骨形态发生蛋白7通过PI3K/Akt通路可抑制人髓核细胞的凋亡

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.24.009

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (24): 3821-3828.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.24.009

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骨形态发生蛋白7通过PI3K/Akt通路可抑制人髓核细胞的凋亡

余灏涛，徐义春，王其友，欧定强，周葳

中山大学附属第三医院脊柱外科，广东省广州市 510630

修回日期:2014-05-16 出版日期:2014-06-11 发布日期:2014-06-11
通讯作者: 徐义春，博士。中山大学附属第三医院脊柱外科，广东省广州市 510630
作者简介:余灏涛，男，1987年生，广东省广州市人，汉族，中山大学附属第三医院毕业，硕士，目前从事椎间盘退变相关研究。
基金资助:
广东省科技攻关项目(2009B030801095，2007A0300005)

Bone morphogenetic protein-7 inhibits apoptosis of human nucleus pulposus cells through activation of PI3K/Akt pathway

Yu Hao-tao, Xu Yi-chun, Wang Qi-you, Ou Ding-qiang, Zhou Wei

Department of Spinal Surgery, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China

Revised:2014-05-16 Online:2014-06-11 Published:2014-06-11
Contact: Xu Yi-chun, M.D., Department of Spiny Surgery, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China
About author:Yu Hao-tao, Master, Department of Spinal Surgery, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China
Supported by:
Science and Technology Program of Guangdong Province, No. 2009B030801095, 2007A0300005

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨形态发生蛋白7可促进人髓核细胞的细胞外基质合成，减缓椎间盘退变。近年来，有学者提出其可能通过对抗髓核细胞凋亡从而发挥上述作用，但其进一步的分子机制一直未被详细阐明。
目的：观察骨形态发生蛋白7对无血清诱导下发生凋亡的人髓核细胞产生的作用及其对PI3K/Akt通路的影响，分析并探讨骨形态发生蛋白7抑制人髓核细胞凋亡的分子机制。
方法：通过改良Pfirrmann分级及相关条件选取12例患者获取椎间盘组织，采用酶消化法获取人髓核细胞后分组实验，以含体积分数15%胎牛血清的培养基正常培养的髓核细胞设为空白组；使用无血清培养基培养 48 h诱导凋亡作为阳性对照组；在无血清条件下，通过加入不同剂量的骨形态发生蛋白7以及同时添加PI3K/Akt通路拮抗剂LY294002形成处理组和拮抗组。使用流式细胞术检测各组细胞凋亡率；免疫荧光观察p-Akt表达；蛋白印迹法检测Akt，p-Akt，BAD和Caspase 9等通路蛋白的表达变化。
结果与结论：无血清凋亡诱导下，流式细胞术结果显示，随着骨形态发生蛋白7处理浓度上升，髓核细胞凋亡率明显下降，加入LY294002共同作用后细胞凋亡率再次升高(P < 0.05)。p-Akt免疫荧光和蛋白印迹法检测结果进一步表明，与凋亡阳性对照组相比，加入骨形态发生蛋白7的实验组中，p-Akt表达明显增加，其下游凋亡相关蛋白BAD、Caspase 9蛋白表达减少(P < 0.05)，而在同时加入Akt通路拮抗剂LY294002后，p-Akt蛋白表达下降而凋亡相关蛋白的表达又恢复到相对较高的水平(P < 0.05)。结果证明，骨形态发生蛋白7在无血清诱导的人类髓核细胞凋亡中通过激活PI3K/Akt通路，拮抗了BAD-Caspase 9相关的细胞凋亡过程，抑制了髓核细胞的退变。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 骨组织工程, 组织工程基础实验, 骨形态发生蛋白7, PI3K/Akt通路, 人髓核细胞, 凋亡, 无血清, p-Akt, BAD蛋白, Caspase 9, 流式细胞术, 蛋白印迹法

Abstract:

