在 37 ℃、体积分数5% CO₂、饱和湿度的二氧化碳孵箱中培养扩增。48 h后换液，以后每三四天半量换液1次。当细胞达到90%融合时以0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合液消化进行传代。

纳米羟基磷灰石凝胶的制备：将纳米羟基磷灰石与聚乙烯亚胺按3∶2混合制成凝胶，再将凝胶与发泡剂聚氧乙烯十二烷基醚(1%)混合搅拌直到出现泡沫状外观，加入水溶性的交联剂多功能环氧化合物凝固泡沫状的凝胶，将混合物倒入模具中。成型后从模具中取出，干燥并在1 250 ℃下热凝结。非纳米级羟基磷灰石支架按照传统方法制备^[8]。

扫描电镜观察：将纳米羟基磷灰石表面喷金处理后置于扫描电镜下，20 kV加速电压下摄片观察。每种支架取样3次，扫描电镜图中随机选择6个孔，测量每孔大小，经过统计分析获得支架的平均孔径。

骨髓间充质干细胞与纳米羟基磷灰石或羟基磷灰石复合：将制备好的纳米羟基磷灰石或羟基磷灰石修剪成直径 3 mm、长5 mm的柱状体，将其与培养的第3代骨髓间充质干细胞于培养皿内继续培养。3 d后取出进行移植实验。

大鼠胫骨缺损模型制备与分组干预：10%水合氯醛 (3 mL/kg)腹腔麻醉后，无菌条件下暴露36只大鼠左侧胫骨，从中段制成5 mm节段性缺损，实验组于缺损处植入骨髓间充质干细胞/纳米羟基磷灰石复合体，对照组于骨缺损处植入骨髓间充质干细胞/羟基磷灰石复合体，细胞组于骨缺损处植入骨髓间充质干细胞。空白对照组空置缺损直接缝合皮肤。各组均不做内外固定，逐层缝合伤口。

X射线检测修复情况：于术后2，8，12周将动物用戊巴比妥那麻醉，充分伸展下肢，摆放于X射线阻隔板上，选择合适强度进行曝光。

组织学检测：于术后2，8，12周分别将每组实验动物处死3只，大体观察手术区域组织修复外观，将胫骨剪下于40 g/L多聚甲醛固定，EDTA脱钙3周后，包埋制成石蜡组织块，切片5 μm厚，行苏木精-伊红染色。

免疫印记法分析：剪碎胫骨组织，加入蛋白酶抑制剂后超声粉碎，离心，取上清，煮沸，BCA法蛋白定量。上样10 μL，聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭，加入兔抗Ⅰ型胶原蛋白抗体(1∶500) 4 ℃过夜，β-actin为内参。加入HRP标记的羊抗兔二抗(1∶200)室温孵育1 h，ECL显色并拍照。

主要观察指标：各组X射线检测与组织学检测结果。

统计学分析：所有数据处理采用SPSS 16.0软件包进行统计分析，计量资料以x(_)±s表示，采用t 检验方法，以P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

骨缺损尤其是大块骨缺损修复需要良好支持细胞生长的桥接材料^[8]。目前作为商品化的骨组织工程支架材料主要为羟基磷灰石等^[9]。大量实验表明，羟基磷灰石支架能够在动物甚至是人体内起到桥接作用，促进并成功修复大块骨缺损，可以说羟基磷灰石支架的发明和使用是骨科临床上的一大进步。但是在长期应用过程中发现羟基磷灰石支架自身有一定的缺点，如体内降解速度不均一、硬度过大、柔韧性欠佳等。因此优化羟基磷灰石的优点，同时改善其缺点是最现实并可行的解决方案。理想的人工复合植骨材料应具有与机体组织较好的相容性、生物降解性及生物活性等，符合骨组织无机成分要求^[10-11]。近年来，向羟基磷灰石支架中添加有机活性成分的研究越来越多，在一定程度上对修复时间和修复效果都有所改善，但这些都处于实验阶段，要应用到临床还有一段时间。

