婴幼儿增生期血管瘤内皮细胞观察：培养、鉴定及生长状况

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.51.014

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前婴幼儿血管瘤的发病机制尚不明确，通过体外培养的血管瘤内皮细胞进行发病机制的研究为当前研究的热点。
目的：探讨血管瘤内皮细胞体外培养的方法并观察其生物学特性。
方法：采用组织块贴壁法原代培养血管瘤内皮细胞, 第Ⅷ因子相关抗原、CD31、CD34免疫组织化学SP法鉴定内皮细胞并测出内皮细胞纯度；观察血管瘤内皮细胞的生物学特性。
结果与结论：成功培养出血管瘤内皮细胞，第Ⅷ因子相关抗原、CD31、CD34均为阳性。检测纯度：CD34(+)数为(68.35±3.58)%。细胞形态为较规则的圆形、椭圆形或多角形，呈现特有“铺路石”特征，而且还具有血管瘤内皮细胞特有的“管腔形成”现象。结果表明，组织块贴壁法能成功培养较纯的婴幼儿血管瘤内皮细胞，传代后第3，4代最适于体外实验研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 血管内皮细胞, 血管瘤, 内皮细胞, 细胞培养, 组织块法

Abstract:

BACKGROUND: Currently, the pathogenesis of infantile hemangioma is not yet clear, and therefore, studies on tumor pathogenesis through in vitro culture of endothelial cells from hemangiomas have become a research focus.
OBJECTIVE: To explore an in vitro culture method for infantile hemangioma endothelial cells and to observe the biological characters of cultured cells.
METHODS: The endothelial cells of infantile hemangioma were cultured by tissue explant method. Immunohistochemical staining of anti-CD31, anti-CD34 and anti-factor VIII associated protein was performed to identify the cultured cells, respectively. Purity of endothelial cell was detected with CD34. The biological characters of the cultured cells were observed.
RESULTS AND CONCLUSION: Vascular endothelial cells were successfully cultivated and positive for CD31, CD34 and anti-factor VIII. The proportion of CD34+ cells was (68.35±3.58)%. The cells were round, oval or polygonal, and cell boundaries were clear. Endothelial cell-specific “paving stone” feature could be observed after cell fusion. These findings indicate that endothelial cells of infantile hemangioma can be isolated and cultured successfully by tissue explant method, and cells at passages 3-4 are the most suitable for in vitro experiments.

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中图分类号:

R318

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Li Pan-deng, Chen Run-fang, Zhang Li, Zhang Yuan-gui. Endothelial cells in infantile hemangioma at proliferative phase: culture, identification and growth[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(51): 8276-8280.

图/表（结果） 2

2.1 体外培养的血管瘤内皮细胞形态学观察结果 15 例标本均成功培养出血管瘤内皮细胞并传代成功，最多培养至第9代(见图1)。于接种后72 h 可观察到组织块边缘有细胞向四周游出并表现为贴壁生长方式(见图1A)。接种5-7 d后可观察到成团涌出的圆形、椭圆形或多角形内皮细胞并紧密排列生长(见图1G)。此种细胞胞质具有饱满、胞膜完整、折光性强的特点(见图1H)；细胞核具有圆或椭圆形、居中、核分裂相或双核(见图1C)的特点。接种10 d后细胞生长速度加快，呈分裂生长方式，部分细胞具有“管腔形成”现象(见图1B)，接种两三周后细胞基本铺满瓶底，并可见细胞具有单层分布、无重叠、接触抑制生长特性，并呈“铺路卵石状”排列(见图1D)。传代细胞与原代细胞相比在形态及生长速度上有所差别：细胞为多角形或短梭形，融合后与原代细胞形态基本相似；前5代(见图1F)与原代细胞生长速度无明显差别，六七代生长速度明显增快。本实验细胞传代最多至第9代(见图1E)具有以下特点：细胞体积缩小、皱缩、变圆。无法继续贴壁生长，悬浮细胞增多，无法继续培养及传代。

2.2 血管瘤内皮细胞性质的鉴定及纯度检测结果见图2。
细胞胞浆或胞膜中可见明显的棕黄色染色。PBS代替一抗的阴性对照片为阴性(见图2E)。CD31、CD34及第Ⅷ因子相关抗原均呈阳性(见图2A-C)。CD34阳性率为(68.35± 3.58)%。
2.3 所绘血管瘤内皮细胞生长曲线第3代呈“S”形：接种后六七天出现快速增殖期，细胞数量于接种后第10天达到高峰并进入平台期。实验未观察到明显的衰退期。与第3代细胞相比，第7代细胞生长曲线有所差别：接种后第3，4天即出现快速增殖期，并于六七天达到高峰值后出现持续时间较长的平台期(见图2D)。