BACKGROUND: Bone morphogenetic protein 7 (BMP-7) can promote extracellular matrix synthesis of human nucleus pulposus cells, and delay intervertebral disk degeneration. Recently scholars proposed that the above effects can be achieved through anti-apoaptosis, but further molecular mechanism remains poorly understood.
OBJECTIVE: To observe the effects of BMP-7 on the apoptotic human nucleus pulposus cells under serum-free induction and the PI3K/Akt pathway, investigate the molecular mechanism underlying the anti-apoptosis effect of BMP-7.
METHODS: Human nucleus pulposus tissue were harvested from 12 patients according to the modified Pfirrmann classification, and human nucleus pulposus cells were obtained from digestion of herniated nucleus pulposus tissue. The collected nucleus pulposus cells were divided into four groups. Blank group: cells were cultured in normal culture medium containing 15% feral bovine serum; positive control group: cells were induced to apoptosis in the serum-free culture medium for 48 hours; treated group: cells were induced to apoptosis in the serum-free culture medium containing different dosages of BMP-7; antagonism group: cells were induced to apoptosis in the serum-free culture medium containing different dosages of BMP-7 and LY294002, an PI3K/Akt pathway inhibitor. Cellular apoptosis rate was quantified by flow cytometry. Immunoflurorescence was performed to observe p-Akt expressions. Changes of Akt, p-Akt, BAD, and Caspase 9 expression were detected with western blot analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: Results from flow cytometry showed that, the apoptosis rate of nucleus pulposus cells was significantly decreased as the increase of BMP-7 concentration, under the serum-free induction; after the cells were induced with LY294002, the apoptosis rate was increased again (P < 0.05). The p-Akt immunoflurorescence and western blot analysis demonstrated that, compared with positive control group, the p-Akt expression was significantly increased, while the expression of downstream apoptosis-related proteins such as BAD and Caspase 9, was significantly decreased in the cells treated with BMP-7 (P < 0.05). Furthermore, in the group treated with BMP-7 and LY294002, the p-Akt expression was decreased, while the expression of apoptosis-related proteins was recovered to high levels (P < 0.05). BMP-7 activates the PI3K/Akt pathway, suppresses the downstream BAD and Caspase 9 signaling, and inhibits the apoptosis of human nucleus pulposus cells induced by serum-free situation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: apoptosis, bone morphogenetic protein-7, protein kinase, serum

中图分类号:

R318

余灏涛，徐义春，王其友，欧定强，周葳. 骨形态发生蛋白7通过PI3K/Akt通路可抑制人髓核细胞的凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(24): 3821-3828.

Yu Hao-tao, Xu Yi-chun, Wang Qi-you, Ou Ding-qiang, Zhou Wei . Bone morphogenetic protein-7 inhibits apoptosis of human nucleus pulposus cells through activation of PI3K/Akt pathway[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(24): 3821-3828.

图/表（结果） 6

2.1 人髓核细胞生长形态变化 低浓度胶原酶过夜消化获取的原代髓核细胞基本可于培养3 d内完成贴壁。原代细胞起初贴壁时呈类圆形或多角形，后细胞突起逐渐伸长，细胞形态主要变为短梭形，伴有少量突起较多的树形细胞。至瓶内细胞达到60%-70%融合，产生接触抑制时，短梭形细胞逐渐融合，其排列有一定方向性呈漩涡状或火焰状排列。传1代细胞生长更迅速，培养6 h内即基本完成贴壁，细胞内仍有丰富胞浆，其形态仍为短梭形，但较原代相比更细长，排列失去方向性，略显紊乱。以上各期各形态髓核细胞均胞浆丰富，细胞核清晰可见，见图1，符合以往文献报道的人髓核细胞的形态^[20-21]。

2.2 Ⅱ型胶原免疫组织化学染色鉴定 Ⅱ型胶原染色可见实验组短梭形髓核细胞核周棕黄色染色明显，提示Ⅱ型胶原表达，符合髓核细胞特征。同时，以磷酸盐缓冲液(PBS)作为阴性对照组，细胞内透明无任何染色。见图2。

2.3 流式细胞术Annexin V-FITC双标法检测细胞凋亡率 实验组经骨形态发生蛋白7处理后在无血清环境下，随着骨形态发生蛋白7剂量增加，细胞凋亡率对应下降幅度增加 (P < 0.05)。并且在加入PI3K/Akt通路拮抗剂LY294002后，骨形态发生蛋白7的抗凋亡效果减弱(与低剂量骨形态发生蛋白7组比，P < 0.05)。将12例髓核标本检测结果进行统计学分析，对比分析各组凋亡率，通过Bonferroni法两两比较，组间差异有显著性意义(P < 0.05)。选取其中一组的流式凋亡结果附于图3，12例样本统计结果陈列于表1及图4。

