鼠胎肝干细胞生物学特性与人端粒酶反转录酶基因介导的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.06.001

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究表明，感染人端粒酶反转录酶基因后的干细胞具有稳定表达高水平端粒酶活性，且能使细胞增殖旺盛，这为建立基因工程的永生化干细胞系奠定了基础。
目的：探讨人端粒酶反转录酶基因感染对体外培养鼠胎肝干细胞增殖及细胞周期的影响。
方法：体外培养鼠胎肝干细胞，经重组腺相关病毒作为载体介导人端粒酶反转录酶基因感染，用RT-PCR、Western blot检测鼠胎肝干细胞人端粒酶反转录酶基因和蛋白的表达，CCK-8法、细胞生长曲线检测细胞生长增殖情况，流式细胞仪测定细胞周期分布的变化。
结果与结论：与对照组、空载病毒组相比，基因感染组人端粒酶反转录酶基因和蛋白水平均有表达，细胞的生长速度明显增快，G0/G1期细胞减少，S期细胞数增多。结果表明以重组腺相关病毒作为载体介导人端粒酶反转录酶基因感染能促进体外培养的鼠胎肝干细胞增殖，对其培养有优化作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 胚胎干细胞, 端粒酶反转录酶, 基因感染, 鼠胎肝干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that stem cells transfected with human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene can stably express high-level telomerase activity and strengthen cell proliferation, which lays the foundation to establish genetically engineered immortalized stem cell lines.
OBJECTIVE: To explore the effects of hTERT transfection on proliferation and cell cycle of rat fetal liver stem cells in vitro.
METHODS: Rat fetal liver stem cells cultured in vitro were transfected by recombinant adeno-associated virus carrying hTERT genes. RT-PCR and western blot assay were used to detect the expression of hTERT mRNA and protein, respectively. Cell Counting Kit-8 method and cell growth curve were used to detect cell growth and proliferation. Changes in cell cycle distribution were determined by flow cytometry.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group and empty virus group, in the hTERT infection group, hTERT expressed at gene and protein levels, the growth rate of the cells increased, and the number of cells at G0/G1 phase and S phase was decreased and increased, respectively. The results show that recombinant adeno-associated virus as a vector of hTERT gene used for gene transfection can promote the in vitro proliferation of rat fetal liver stem cells and play an optimal role in cell culture.

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Key words: Liver, Stem Cells, Gene Transfer Techniques, Cell Proliferation, Cell Cycle

中图分类号:

R394.2

任立刚，戴向晨. 鼠胎肝干细胞生物学特性与人端粒酶反转录酶基因介导的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(6): 821-825.

Ren Li-gang, Dai Xiang-chen . Human telomerase reverse transcriptase-mediated effects on biological characteristics of rat fetal liver stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(6): 821-825.

图/表（结果） 3

2.1 鼠胎肝干细胞的形态观察原代培养第1天可见细胞呈贴壁生长，胞体呈圆形或卵圆形，胞质可见清晰，核较大，核质比高。培养的胎肝细胞以较快速度不断的分裂增殖，至第3天时形成由3-5个细胞组成的细胞团，第7天细胞数量生长增至6-10个，在培养30 d左右时即形成肉眼所见的细胞集落，见图1。

经流式细胞仪对鼠胎肝干细胞进行检测鉴定，结果显示上皮细胞黏附分子和CD133高表达，证明了鼠胎肝干细胞的存在。

2.2 各组细胞hTERT蛋白表达重组腺相关病毒作为载体介导的hTERT基因感染48 h后，hTERT基因感染组的鼠胎肝干细胞检测到hTERT蛋白表达明显，而对照组和空载病毒组hTERT蛋白无表达，说明hTERT基因已稳定表达入感染鼠胎肝干细胞的基因组中，且目的蛋白稳定表达，见图2。