本实验扫描电镜观察纳米羟基磷灰石可见材料表面多孔且广泛联通，特别是支架内部广泛存在大的交通孔，而这有利于骨和基质形成^[12-14]。由于实验中材料是纳米级别的，这些羟基磷灰石粉末在形成多孔支架的同时，其孔壁质地较传统羟基磷灰石均匀，且能提供良好的支撑力，因此在修复及降解过程中能够提供均匀的降解速度，不会出现局部支架先降解塌陷而失去桥接作用的现象。实验将支架移植大鼠胫骨缺损区后，局部组织无炎性增生，局部伤口愈合良好，这说明纳米羟基磷灰石支架具有很好的组织相容性^[15-16]。有报道认为骨髓间充质干细胞能够抑制炎症反应，本实验未对该理论进行验证研究，但是从各组结果看，移植骨髓间充质干细胞的组炎症反应确实比空白对照组要好很多。从降解速度上看，术后2周时支架形态保持良好，但内部已经出现较均匀的孔壁塌陷和降解，无大范围的羟基磷灰石支架塌陷，因此本纳米羟基磷灰石支架在实际应用中表现出了结构的均匀一致性。8周后支架降解较快，同时在切片上已经发现有大量新生骨组织出现，取代了原来塌陷的位置。12周时，实验组材料已大部分降解，同时具有良好骨板结构的骨组织在原位修复了骨缺损，说明纳米羟基磷灰石支架材料的降解速率和时间与骨组织形成时间很匹配^[17]。

一些实验显示，具有成骨潜能的种子细胞与支架材料复合有较强的成骨能力^[18-19]。本实验应用骨髓间充质干细胞联合纳米羟基磷灰石支架对大鼠胫骨缺损进行修复。

5 mm骨缺损长度对于大鼠属大块骨缺损，由于缺损长度较大且局部的原始骨髓间充质干细胞数量较少，无法满足成骨需要，造成成骨与材料的吸收速率失调^[20-21]。骨髓间充质干细胞/羟基磷灰石复合体引入了大量的外源性成骨性细胞，三维载体材料可以为植入细胞提供并保持一个生长的空间微环境，促使细胞增殖分化，加速对缺损骨的重建。骨髓间充质干细胞移植后在大鼠体内生长情况良好，从对骨缺损修复时间和局部成骨效果看，实验组最好，对照组次之，细胞组和空白对照组未能修复。与传统的羟基磷灰石支架相比，纳米羟基磷灰石复合骨髓间充质干细胞能够更好地修复大鼠5 mm离断性骨缺损，这说明纳米羟基磷灰石材料具有更佳的理化特性及支持骨再生的能力。另外从移植物和宿主骨的整合性方面来说，纳米羟基磷灰石材料与宿主骨整合更好。细胞组未能修复骨缺损，说明单纯的骨髓间充质干细胞虽然有成骨能力，但对于较大的离断性骨缺损必须有支架等桥接物支撑，否则不能修复节段性骨缺损。本实验使用骨髓间充质干细胞联合纳米羟基磷灰石支架移植，其成骨修复效果明显优于其他各组。

采用纳米羟基磷灰石能够较好修复大块骨缺损，在修复过程中无明显炎症反应及其他不良反应，这为下一步在临床患者身上使用新型产品提供了理论依据，由于羟基磷灰石支架在临床上的应用很成熟，因此改进的羟基磷灰石材料应该很快被临床接受并认可。

纳米羟基磷灰石材料具有比传统羟基磷灰石材料更均匀一致的结构，以及互为交通的多孔隙，在动物体内能够较好地降解，同时又引导细胞修复骨缺损。本实验的创新之处在于，应用骨髓间充质干细胞复合纳米羟基磷灰石支架对大鼠5 mm离断胫骨缺损进行了修复，实验结果发现该修复方案在修复速度及效果上较单纯细胞组要好，这启发人们大块离断性骨缺损是有可能被修复的，为临床上因外伤及骨肿瘤造成的大块骨缺损提供了治疗方向。

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