2.4 p-Akt免疫荧光染色结果 空白对照组与阳性对照组中p-Akt荧光表达极弱甚至不可见。而在骨形态发生蛋白7处理的中剂量骨形态发生蛋白7组细胞中则明显可见p-Akt荧光表达，这种表达随着LY294002拮抗组Akt通路拮抗剂LY294002的加入而受到明显抑制。见图4。

2.5 Western blot结果 Western blot结果进一步验证了无血清诱导凋亡下p-Akt信号蛋白的表达量改变，见图5A。各组内参β-actin以及Akt表达水平基本相等的前提下，对比阳性对照组，低中高剂量骨形态发生蛋白7组中随着骨形态发生蛋白7剂量增加，PI3K/Akt通路蛋白p-Akt表达增加(P < 0.05)，其下游凋亡相关蛋白BAD、Caspase 9蛋白表达减少(P < 0.05)，而在LY294002拮抗组加入Akt通路拮抗剂LY294002后，p-Akt表达下降而BAD、Caspase 9表达又恢复到相对较高水平(P < 0.05)。见图5B-D。

参考文献

[1] Kepler CK, Ponnappan RK, Tannoury CA, et al. The molecular basis of intervertebral disc degeneration. Spine J. 2013;13(3):318-330.
[2] Vo NV, Hartman RA, Yurube T, et al. Expression and regulation of metalloproteinases and their inhibitors in intervertebral disc aging anddegeneration. Spine J. 2013; 13(3):331-341.
[3] Gopal D, Ho AL, Shah A, et al. Molecular basis of intervertebral disc degeneration. Adv Exp Med Biol. 2012; 760:114-33.
[4] 王海,黄博,王建,等.退变椎间盘生物学特性研究进展[J]. 中国矫形外科杂志,2013; 21(17):1738-1741.
[5] 周旭,贺石生.椎间盘退行性变的分子生物学因素[J].中国组织工程研究,2012,7(39):7375-7379.
[6] Ding F, Shao ZW, Xiong LM. Cell death in intervertebral disc degeneration. Apoptosis. 2013;18(7):777-785.
[7] Park JB, Lee JK, Park EY, et al. Fas/FasL interaction of nucleus pulposus and cancer cells with the activation of caspases. Int Orthop. 2008;32(6):835-840.
[8] Ding F, Shao ZW, Yang SH, et al. Role of mitochondrial pathway in compression-induced apoptosis of nucleus pulposus cells. Apoptosis. 2012;17(6):579-590.
[9] Sudo H, Minami A. Caspase 3 as a therapeutic target for regulation of intervertebral disc degeneration in rabbits. Arthritis Rheum. 2011;63(6):1648-1657.
[10] 刘旭,车路,王海强,等.椎间盘退变的分子病理机制研究概况[J].中华临床医师杂志(电子版),2013,(6):2664-2666.
[11] Wang D, Hu Z, Hao J, et al. SIRT1 inhibits apoptosis of degenerative human disc nucleus pulposus cells through activation of Akt pathway. Age (Dordr). 2013;35(5): 1741-1753.
[12] Liu G, Cao P, Chen H, et al. MiR-27a regulates apoptosis in nucleus pulposus cells by targeting PI3K. PLoS One. 2013; 8(9):e75251.
[13] Niu CC, Lin SS, Yuan LJ, et al. Hyperbaric oxygen treatment suppresses MAPK signaling and mitochondrial apoptotic pathway in degenerated human intervertebral disc cells. J Orthop Res. 2013;31(2):204-209.
[14] Hiyama A, Yokoyama K, Nukaga T, et al. A complex interaction between Wnt signaling and TNF-α in nucleus pulposus cells. Arthritis Res Ther. 2013;15(6):R189.
[15] Than KD, Rahman SU, Vanaman MJ, et al. Bone morphogenetic proteins and degenerative disk disease. Neurosurgery. 2012;70(4):996-1002.
[16] Wang Z, Hutton WC, Yoon ST. Bone morphogenetic protein-7 antagonizes tumor necrosis factor-α-induced activation of nuclear factor κB and up-regulation of the ADAMTS, leading to decreased degradation of disc matrix macromolecules aggrecan and collagen II. Spine J. 2014;14(3):505-512.
[17] 辛洪奎,张超,阮狄克.骨形态发生蛋白7及其对椎间盘退变修复作用的研究进展[J].中国脊柱脊髓杂志,2011,21(5):416-418.
[18] Imai Y, Miyamoto K, An HS, et al. Recombinant human osteogenic protein-1 upregulates proteoglycan metabolism of human anulus fibrosus and nucleus pulposus cells. Spine (Phila Pa 1976). 2007;32(12):1303-1309; discussion 1310.
[19] Griffith JF, Wang YX, Antonio GE, et al. Modified Pfirrmann grading system for lumbar intervertebral disc degeneration. Spine (Phila Pa 1976). 2007;32(24):E708-E712.