2.3 各组细胞hTERT mRNA表达 PCR产物电泳检测鉴定结果表明，作为载体的重组腺相关病毒所介导的hTERT基因在感染48 h后，hTERT感染组鼠胎肝干细胞检测到有hTERT mRNA的表达，而对照组、空载病毒组无hTERT mRNA表达，证明了hTERT基因已稳定整合入鼠胎肝干细胞的基因组中，见图3。

2.4 CCK-8检测细胞生长情况重组腺相关病毒作为载体介导的hTERT基因在感染48 h后，与对照组(0.16±0.04)、空载病毒组(0.16±0.01)相比较，hTERT感染组(0.27±0.03)鼠胎肝干细胞的吸光度值显著升高，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.5 细胞周期分布重组腺相关病毒作为载体介导的hTERT基因在感染48 h后，与对照组、空载病毒组相比较，hTERT感染组的S期细胞明显增多；而与对照组、空载病毒组相比较，G₁期细胞在hTERT感染组明显减少，差异有显著性意义(P < 0.05)，M期细胞无明显变化。各组细胞周期的变化比较，见表1。

2.6 细胞生长曲线与对照组、空载病毒组比较，hTERT感染组鼠胎肝干细胞的增殖能力显著增强，3组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2，图4。

参考文献

[1] 王开利,迟淑萍,孙杰,等.外源hTERT基因对人肝细胞增殖及CYP45019A1表达的影响[J].军医进修学院学报, 2011,32(11): 1137-1138.
[2] 靳斌,王伟,刘泽阳,等.外源hTERT基因转染对老年大鼠供肝缺血再灌注损伤的防护作用[J].山东大学学报:医学版, 2013, 51(8):13-16.
[3] 孙来保,李成荣,文建明,等.反义hTERT基因对白血病细胞端粒酶表达及活性的抑制作用[J].中华病理学杂志,2004,33(5): 454-457.
[4] 刘云燕,裘秀春,张殿忠,等. hTERT 反义寡核苷酸对脊索瘤细胞周期及增殖的影响[J].现代肿瘤医学, 2011,19(10):1922-1924.
[5] Röth A, Vercauteren S, Sutherland HJ,et al.Telomerase is limiting the growth of acute myeloid leukemia cells.Leukemia. 2003;17(12):2410-2417.
[6] Akiyama M, Yamada O, Kanda N, et al. Telomerase overexpression in K562 leukemia cells protects against apoptosis by serum deprivation and double-stranded DNA break inducing agents, but not against DNA synthesis inhibitors. Cancer Lett. 2002;178(2):187-197.
[7] 肖扬,张洹.端粒酶HTR反义寡核苷酸对K562细胞端粒酶活性的影响[J].临床血液学杂志,2003,16(1):23 -25.
[8] 吴灵芝,李水彬,程刚卫,等. hTERT基因转染对人神经元活力的影响[J].赣南医学院学报,2014,34(2):170-173.
[9] 杨胜生,曾志勇,程先进,等.胸腺瘤组织中端粒酶活性检测的意义[J].现代肿瘤医学, 2010,18(3):505-506.
[10] 张晓辉,张建宁,康春生,等. hTERT正、反义表达载体转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究[J].中华神经医学杂志,2006,5(3): 217-221.