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引言

婴幼儿血管瘤又称为真性血管瘤，是婴幼儿时期最常见的血管性良性肿瘤，通过病理学研究人们发现婴幼儿血管瘤是由大量新生毛细血管和增殖的内皮细胞组成。该肿瘤的发病率：新生儿期为1%-2%，1岁时期高达约12%，早产儿高达约22.9%，男女性别比例为1∶3-5。婴幼儿血管瘤一般有特殊的自然病程：增生期、消退期、消退完成期。其中有50%的患者患处皮肤基本恢复正常，但仍有高达10%-26%的患儿患处皮肤残留有永久性的变化如皮肤萎缩、纤维脂肪残留、色素沉着以及瘢痕等。由于该病常发生于面头部，对患儿美观及心理方面都产生极大的负面影响，其中有一部分还可以发生溃疡、瘢痕及出血。若累及耳道及眼睛，则可产生视觉及听力障碍，如累及呼吸道，由于瘤体巨大增生压迫及阻塞呼吸道、窒息而危及生命。目前临床治疗的效果尚不尽人意，究其原因可能是血管瘤增生、消退的确切机制,目前还不完全清楚，其是否能消退及其危害性临床上更是难以预先判断，其中特殊类型、特殊部位的血管瘤更是临床处理的难题。
体外培养血管瘤内皮细胞是研究血管瘤发病机制的重要步骤。血管瘤内皮细胞有两种主要的培养方法：消化法和组织块法。应用消化法得到的内皮细胞中杂细胞比较多且与内皮细胞均匀混在一起，用一般方法难以纯化；应用组织块培养法得到的内皮细胞中杂细胞比较少，用一般的方法容易纯化。作者此次研究采用组织块贴壁法培养出较高纯度的血管瘤内皮细胞，并观察到血管瘤内皮细胞的某些独特的生物学特性，为体外血管瘤发病机制的研究提供了良好的平台。

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材料方法

1.1 设计单一样本观察。
1.2 时间及地点实验于2013年10月至2014年10月在徐州医学院附属医院及蚌埠医学院附属医院完成。
1.3 材料

组织来源：收集徐州医学院附属医院烧伤整形外科手术切除的婴幼儿增生期血管瘤(术后按Mulliken标准经病理证实为增生期血管瘤)新鲜标本，共15例，所有标本术前均未进行任何治疗。参与实验的患病婴幼儿监护人对实验治疗过程完全知情同意，在充分了解本治疗方案的前提下签署“知情同意书”。
1.4 实验方法
原代培养婴幼儿增生期血管瘤内皮细胞：将新鲜的血管瘤标本置于M199液试管中，4 ℃保存，移运至细胞室，并切取小部分瘤体组织行病理检查示增生期血管瘤(依据Mulliken标准)。用PBS清洗标本。剪除皮肤及脂肪等组织，将瘤体剪碎成体积约1 mm×1 mm×1 mm的颗粒，肉眼观为糊状。4 ℃离心后于培养瓶底壁、间距为 4 mm接种瘤体组织块，滴加M199培养液2 mL湿润组织块，瓶底朝上置于培养箱中。约6 h后将培养瓶翻转置放，此时组织块被M199液覆盖，继续培养。约48 h后首次更换细胞培养液，并每隔三四天更换1次，每日观察细胞生长情况，并拍照记录。
细胞传代及纯化：于细胞长满约80%瓶底时传代。吸弃旧培养液后用D-Hanks缓冲液缓慢冲洗以把培养液中残留的胎牛血清去除。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA 2mL消化细胞，观察到细胞间隙增大及胞质回缩现象后，吸除消化液并滴加M199液4 mL使消化终止。吸管吹打甁壁使细胞从瓶壁脱掉并形成细胞悬液，1∶2接种至培养瓶，继续培养。观察见细胞长满约80%瓶底时再次传代。实验联合机械刮除法、酶消化法及反复贴壁法对培养细胞进行纯化。
机械刮除法：在原代培养时通过显微镜观察细胞形态并确认内皮细胞岛，小心刮除非内皮细胞后用PBS 冲洗后更换细胞培养液继续培养。
酶消化法：利用内皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同及脱壁时间的差异将内皮细胞和成纤维细胞分开。必要时可重复操作。
反复贴壁法：利用成纤维细胞和内皮细胞贴壁时间的不同，将成纤维细胞和内皮细胞逐步分开。
血管瘤内皮细胞形态学观察、鉴定及纯度检测：
形态学观察：分别使用4倍、10倍和20倍目镜观察血管瘤内皮细胞，选择细胞生长良好部位，用照相软件进行拍照。
免疫组织化学法(SP法)鉴定内皮细胞性质：将培养成功的内皮细胞接种于6 孔板中并制作细胞爬片培养48 h后取出细胞爬片，PBS冲洗3遍，体积分数95%乙醇室温下固定15 min，体积分数0.3%双氧水室温下孵育10 min，PBS冲洗，用非免疫动物血清封闭10 min。滴加滴度为1∶100的CD31鼠抗人抗体、CD34鼠抗人抗体及第Ⅷ因子相关抗原鼠抗人抗体并置于4 ℃过夜，PBS漂洗后滴加生物素标记羊抗鼠第二抗体，将其放置于室温下孵浴10 min。用PBS漂洗后滴加链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液，室温孵浴10 min，PBS再次漂洗。DAB显色，镜下观察、拍照。
检测血管瘤内皮细胞纯度：细胞CD34阳性标准：可见细胞胞浆或胞膜中棕黄色染色。400倍镜下随机选取5 个视野并计算CD34阳性细胞百分率×3次并取均数。阳性细胞百分率：表达阳性的细胞数/所有细胞数×100%。
绘制细胞生长曲线：分别取所培养的第3代、第7代血管瘤内皮细胞并制成细胞浓度为1×107 L-1细胞悬液后接种于2块24孔培养板培养12 d。于第2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13 天取每组各3孔中细胞并进行计数，数据均以x(_)±s表示。绘制细胞生长曲线：横轴为培养时间，纵轴为细胞数对数值。
1.5 主要观察指标 ①体外培养的血管瘤内皮细胞形态学观察。②血管瘤内皮细胞性质的鉴定及纯度检测结果。