[20] Yuan M, Leong KW, Chan BP. Three-dimensional culture of rabbit nucleus pulposus cells in collagen microspheres. Spine J. 2011;11(10):947-960.
[21] 王锋,郑陈静美,吴小涛.人退变椎间盘髓核细胞体外平面培养的形态学及活性观察[J].中国矫形外科杂志, 2013,21(13): 1346-1351.
[22] Ha KY, Kim BG, Kim KW, et al. Apoptosis in the sequestrated nucleus pulposus compared to the remaining nucleus pulposusin the same patient. Spine (Phila Pa 1976). 2011; 36(9):683-689.
[23] Wei A, Brisby H, Chung SA, et al. Bone morphogenetic protein-7 protects human intervertebral disc cells in vitro from apoptosis. Spine J. 2008;8(3):466-474.
[24] Yu LP, Qian WW, Yin GY, et al. MRI assessment of lumbar intervertebral disc degeneration with lumbar degenerative disease using the Pfirrmann grading systems. PLoS One. 2012;7(12):e48074.
[25] 杨勇,梁伟,罗卓荆,等.不同Pfirrmann分级椎间盘内髓核细胞生物学特性的比较[J].脊柱外科杂志,2011,9(4):244-248.
[26] Kakoi H, Maeda S, Shinohara N, et al. Bone morphogenic protein (BMP) signaling up-regulates neutral sphingomyelinase 2 to suppress chondrocyte maturation via the akt protein signaling pathway as a negative feedback mechanism. J Biol Chem. 2014;289(12):8135-8150.
[27] Zheng Y, Wang X, Wang H, et al. Bone morphogenetic protein 2 inhibits hepatocellular carcinoma growth and migration through downregulation of the PI3K/AKT pathway. Tumour Biol. 2014.
[28] Lim AI, Chan LY, Tang SC, et al. BMP-7 represses albumin-induced chemokine synthesis in kidney tubular epithelial cells through destabilization of NF-κB-inducing kinase. Immunol Cell Biol. 2014.
[29] Pei H, Cao D, Guo Z, et al. Bone morphogenetic protein-7 ameliorates cerebral ischemia and reperfusion injury via inhibiting oxidative stress and neuronal apoptosis. Int J Mol Sci. 2013;14(12):23441-23453.
[30] Ciumas M, Eyries M, Poirier O, et al. Bone morphogenetic proteins protect pulmonary microvascular endothelial cells from apoptosis by upregulating α-B-crystallin. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2013;33(11):2577-2584.
[31] Wang Z, Guo J. Mechanical induction of BMP-7 in osteocyte blocks glucocorticoid-induced apoptosis through PI3K/AKT/ GSK3β pathway. Cell Biochem Biophys. 2013;67(2):567-574.
[32] Shimizu T, Kayamori T, Murayama C, et al. Bone morphogenetic protein (BMP)-4 and BMP-7 suppress granulosa cell apoptosis via different pathways: BMP4 via PI3K/PDK-1/Akt and BMP-7 via PI3K/PDK-1/PKC. Biochem Biophys Res Commun. 2012;417(2):869-873.
[33] Mehrkens A, Karim MZ, Kim S, et al. Canine notochordal cell-secreted factors protect murine and human nucleus pulposus cells from apoptosis by inhibition of activated caspase-9 and caspase-3/7. Evid Based Spine Care J. 2013; 4(2):154-156.
[34] Hiyama A, Yokoyama K, Nukaga T, et al. A complex interaction between Wnt signaling and TNF-α in nucleus pulposus cells. Arthritis Res Ther. 2013;15(6):R189.
[35] Ma Y, Qin H, Cui Y. MiR-34a targets GAS1 to promote cell proliferation and inhibit apoptosis in papillary thyroid carcinoma via PI3K/Akt/Bad pathway. Biochem Biophys Res Commun. 2013;441(4):958-963.
[36] Iwasaki K, Sudo H, Yamada K, et al. Cytotoxic effects of the radiocontrast agent iotrolan and anesthetic agents bupivacaine and lidocaine in three-dimensional cultures of human intervertebral disc nucleus pulposus cells: identification of the apoptotic pathways. PLoS One. 2014; 9(3):e92442.