[11] Autexier C, Lue NF.The structure and function of telomerase reverse transcriptase.Annu Rev Biochem. 2006;75:493-517.
[12] Greider CW.Telomere length regulation.Annu Rev Biochem. 1996;65:337-365.
[13] Karlseder J, Smogorzewska A, de Lange T.Senescence induced by altered telomere state, not telomere loss.Science. 2002;295(5564):2446-2449.
[14] Yamada O, Mizoguchi H.Telomere and telomerase in the differentiation of leukemic cell lines.Nihon Rinsho. 1998;56(5): 1322-1327.
[15] 李梅凤,方美云,王一.质粒介导RNAi靶向hTERT抑制K562细胞端粒酶活性的研究[J].中国实验血液学杂志,2008,16(1):54-60.
[16] Park Y, Chen Y, Ordovas L,et al.Hepatic differentiation of human embryonic stem cells on microcarriers.J Biotechnol. 2014;174:39-48.
[17] Zamule SM, Coslo DM, Chen F, et al. Differentiation of human embryonic stem cells along a hepatic lineage.Chem Biol Interact. 2011;190(1):62-72.
[18] Ishkitiev N, Yaegaki K, Imai T, et al. High-purity hepatic lineage differentiated from dental pulp stem cells in serum-free medium. J Endod. 2012;38(4):475-480.
[19] 赵矫,曾永秋,税青林,等. siRNA表达载体对MCF-7细胞生长及其hTERT基因表达抑制的研究[J].解放军医学杂志,2008,33(3): 246-249.
[20] 张志宏,曾永秋,税青林,等. hTERT-siRNA表达载体的构建及对MCF-7细胞生长、端粒酶活性的抑制作用[J].解放军医学杂志, 2007,32(6):561-564.
[21] 张洁,廖亚平,吴灵芝,等. hTERT基因转染对人胚胎大脑皮质神经元生长的影响[J].解剖学研究,2008,30(4):251-254,260.
[22] 孙冰,安靓. 胎肝干细胞的分离、培养与鉴定[J]. 中国组织化学与细胞化学杂志, 2006, 15(1): 49-53.
[23] 李宏良,曾荣香,陈鹏,等.清毒片和hTERT反义核酸对HL-60细胞增殖及凋亡的协同作用[J].辽宁中医杂志,2010,7(3):395-398.
[24] 宋扬,徐韬,杨明坤,等. RNA干扰端粒酶反转录酶基因慢病毒表达载体的构建及鉴定[J]. 中国组织工程研究,2014,18(11): 1724-1729.
[25] 万世奇,张太平,王天笑.重组腺相关病毒载体表达抗表皮生长因子受体抗体对胰腺癌细胞株抑制作用的研究[J].中华消化外科杂志,2011,10(4):286-289.

