神经干细胞缺氧/复氧损伤中的低氧诱导因子1α和诱导型一氧化氮合酶

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.06.002

摘要/Abstract

摘要：

背景：在缺氧状态可诱导机体产生缺氧诱导因子，而诱导型一氧化氮合酶表达产生的一氧化氮(NO)可抑制低氧诱导因子1α的活性。
目的：探索低氧诱导因子1α、诱导型一氧化氮合酶与神经干细胞的低氧/复氧损伤关系。
方法：无菌条件下将出生24 h以内的Wistar大鼠处死，并分离大鼠海马组织，制作成脑组织的细胞悬液，分离培养神经干细胞后，将细胞分为常氧组、低氧组及低氧-复氧组，后两组以150 μmol/L氯化钴溶液制备低氧模型，而后低氧-复氧组细胞在低氧4 h时复氧。
结果与结论：低氧条件下，神经干细胞凋亡数量及细胞中低氧诱导因子1α和诱导型一氧化氮合酶 mRNA表达水平增加；而缺氧-复氧组中凋亡神经干细胞数量高于缺氧组，但低氧诱导因子1α和诱导型一氧化氮合酶mRNA表达水平低于缺氧组。说明这两种因子参与细胞低氧损伤过程。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 神经干细胞, 低氧诱导因子, 诱导型一氧化氮合酶, 神经干细胞, 细胞分化, 增殖, 细胞凋亡, 免疫调节因子, 细胞毒性因子

Abstract:

BACKGROUND: Organism in the hypoxic state can produce hypoxia-inducible factor, but nitric oxide generated from inducible nitric oxide synthase can inhibit the activity of hypoxia-inducible factor 1α.
OBJECTIVE: To discuss the relationship of hypoxia-inducible factor 1α and inducible nitric oxide synthase with hypoxia/reoxygenation injury in neural stem cells.
METHODS: Under sterile conditions, Wistar rats born within 24 hours were sacrificed to separate the rat hippocampus that was used to prepare a cell suspension of brain tissue. After culture and passage, neural stem cells were divided into normoxia, hypoxia and hypoxia/reoxygenation groups. In the latter two groups, 150 μmol/L cobalt chloride solution was used to prepare hypoxia models, and in the hypoxia/reoxygenation group, the cells were reoxygenated after 4-hour hypoxia.
RESULTS AND CONCLUSION: Under hypoxic conditions, a significant increase in mRNA expressions of hypoxia-inducible factor 1α and inducible nitric oxide synthase as well as the number of apoptotic neural stem cells. Compared with the hypoxia group, the number of apoptotic neural stem cells was higher in the hypoxia/reoxygenation group, but the mRNA expressions of hypoxia-inducible factor 1α and inducible nitric oxide synthase were lower. These findings indicate that these two factors are involved in the hypoxia/reoxygenation injury of neural stem cells.

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Key words: Nitric Oxide Synthase, Anoxia, Neural Stem Cells, Cytokines

中图分类号:

R394.2

李莹. 神经干细胞缺氧/复氧损伤中的低氧诱导因子1α和诱导型一氧化氮合酶[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(6): 826-831.

Li Ying. Role of hypoxia-inducible factor 1 alpha and inducible nitric oxide synthase in neural stem cells during hypoxia/reoxygenation injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(6): 826-831.

图/表（结果） 3

2.1 神经干细胞的鉴定结果光镜下，培养12 h时，原代神经干细胞开始聚集；第3天神经干细胞聚集成球形；第4天神经细胞球大量悬浮在溶液中，呈半透明状，表面较为光滑。7 d时，单个细胞饱满呈圆形，细胞边界清晰，内部可见颗粒状结构(图2A)。传代后，神经细胞球数量增加，且细胞浆内可见致密的颗粒样物质，且免疫组化染色显示

细胞表达Nestin(图2B)。

2.2 低氧及缺氧-复氧神经干细胞神经干细胞的形态及凋亡免疫荧光染色显示，缺氧4，8 h后神经干细胞的形态无明显变化，12 h后神经干细胞肿胀特别明显，细胞内较前浑浊，折光性差，可见小的细胞碎片，缺氧-复氧组中凋亡神经干细胞数量及平均吸光度值明显高于缺氧组，且2组凋亡神经干细胞数量及平均吸光度值均随时间的延长而增加(图3，表1)。

2.3 低氧和复氧条件下神经干细胞增殖的变化低氧4 h后，神经干细胞球的数量略有增加；8 h后神经干细胞球的数量较常氧组增加明显，神经干细胞球密度增大，细胞球排列更为致密，且神经球数量比常氧组增多2倍；而后神经球数量逐渐减少。复氧8 h后，随着时间的增加，神经球的数量减少更加明显(图4)。