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讨论

依据脉管病变的临床表现、生物学特性及其病理学特点，1982年Mulliken和Glowacki将脉管病变分为真性血管瘤和脉管畸形两大类^[1-2]。其中真性血管瘤外观多呈鲜红的草莓样改变，俗称“草莓样血管瘤”，即本实验中所研究的婴幼儿血管瘤，其组织学上是由大量新生毛细血管和增殖的内皮细胞构成。婴幼儿血管瘤好发于头面部，常可出现溃烂、出血，有时甚至发生于耳道、眼睛及呼吸道，可出现听力及视觉障碍甚至阻塞呼吸道而致患者死亡^[3-4]。但血管瘤增生、消退的确切机制,目前还不完全清楚^[6-10]。
Yu等[11]研究发现血管瘤组织表达内皮祖细胞标志 CD133并且定位于内皮细胞，提示血管瘤内皮细胞可能为幼稚的、尚未发育成熟内皮细胞。研究发现血管瘤内皮细胞与其他正常组织内皮细胞相比具有更容易培养生长的特性^[5]，并有“管腔形成”现象。为了揭示血管瘤的发病机制，体外观察血管瘤内皮细胞的生物学特性意义重大^[12]。
目前内皮细胞培养方法主要有组织块法和消化法^[13]。①消化法：将新鲜瘤体剪成糊状，并加入适量胶原酶液于 37 ℃下在振荡器中轻微震荡约半小时，于37 ℃下0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA水浴消化5 min至90%组织溶解，显微镜下见分散的大量单个细胞，过滤除去没有消化的组织，离心并洗涤细胞悬液后接种培养器皿中培养。此方法具有如下缺点：内皮细胞与杂细胞均匀混在一起，普通方法较难纯化。②组织块法：即本实验所采用的方法。此方法的优点：获得的细胞纯度高并且容易纯化。
有研究发现采用消化法培养出的内皮细胞周围伴有大量成纤维细胞等杂细胞且均匀的混在一起，经历数次传代后成纤维细胞等杂细胞占据着绝对的生长优势。组织块法具有细胞损伤小、易于贴壁生长、纯度相对较高的特点，但为了满足相关实验要求还需要进一步纯化、提高细胞纯度。目前较常应用的细胞纯化方法有梯度离心法、机械刮除法、血管内皮生长因子培养法及近年来新兴的应用免疫磁珠或流式细胞仪来分离、纯化细胞。后种方法分离得到细胞纯度高，但对细胞本身条件要求较高而且成本较高，难以推广应用。采用任何单独一种纯化方法一般难以达到相关实验的要求。
实验对细胞的纯化贯穿于整个培养过程，操作简单、效果明显。去除非瘤体组织、离心组织颗粒块及机械刮除非内皮细胞均是本实验所采取的纯化方法。有研究报道内皮细胞和成纤维细胞从组织块游出的时间差别较大：内皮细胞一般于3 d之内游出；成纤维细胞一般于1周后游出^[9]。本实验利用两种细胞游出时间差，在组织块接种1周时予以去除，有利于减少成纤维细胞污染，有利于纯化内皮细胞。据相关研究报道肝素能阻碍成纤维细胞生长^[14-16]，故实验将100 mg/L肝素加入培养液中以便抑制成纤维等杂细胞的生长，有利于内皮细胞的纯化。作者还采用反复贴壁法和胰酶消化法纯化目的细胞，其原理为成纤维细胞和内皮细胞的胰酶消化耐受性及贴壁时间有很大差别。本实验综合应用上述方法，培养及纯化的结果：CD34阳性率达到(68.35±3.58)%，得到了较高纯度的血管瘤内皮细胞，完全可以满足血管瘤体外实验的需要。实验中观察到第7代和第3代细胞生物学特性差别较大，推测由于经过细胞的反复传代后，血管瘤内皮细胞的生物学特性有了很大改变，已经不适宜作为血管瘤体外实验研究的对象。

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