引言

椎间盘退行性变(intervertebral disc degeneration, IVDD)作为椎间盘退行性疾病的病理基础，目前对其病理变化的研究向人们揭示了椎间盘受到体内外刺激因素导致髓核细胞在多种细胞因子作用下，细胞外基质合成减少，Ⅱ型胶原变性，水分丢失的过程^[1-5]。而在对椎间盘退变进一步的机制研究中，细胞凋亡这一有序的死亡调控过程一直被公认为椎间盘退行性变病理机制中最重要的组分之一^[6]。

近年来，陆续有报道证实椎间盘细胞通过死亡受体途径、线粒体途径等经典凋亡信号通路促发凋亡并与椎间盘退变有着密不可分的关系^[7-10]。而很多关于信号转导途径的研究揭示了椎间盘细胞可能与包括Akt通路、Wnt通路、MAPK通路等的交联，通过更多、更复杂的途径转导凋亡，引发椎间盘退变^[11-14]，为实验从体外和体内多种途径调控椎间盘退变开辟了新的思路。

在这些互相交联、影响、反馈的信号转导通路中，PI3K/Akt通路因其与线粒体途径的紧密联系及近年发现其与骨形态发生蛋白的相互作用而引起了作者的关注。有学者发现骨形态发生蛋白在椎间盘细胞中能对细胞外基质合成发挥显著促进作用并通过多种动物模型及人类退变椎间盘细胞中的研究予以证实，而骨形态发生蛋白7是其中作用最显著的因子之一^[15-18]。但是，骨形态发生蛋白7究竟通过何种方式促进细胞外基质合成一直未被清楚阐释。

实验将通过流式技术、免疫荧光等方法验证骨形态发生蛋白7对人类髓核细胞凋亡的抑制作用，并将进一步探讨其在人类髓核细胞中是否通过与PI3K/Akt通路相关的信号转导机制发挥抗凋亡作用，以完善髓核细胞凋亡通路的研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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材料方法

设计：细胞学体外实验。
时间及地点：于2012年11月至2014年3月在中山大学附属第三医院中心实验室完成。

材料：人体髓核组织的获取来源于2012年11月至2013年11月间，中山大学附属第三医院脊柱外科腰椎间盘突出症行手术治疗的患者12例。

纳入标准：①18-30岁男性。②术前症状、体征及影像学均明确诊断腰椎间盘突出症，经保守治疗无效，具备手术指征。③手术节段椎间盘影像学改良Pfirrmann分级Ⅱ-Ⅲ级^[19]。

排除标准：①患者伴有高血压、糖尿病等基础疾病或精神类疾病。②发现伴有脊柱滑脱、椎管狭窄、先天性或继发性侧凸或后凸畸形。③发现伴有脊柱肿瘤或脊柱感染性疾病。④患者嗜好吸烟，每日吸烟支数×吸烟年数>200。⑤患者因经济情况或其他原因拒绝进行手术治疗。

实验获得中山大学附属第三医院伦理学审查批准，所有标本获取均在对病患予以详尽的告知，签署知情同意后进行。

方法：

人髓核细胞的分离及培养：自手术中取出的髓核组织装入预先盛有4 ℃无菌PBS的离心管中，15 min内带入超净台，无菌条件下洗涤并清除杂质，用眼科剪将剩余髓核组织剪碎成约1 mm×1 mm×1 mm小块。使用体积分数0.1%的Ⅱ型胶原酶，37 ℃温箱中过夜消化(12 h)。200目不锈钢滤网过滤并离心收集细胞后，加入适当配置好的含体积分数15%胎牛血清的DMEM/F12培养液重悬，即获得原代髓核细胞。其他细胞调整浓度为约1×10⁸ L^-¹，加入 25 cm²透气细胞培养瓶中贴壁单层培养。