引言

材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：于2013年1月至2014年9月在天津医科大学研究生完成。

材料：

实验动物：成年F344大鼠由天津医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK(津)2010-002。

人端粒酶反转录酶基因感染后鼠胎肝干细胞生物学特性检测所用主要试剂和仪器：
试剂和仪器	来源
rAAV-hTERT及空载rAAV	本元正阳基因技术股份有限公司
L-DMEM培养基	美国Hyclone公司
胎牛血清	美国Gibco公司
RT-PCR两步法试剂盒	北京赛百盛基因技术有限公司
AMV反转录试剂盒	北京天根生化有限公司
耐热性TaqDNA 聚合酶	杭州博日
端粒酶反转录酶(hTERT)	美国Hyclone公司
β-actin兔抗人多克隆抗体和辣根酶标记山羊抗兔IgG 抗体	美国Thermo公司
兔抗人成纤维细胞因子多克隆抗体、山羊抗兔抗体	美国Abcam公司
胰蛋白酶	GibcoBRL公司
Western blot蛋白检测试剂盒	美国KPL公司
CCK-8试剂盒	北京博奥森公司
细胞周期检测试剂盒	美国Becon Dickinson公司
流式细胞仪	美国Bio-Rad公司

实验方法：

胎肝细胞培养：将F344大鼠按2∶1的雌雄比合笼混养在一起，每天定时观察雌鼠，阴栓检出日作为受孕第1天，于无菌条件下选取14 d胎龄的胎鼠并分离胎肝。参考文献[4]利用Percoll不连续梯度离心法从大鼠胎肝内提取胎肝细胞并贴壁培养。应用胰蛋白酶差速消化和差速贴壁法将培养基中的胎肝细胞纯化。培养3代后，采取Percoll连续梯度离心法把细胞分为6个层次。选取第1，2层细胞，用流式细胞仪进行鉴定。

rAAV-hTERT感染：取生长良好的第3代鼠胎肝干细胞，培养在含体积分数为10%小牛血清的DMEM培养基中，置饱和湿度，体积分数为5%CO₂，37 ℃恒温密闭式培养箱中培养。每2 d传代1次。实验时取对数生长期的细胞，按6×10⁴/孔将鼠胎肝干细胞接种于24孔板中，于3 d后进行rAAV -hTERT感染：弃掉培养液，用PBS洗涤2次，从瓶内吸取残余的培养液，按感染倍数(multiple infection，MOI)为10⁵加入无血清的L-DMEM培养基稀释的rAAV-hTERT，使其彻底覆盖细胞培养面积，在37 ℃恒温下孵育2 h，之后分别加入适量胎牛血清和L-DMEM培养基，按常规贴壁细胞培养方法继续培育1周后进行下列实验。在检测前3 d勿更换细胞培养液。另在同等条件下设置空载病毒感染组和正常细胞对照组。

Western blot检测hTERT蛋白的表达：将每组细胞悬液分别经离心半径16 cm，800 r/min离心5 min，收集目的细胞，细胞弃培养液后加400 μL蛋白裂解液，提取总蛋白，行Bradford法测定蛋白的浓度。5%浓缩胶40 V衡压1 h，10%分离胶60 V恒压3.5 h，湿转14 V恒压14 h，37 ℃摇床封闭2 h，兔抗人成纤维细胞因子多克隆抗体1∶800，37 ℃摇床孵育2 h，TBST洗膜，5 min/次，共4次，山羊抗兔抗体1∶700，37 ℃摇床孵育1.5 h，TBST洗膜，5 min/次，共4次。二甲基联苯胺显色。经3次重复实验后行Quantity one图像分析。评定蛋白的表达水平以目的条带与β-actin条带吸光面积积分的比值来表示。

RT-PCR检测hTERT基因的表达：按照Trizol试剂盒说明书介绍的方法提取各组细胞的总RNA，采用紫外分光光度计测定RNA的含量，根据反转录合成试剂盒说明书进行反转录。引物设计：hTERT上游引物为5’-CTG AAG TGT CAC AGC CTG TTT-3’，下游引物为5’-CAC ACA TGC GTG AAA CCT GTA-3’，产物大小111 bp；β-actin上游引物为5’-TAT CGG ACG CCT GGT TAC-3’，下游引物为5’ - CTC AGC CTT GAC TGT GCC-3’，产物大小151 bp。PCR反应条件：95 ℃变性5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，循环36周期，72 ℃延伸7 min。产物于4 ℃保存。每一PCR反应重复3次。取PCR产物进行电泳，以β-actin作为内参照。电泳后置GDSS000凝胶自动成像仪上拍照提取图像，Image-Pro Plus 8.0软件分析hTERT条带与β-actin条带的灰度相对比值，进行mRNA半定量分析。

CCK-8检测胎肝干细胞生长情况：将鼠胎肝干细胞按1×10⁴/孔接种在96孔板上，分为对照组、空载病毒组、hTERT感染组，每组设3个平行孔，于37 ℃，体积分数为5%CO₂细胞培养箱中培养48 h后，弃掉细胞培养液，生理盐水漂洗1遍。每孔加入CCK-8试剂100 μL，于培养箱温育2 h。用CCK-8法检测细胞生长情况，在酶标仪上测定波长450 nm时的吸光度值，以630 nm作为参考波长，计算每个时间点上吸光度的平均值。实验重复3次。

流式细胞仪检测胎肝干细胞DNA的含量分布：收集3组细胞，把细胞浓度调整为1×10⁶ L^-¹，经冷PBS洗涤2次后，用体积分数为70%的冷乙醇(4 ℃)固定24 h。洗涤细胞后与含10 mg/L RNA酶的pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液共同孵育30 min。用碘化丙啶(PI)(50 mg/L)进行细胞的DNA染色，放置暗室中1 h，经流式细胞仪检测细胞DNA的含量分布，并计算出各周期细胞所占的百分比。