2.4 低氧和复氧条件下神经干细胞中低氧诱导因子1α与诱导型一氧化氮合酶 mRNA表达水平的变化反转录PCR检测结果显示，各组神经干细胞中均存在低氧诱导因子1α与诱导型一氧化氮合酶mRNA的表达，缺氧组神经干细胞中低氧诱导因子1α与诱导型一氧化氮合酶mRNA的表达分别于缺氧8，12 h达到峰值，而后均逐渐下降，且分别在4-12 h和8-16 h时高于常氧组(P < 0.05)；而缺氧-复氧组神经干细胞中低氧诱导因子1α与诱导型一氧化氮合酶mRNA的表达分别于缺氧8，4 h达到峰值，而后均逐渐下降，且其中低氧诱导因子1α mRNA表达在缺氧-复氧4，8 h高于常氧组(P < 0.05；图5，表2，3)。

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引言

材料方法

设计：随机对照细胞实验。

时间及地点：实验于2011年3月至2012年12月在佳木斯大学实验动物中心完成。

材料：

低氧、复氧神经干细胞检测使用的主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
DMEM/F12培养基，表皮生长因子，无血清培养添加剂B27，碱性成纤维生长因子	GIBCOBRL公司
氯化钴溶液，Tris 碱	美国Promeg公司
焦碳酸二乙酯，平衡盐溶液，DNA Marker DL2	上海生工生物工程技术服务有限公司
多聚赖氨酸，乙二胺四乙酸，PCR梯度仪	美国Sigma公司
Nestin	北京中杉金桥生物技术有限公司
反转录PCR试剂盒	TAKARA大连宝生物技术有限公司
氯仿，异丙醇	成都化学试剂厂
TC2323二氧化碳培养箱	美国SHELDON公司
UVP(CA91786)凝胶成像分析系统	美国GENE公司
SW-CJ-1F洁净无菌工作台	苏州安泰空气技术有限公司
高速度低温离心机	德国eppendorf公司
XSZ-D生物倒置显微镜	重庆光学仪器厂
低温(-70 ℃)冰箱	美国 Harris 公司
OLYMPUS BX51全自动显微照相系统	日本Olympus公司
紫外可见分光光度计	日本Shimadzu公司
Jim-x MV-Ⅲ电泳槽，Jim-x ps-9半干电泳仪	大连竞迈生物科技有限公司
凝胶成像分析仪	美国GENE公司

实验动物：SPF级Wistar大鼠30只，鼠龄8周，雌雄各半，将雌雄配对后隔离，待乳鼠出生后，取出生24 h以内的Wistar乳鼠。所有大鼠均购自于佳木斯大学实验动物中心，许可证号：SYXK(黑)2011021。实验经佳木斯大学附属第一医院动物伦理学委员会批准。

方法：

神经干细胞原代培养：无菌条件下打开乳鼠颅脑组织，剔除脑膜和血管组织，在大、小脑交界处，将大脑皮质向上翻开，并可见紧贴大脑皮质下的条状海马，分离后钳取海马组织，迅速置于Hank’s缓冲液中，用Hank’s液漂洗 3次，并移至预先加入适量DMEM/F12培养液的小瓶中。将组织块切成1 mm³左右的小块，用抛光的吸管反复吹打呈细胞悬液，用200目滤网过滤细胞，匀浆制成单细胞悬液。经锥虫蓝染色观察细胞存活率，并调整细胞浓度为5×10⁸ L^-1，接种于25 cm²培养瓶中，同时加入适量的含碱性成纤维生长因子20 μg/L、表皮生长因子20 μg/L和2%B27的DMEM/F12培养液，放入37 ℃、体积分数5%CO₂、80%湿度条件下CO₂培养箱。每三四天半量换液，7-10 d传代一次。

神经干细胞的传代培养：原代神经干细胞分离以及培养7 d后，并离心收集神经干细胞球，待神经干细胞球长满细胞培养瓶，且大小一致时，用巴斯德吸管轻轻吹打，使沉在瓶底而没有贴壁的神经球浮起，并将所有培养液移入离心管内，1 000 r/min离心5 min，弃半量上清液后用尖头抛光的小吸管轻轻吹打，机械分离神经球为单细胞悬液，锥虫蓝染色计数细胞存活率，以5×10⁸ L^-1的细胞浓度分瓶并传代，每3 d后，换半量培养液一次。

神经干细胞诱导分化：选择生长良好的神经球细胞悬液，离心收集神经细胞，DMEM/F12培养液洗涤2次，并将收集的细胞置放在涂有多聚赖氨酸盖玻片的24孔培养板中，并加入DMEM/F12培养液中。取部分神经干细胞球，离心收集细胞，PBS离心洗涤，巴斯德吸管仔细吹打成单细胞悬液，种植在表面涂有多聚赖氨酸的培养基上，神经细胞沉降并附片后，固定。加入条件培养基，培养基中含有表皮生长因子、碱性成纤维生长因子。24 h以后，Nestin免疫组织化学进行鉴定。