细胞培养至70%-80%融合后予体积分数0.25%胰酶消化，1∶3传代。传1代后部分于6孔板中培养以进行细胞鉴定实验。

人髓核细胞的鉴定：倒置显微镜下隔天换液后观察并摄影，记录髓核细胞生长形态。对生长至50%-60%的传1代髓核细胞，吸去6孔板中培养液，加入40 g/L多聚甲醛固定，加入体积分数30%过氧化氢与甲醇1∶50配成的混合液灭活内源性过氧化物酶。然后滴加体积分数5%BSA进行血清封闭。血清封闭后，加入兔抗人Ⅱ型胶原单抗，对照组加入PBS，4 ℃避光过夜孵育。完成并洗涤后各孔加入羊抗兔IgG二抗37 ℃温箱孵育1 h，使用SABC试剂盒作用，DAB显色检测。

髓核细胞凋亡诱导及处理：取传1代髓核细胞生长至约70%进行实验，除空白组外的实验组换液时经PBS冲洗后改用无血清DMEM/F12培养液培养，并分别加入不同浓度骨形态发生蛋白7以及LY294002处理。

具体分组方法及干预步骤：

流式细胞术Annexin-V双标检测细胞凋亡情况：经无血清诱导凋亡及各种处理48 h后的髓核细胞使用不含EDTA的胰酶消化收集并经PBS洗涤后，以缓冲液重悬，依次加入FITC和PI，避光反应15 min后使用Annexin-V FITC/PI双染试剂盒通过FACS Calibur流式细胞仪检测凋亡率的变化情况。早期凋亡细胞为(Annexin V⁺，PI^-)，晚期凋亡细胞为(Annexin V⁺，PI⁺)，统计各组凋亡率时对早、晚期凋亡共同计数。

p-Akt免疫荧光染色：在6孔板中培养的传1代髓核细胞，在细胞生长达到浓度约70%融合时，按上述实验分组中空白对照组、阳性对照组、中剂量骨形态发生蛋白7组和LY294002拮抗组共4组方式进行处理，48 h处理完成后进行实验。加入40 g/L多聚甲醛固定，加入体积分数30%过氧化氢与甲醇1∶50配成的混合液灭活内源性过氧化物酶。然后滴加体积分数5%BSA进行血清封闭。每孔加入兔抗人p-Akt一抗，用锡纸包裹6孔板，4 ℃冰箱避光过夜孵育。完成后各孔均加入羊抗兔IgG荧光二抗，37 ℃温箱孵育1 h。DAPI工作液染核10 min，予PBS洗去后，于荧光显微镜下进行各分组细胞内p-Akt蛋白荧光表达检测并拍照保存。

细胞总蛋白提取以及Western blot检测：凋亡诱导48 h及加入相应处理后的各组细胞，使用PBS洗涤后加入全蛋白提取试剂盒中已预冷好含磷酸酶抑制剂及蛋白酶抑制剂的的细胞裂解液冰上裂解，用细胞刮收集碎裂细胞及蛋白，转移至离心管中4 ℃高速离心提取总蛋白。用BCA 蛋白含量检测试剂盒进行各组蛋白质含量的测定。向蛋白质样品中加入上样缓冲液并煮沸10 min使之变性，各组平衡蛋白量上样后，使用10%的分离胶和5%浓缩胶进行SDS-PAGE电泳分离，再电转至PVDF膜上。除磷酸化抗体检测的膜使用TBST加5%BSA外，其他用TBST加体积分数5%脱脂奶粉对膜进行封闭1 h、洗涤。以β-actin作为内参，分别加入下述相应多克隆抗体(1∶1 000)，兔抗人Akt、p-Akt(pS 473)、BAD、Caspase 9、β-actin抗体4 ℃过夜孵育。TBST洗涤3次后加入以TBST浓度1∶3 000稀释的羊抗兔IgG室温下孵育30 min。ECL超敏型检测试剂盒进行发光。暗室显影。胶片扫描后使用Alpha软件处理系统分析目标带的吸光度值。

主要观察指标：人髓核细胞光镜下生长形态；免疫组织化学鉴定Ⅱ型胶原表达；免疫荧光检测细胞内p-Akt表达；流式细胞术Annexin V-FITC双标法检测细胞凋亡率；蛋白印迹法检测相关凋亡通路蛋白的表达。

统计学分析：计量资料以x(_)±s表示，使用SPSS 17.0软件进行数据统计分析，各组间数据显著性采用单因素方差分析及Bonferroni法两两比较检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