生长曲线测定：将各组胎肝干细胞分别制成单细胞悬液，计数后按1.6×10⁴/孔浓度接种于24孔板上，每组设3个复孔，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂孵箱培养。在培养的第2天起，每天同一时间消化每组细胞3个孔，进行精确计数，连续5 d后绘制各组细胞的生长曲线图。

主要观察指标：①鼠胎肝干细胞hTERT基因和蛋白的表达。②鼠胎肝干细胞生长增殖情况。③鼠胎肝干细胞周期分布的变化。

统计学分析：数据用SPSS 13.0软件包处理。计量资料以x(_)±s表示，两组间连续变量比较用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析及q 检验(即Newman-kueuls法)，以 P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

特定条件下胎肝干细胞具有双向分化潜力，可分化成肝细胞、胆管细胞，易于体外扩增；不存在组织配型和免疫排斥，参与了体内损伤组织和器官的修复过程，是肝细胞的重要来源^[7-8]，亦是基因治疗的理想靶细胞^[9-11]。肝干细胞移植作为一种新的治疗方法，已受到研究人员们的关注^[12-15]。而如何高效安全地将目的基因导入靶细胞是进行基因治疗成功的关键^[16-18]。作为一种基因导入载体，重组腺相关病毒载体具有免疫原性低、致病性低、潜伏感染、安全性好、定向插入、安全可靠、简单易行等优点，已是目前基因工程研究的热点之一^[19-21]。

hTERT是调控端粒酶活性的主要因素，具有多重生物学效应和重要的临床价值，能促进胚胎组织发育、分化及细胞生长、增殖和分化。研究表明，hTERT基因的siRNA表达载体能与靶基因进行有效结合，且能降解hTERTmRNA，减低端粒酶活性，使hTERT蛋白的表达下调，进而导致细胞生长抑制，增殖速度减低。但是由于其半衰期较短、组织含量较低等原因，使得外源性hTERT通过局部或全身给予均难以达到理想的治疗目的^[22-23]；而基因转入技术采用适合的载体将外源性hTERT基因转入体内，可持续表达hTERT，使其能够发挥长期、高效的作用，以达到理想的治疗效果^[24]。

在组成端粒酶的3个亚单位hTR、hTP1和hTERT中，hTERT基因是端粒酶的主要限速成分。但由于在正常体细胞中，hTERT不表达，其端粒酶不表达，端粒长度将随着有丝分裂次数的增加而逐渐缩短，最终导致细胞衰老死亡。本研究中观察发现，细胞在感染48 h后即有基因产物的表达。RT-PCR和Western blot发现外源性hTERT感染培养的鼠胎肝干细胞中hTERT基因在mRNA和蛋白水平的表达显著增强，提示外源性的hTERT基因转染可以促进鼠胎肝干细胞中hTERT基因的表达，但不影响其他端粒酶亚单位的表达。经统计学分析发现感染hTERT组G₀/G₁期细胞明显减少，说明了hTERT感染组鼠胎肝细胞大多处于增殖期，缩短了细胞周期，增强其增殖能力^[25]。细胞生长曲线结果表明hTERT基因感染鼠胎肝干细胞的生长速度明显增快。

综上所述，转染hTERT基因后的鼠胎肝干细胞扩大培养后，生长旺盛，增殖周期缩短，端粒酶活性明显升高，目的基因在靶细胞得到持续高效表达，可见重组腺相关病毒作为载体介导hTERT基因感染体外培养的鼠胎肝干细胞，能促进鼠胎肝干细胞自身高效增殖，与外源性生长因子相比具有更高的生物活性，其对鼠胎肝干细胞培养有优化作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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