制备缺氧及缺氧-复氧模型：将培养的神经干细胞分为缺氧组及缺氧-复氧组，用终浓度为150 μmol/L 的CoCl₂溶液与神经干细胞融合，使神经干细胞形成缺氧状态。缺氧-复氧组细胞在缺氧4 h后去除CoCl₂形成复氧状态。缺氧及缺氧-复氧模型见图1。另将未进行干预的神经干细胞作为常氧组。

免疫荧光检测神经干细胞的凋亡：通过检测Caspase-3免疫荧光检测神经干细胞凋亡数量。将各组神经干细胞分别接种于预先置有多聚赖氨酸涂布的盖玻片的6孔培养板，并加入血清培养基1 mL，分别于干预4，8，12，16 h后行Caspase-3免疫荧光染色，结果由图像分析仪测定分析。

神经干细胞增殖的测量：采用神经球计数法计算神经干细胞增殖情况^[15]，取2组细胞采用双盲法记数每孔的神经球数量。

反转录PCR检测神经干细胞中低氧诱导因子1α和诱导型一氧化氮合酶mRNA的表达水平：将2组细胞经过分离、沉淀后，取出沉淀并再经过洗盐、溶解、定量后，测DNA纯度后，去除无关混杂的DNA。

引物序列

引物	序列	长度(bp)
低氧诱导因子1α	上游：5’-ATG TGA GCC AGG ATA TGT GCA-3’ 下游：5’-AGG TAT AGC GTC TCT GAG TGA-3’	499
诱导型一氧化氮合酶	上游：5’-TGC TTT GTG CGG AGT TGC GA-3’ 下游：5’-CTA CAC TCG CCT CTC CAT ACA G-3’	459
GAPDH	上游：5’-CAC ACT GCA CTC GCA CTC AT-3’ 下游：5’-GCT CGT CCT CAC ACT CTC-3’	268

经过65 ℃变性5 min，退火至4 ℃反应后，将产物离心数秒，使模板RNA引物混合液离心并沉积在管底。将配制好的反转录反应液与沉积物混合，进行反转录反应。提取反转录反应液5 μL进行凝胶电泳实验，并确定反应产物。将扩增的产物行凝胶电泳实验，显色后，确定目的条带。用电泳凝胶成像分析灰度值，以目的基因与GAPDH的灰度比值，作为其相对表达水平。

主要观察指标：神经干细胞增殖的变化及细胞中低氧诱导因子1α和诱导型一氧化氮合酶mRNA表达水平的变化。

统计学分析：数据以x(_)±s表示，以SPSS 13.0软件行单因素方差分析计算组间差异，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

氧是生命存在的必要条件，是生命功能的重要调节因子^[16]。氧浓度对细胞功能的影响是显而易见的^[17-19]。低氧条件下，致使神经细胞的损伤，然而在复氧条件下却可加重细胞的损伤^[20-22]。氯化钴中的钴离子可与亚铁争夺氧离子靶点，从而与血红蛋白结合，导致细胞缺氧^[23-26]。神经干细胞在体积分数10%的氧浓度下，神经干细胞通过各种因子的作用细胞数会增多^[27-31]。重度低氧环境下，神经干细胞内环境无法代偿并会抑制神经干细胞的增殖，低氧时间的增加与神经细胞的损伤成正比，最终会导致细胞凋亡^[32-35]。研究表明，在细胞缺氧反应中，低氧诱导因子1α因子是最重要的调控因子，在缺氧、缺氧-复氧条件下，低氧诱导因子1α因子对神经干细胞增殖的作用还没有定论^[36-38]。低氧条件下可造成细胞损伤，而复氧条件下会进一步加重细胞的损伤。

低氧诱导因子1由低氧诱导因子1α和低氧诱导因子1β组成，其中低氧诱导因子1α对氧浓度十分敏感，对调节神经细胞功能有专一性。细胞氧浓度的变化会促使低氧诱导因子1的表达，并调节细胞功能，其产生及调节神经细胞功能的机制非常复杂，与遗传物质的表达，细胞核定位，转录增强等机制有关^[39-42]。在低氧条件下，机体能诱导神经细胞产生诱导型一氧化氮合酶。诱导型一氧化氮合酶介导兴奋性神经毒性，诱导型一氧化氮合酶与氧自由基产生反应，生成物为过氧化硝基、羟自由基等化合物，这些化合物可引起组织损害^[43-45]。本实验表明，低氧处理后，神经干细胞可检测到诱导型一氧化氮合酶的表达。

采用氯化钴模拟缺氧处理神经干细胞，发现：①低氧条件下，神经干细胞中低氧诱导因子1α和诱导型一氧化氮合酶mRNA表达显著增加，其中低氧诱导因子1αmRNA表达在8 h后达高峰；诱导型一氧化氮合酶 mRNA表达在 12 h后达高峰。②低氧诱导因子1α和诱导型一氧化氮合酶 mRNA的表达增加，可促进神经干细胞的增殖。说明低氧诱导因子1αmRNA表达对神经干细胞的增殖起到一定的作用，这可为临床应用神经干细胞治疗神经系统疾病提供新的思路及方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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