对于人类髓核细胞体外培养的研究一直面临样本齐同性的问题。王大武等^{[16, 22]}通过完好椎间盘组织与退变椎间盘组织进行体外培养对比，无论是细胞生长形态，抑或蛋白多糖、Ⅱ型胶原等细胞外基质成分均有差别，说明了椎间盘组织状态和退变程度不同，其体外培养的初始状态即存在差异。也许正是因此，Wei等^[23]的研究亦由于其并未对获取的各例人椎间盘组织退变程度予以分析并分组，虽然观察到骨形态发生蛋白7在人类退变椎间盘获取的髓核细胞中显著的抗凋亡效果，其结果依然是未能十分令人信服。

为了克服完好椎间盘组织获取困难与研究需要较大量同一性较佳样本之间的矛盾，作者尝试通过对人类椎间盘退变的标本选择进行了严格的限制，除却病例年龄、性别、疾病情况、吸烟等一般情况，更通过改良Pfirrmann影像学分级在纳入实验前对患者所需行切除术的椎间盘进行分级评估，选取椎间盘退变程度轻而较为一致的Ⅱ-Ⅲ级水平作为准入条件，尽量在实验前保证样本的齐同性。有研究曾论证Piffirrmann分级虽然仅从MRI进行影像学评估划分，但通过对应样本体外培养分析证实其与椎间盘组织的生物学特性有着良好的对应关系^[24-25]。

事实证明实验对样本的限制是可行而有效的，无论是各例标本细胞的生长形态、速度还是Ⅱ型胶原的表达均呈现出较好的一致性。因此，实验也相信在这种前提下，通过流式细胞术对各实验组细胞凋亡率的检测结果更具说服力。实验的结果确实地反映了在无血清条件诱导凋亡的实验组中，使用骨形态发生蛋白7后髓核细胞的凋亡率随着骨形态发生蛋白7剂量的增加而逐渐下降，这种变化具有显著的统计学差异。

通过流式细胞术确证了骨形态发生蛋白7在人髓核细胞中的抗凋亡作用后，希望进一步思考并探讨骨形态发生蛋白7抗凋亡的具体分子机制，这不仅是对其抗凋亡作用的有力补充，更是更深层次对其作用原理的研究。虽然一直没有文献报道骨形态发生蛋白7在与髓核细胞凋亡信号通路相关的研究，但陆续有学者发现了其在包括颗粒细胞、多种上皮细胞及肿瘤细胞在内的全身多种细胞的增殖、分化、凋亡均发挥作用^[26-31]。Shimizu等^[32]对骨形态发生蛋白7在颗粒细胞凋亡的完善研究证实了骨形态发生蛋白4和骨形态发生蛋白7都能激活PI3K途径但却通过不同下游因子调控凋亡，其中骨形态发生蛋白4调控的是PKC，而骨形态发生蛋白7调控的正是Akt，提示了其可能与PI3K/Akt通路有着密切的联系。

以此为研究方向，作者在实验的设计中加入了拮抗组进行对比，通过将PI3K/Akt通路抑制剂LY294002与骨形态发生蛋白7共同作用，观察其对骨形态发生蛋白7抗凋亡作用的影响。实验结果证实了LY294002抑制PI3K/Akt通路后骨形态发生蛋白7的抗凋亡效果受到了明显的抑制。为了验证骨形态发生蛋白7对髓核细胞凋亡的抑制通过PI3K/Akt通路发挥作用，实验通过免疫荧光以及Western blot对PI3K/Akt通路标志信号蛋白p-Akt进行了检测。结果显示在加入骨形态发生蛋白7的实验组中，p-Akt的表达水平确实升高了，证实了骨形态发生蛋白7具有磷酸化激活Akt，调控下游凋亡蛋白通路的能力，那么Akt激活后又通过哪些凋亡蛋白引起了整个凋亡连锁反应呢？对于椎间盘细胞凋亡通路的研究以往普遍集中于传统的死亡受体途径、线粒体途径，而近年来学者对于包括MAKP，ERK，AKT，WNT途径等介导交联于传统凋亡途径之间的“中介”信号途径的研究，尤其是AKT与线粒体途径间的密切关系，为实验进一步明确椎间盘细胞凋亡调控给予了更清晰的思路^{[12, 33-34]}。

实验选取了线粒体途径中的标志凋亡蛋白-B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell leukemia-2, Bcl-2)家族蛋白中经典的促凋亡前体BAD以及天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶(caspase)家族蛋白中的Caspase 9蛋白^[35-36]，通过蛋白印迹法进一步探索骨形态发生蛋白7磷酸化激活Akt后对下游凋亡蛋白的影响。结果发现当p-Akt增加后，BAD以Caspase 9两者表达量皆出现了一定程度的下降，说明髓核细胞凋亡的抑制与其相关。骨形态发生蛋白7在激活PI3K/Akt通路后对BAD-Caspase 9相关的线粒体途径产生了抑制作用。然而，因为各方面的原因，实验并未对线粒体途径的其他标志蛋白抑或其他途径的凋亡相关蛋白进行检测，本课题组将在下一步的研究工作中予以完善，以试图更清晰地揭示人类髓核细胞凋亡的分子机制以及骨形态发生蛋白7在抗凋亡，抗退变中发挥的作用。

总之，骨形态发生蛋白7在无血清诱导的人类髓核细胞凋亡过程中能发挥确实的抗凋亡作用。流式细胞术的结果反映了细胞凋亡率与骨形态发生蛋白7的处理剂量有着相关性，而且PI3K/Akt通路抑制剂LY294002的应用对骨形态发生蛋白7抗凋亡效果的抑制提示了其可能通过此通路发挥作用。p-Akt免疫荧光和多种信号蛋白的Western Blot检测则更进一步验证了骨形态发生蛋白7处理后，p-Akt表达上升，下游BAD、Caspase 9等凋亡相关蛋白表达下降，揭示了骨形态发生蛋白7可能通过磷酸化Akt蛋白，激活PI3K/Akt通路，抑制BAD-Caspase 9线粒体途径相关凋亡通路，拮抗了细胞凋亡过程，抑制了髓核细胞的退变。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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骨形态发生蛋白7通过PI3K/Akt通路可抑制人髓核细胞的凋亡

Bone morphogenetic protein-7 inhibits apoptosis of human nucleus pulposus cells through activation of PI3K/Akt pathway

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[2]	裴丽丽, 孙贵才, 王弟. 丹酚酸B抑制骨髓间充质干细胞氧化损伤及促进分化为心肌样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1032-1036.
[3]	李时斌, 赖渝, 周毅, 廖建钊, 章晓云, 张璇. 激素性股骨头坏死发病机制及相关信号通路的靶点效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 935-941.
[4]	徐银琴, 史红美, 王光义. 通痹方热敷联合针刺治疗对退变椎间盘细胞凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2 mRNA的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 713-718.
[5]	张雯雯, 金颂峰, 赵国梁, 宮丽鸿. 复方中药稳斑汤减少同型半胱氨酸诱导大鼠心肌微血管内皮细胞凋亡的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 723-728.
[6]	刘青, 万碧江. 针刀治疗胶原诱导性关节炎大鼠滑膜组织Bcl-2/Bax的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 729-734.
[7]	谢崇新, 张磊. 保留与不保留残端重建前交叉韧带术后膝关节退变的比较[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 735-740.
[8]	吴子健, 胡昭端, 谢有琼, 王峰, 李佳, 李柏村, 蔡国伟, 彭锐. 3D打印技术与骨组织工程研究文献计量及研究热点可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 564-569.
[9]	李晓壮, 段浩, 王伟舟, 唐志宏, 王旸昊, 何飞. 骨组织工程材料治疗骨缺损疾病在体内实验中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 626-631.
[10]	苏丽萍, 路子扬, 刘丽, 张巍, 苏天园, 胡夏韵, 蒲红伟, 韩登峰. 二乙酰吗啡致大鼠小脑颗粒神经元细胞凋亡过程中C-Jun、Cytc和Caspase-9的作用#br#[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3943-3948.
[11]	姜涛, 马磊, 李志强, 寿玺, 段明军, 吴硕, 马创, 魏琴. 血小板衍生生长因子BB诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3937-3942.
[12]	左振魁, 韩佳瑞, 计树灵, 贺璐璐. 银杏酮酯预处理减轻辐射所致模型小鼠的急性肠损伤[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3666-3671.
[13]	张亮, 马晓燕, 王佳虹. 肾衰饮调控慢性肾功能衰竭大鼠肾脏细胞凋亡的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3672-3677.
[14]	谢阳, 吕志宇, 张淑江, 龙婷, 李作孝. 重组腺病毒介导神经生长因子转染实验性自身免疫性脑脊髓炎模型小鼠少突胶质细胞的凋亡及髓鞘化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3678-3683.
[15]	陈崧, 何远丽, 谢雯佳, 钟林娜, 王剑. 磷酸钙纳米颗粒药物递送系统在骨组织工程研究与应用中的优势[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3565-3570.