肿瘤细胞三维培养支架、血管及细胞间的相互作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.42.016

摘要/Abstract

摘要：

背景：肿瘤组织工程通过构建综合的培养模型，充分模拟肿瘤在体内生长的微环境，可以较好地研究肿瘤发生发展的动力学及相关治疗策略。
目的：综述肿瘤工程技术中的肿瘤细胞三维培养。
方法：以“tumor engineering; 3D culture; biological materials; dynamic”为关键词，检索PubMed数据库1992年1月至2013年3月相关文献，纳入有关肿瘤工程、肿瘤细胞三维培养、生物支架材料及肿瘤微环境的相关文章。
结果与结论：三维培养因其可再现组织细胞的体内生长情况，已成为研究肿瘤耐药性、侵袭性和肿瘤微环境的重要平台，在许多领域表现出逐步取代平面培养技术的趋势，为肿瘤研究提供了一个非常接近于体内真实情况的研究平台。近年来，随着肿瘤工程学的发展，多种新型高分子聚合材料被应用于肿瘤细胞的三维立体培养，三维培养技术逐渐成为肿瘤生物学领域研究的热点，其利用各种方法及材料使细胞呈空间立体方式生长，形成类似体内生长环境的生物支撑或基质，建立细胞间及细胞与胞外基质间的相互联系，并形成特定的类似组织样的三维空间结构。生物材料就是种子细胞生长的土壤，在肿瘤工程中起着替代细胞外基质或组织、器官的基质的作用。而随着三维细胞培养技术在肿瘤研究中的广泛应用，其已成为肿瘤耐药、血管形成、细胞间相互作用、信号转导、干细胞等方面研究不可或缺的有力工具。

关键词: 生物材料, 生物材料综述, 肿瘤工程, 三维培养, 生物材料, 动力学, 细胞

Abstract:

BACKGROUND: The tumor tissue engineering can build an integrated culture model to fully simulate the in vivo microenvironment of tumor growth, which can be used to study tumor developmental dynamics and related treatment strategies.
OBJECTIVE: To review the three-dimensional culture of tumor cells using tumor engineering technology.
METHODS: PubMed database was retrieved for articles related to tumor engineering, three-dimensional culture of tumor cells, biological scaffold materials and tumor microenvironment published from January 1992 to March 2013.
RESULTS AND CONCLUSION: Three-dimensional culture, because of its reproducible tissue and cell growth in vivo, has become an important platform for study of tumor resistance, invasiveness and tumor microenvironment. The three-dimensional culture has showed a trend to gradually replace the flat culture technique in many fields, and provides a research platform which is very close to in vivo environment. In recent years, with the development of tumor engineering, a variety of new polymer materials have been used in the three-dimensional culture of tumor cells. Three-dimensional culture technology is becoming a hotspot in the field of tumor biology, in which, using a variety of methods and materials, the cells show a growth in the spatial manner to form a biological support or matrix similar to in vivo growth environment. Biomaterials have become the soil on which seed cells can grow well, and plays an alternative to the extracellular matrix or the matrix of tissues and organs in the tumor engineering. Therefore, the three-dimensional cell culture has been widely used in cancer research, which has become a powerful tool to tumor drug resistance, angiogenesis, cell-cell interaction, signal transduction, stem cells and other research.

Key words: biocompatible materials, tumor cells, cultured, cell culture techniques, stents

中图分类号:

R318

胡雪峰，郑立，赵劲民. 肿瘤细胞三维培养支架、血管及细胞间的相互作用[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(42): 7442-7448.

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图/表（结果） 1

2.1 种子细胞 三维培养种子细胞是肿瘤工程构建的核心，是肿瘤工程研究领域中的基础环节。首先用于三维培养的细胞需满足以下3个基本前提：①具有特定的分化表型或定向分化潜能。②可靠的细胞来源。③不引发移植排斥反应。基于这些原因，人类肿瘤细胞是首选对象。首先，肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。肿瘤细胞形成集落(克隆)的能力比正常细胞强，另外增殖数量增多扩展时接触抑制消除，细胞能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物。其次，永生性也称不死性，在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡，这有利于细胞的培养及收集。再次，肿瘤细胞在缺氧状态下高表达血管生成因子，提示肿瘤细胞在肿瘤发生和演进阶段有间接促血管生成作用^[6]。有研究发现两种G蛋白联受体，甲酰化肽受体和趋化因子受体4是血管生成的重要介导分子^[7]，这有利于肿瘤成活尤其利于应用组织工程构建体内肿瘤模型。第四，肿瘤细胞可合成一些多肽类生长因子，作用于自身相应的功能性受体，通过自分泌环路维持其增殖^[8]。一些正性调控因子，如胰岛素样生长因子、白细胞介素6^[9]、表皮生长因子等促进肿瘤细胞生长^[10-11]。

2.2 土壤-生物支架材料 生物材料就是种子细胞生长的土壤，在肿瘤工程中起着替代细胞外基质或组织、器官基质的作用。

理想的肿瘤工程的支架材料具有以下特点：①无毒性，具有良好的生物组织相容性^[12-13]^，不引起机体的免疫排斥反应。②有一定孔隙率，良好的表面活性[14]，维持生长其上的细胞形态和表型，为三维生长的细胞提供支架，使细胞间形成适宜的空间分布。③具有生物可降解性，可塑性和一定的机械强度[14]。④能增进细胞的黏附和增殖[15-16]，诱导细胞定向分化。不同工程组织、器官的体外构建对生物材料生物活性的要求各不相同。目前，肿瘤细胞三维培养所用的生物材料众多，有细胞外基质、高分子聚合材料及有机材料复合物等。

肿瘤细胞三维培养所用的生物材料：

2.2.1 细胞外基质 胶原为细胞基质的一种结构蛋白，含有1个或者几个由a-链组成的三螺旋结构区域，是细胞外基质中的框架结构，有很高的机械强度及良好的生物相容性。Ⅰ型胶原蛋白是天然成分的结缔组织，已经被证明是最具前景的一项生物材料，因为其具有优良的生物相容性、丰富的来源和清楚免疫学背景^[17]，它已被广泛应用于组织工程，特别是在以水凝胶形式应用^[18-21]。

例如有研究将胶原与壳聚糖分别按7∶1，5∶1，3∶1质量比混合，冷冻干燥法成膜，碾压平整后制成胶原-壳聚糖复合多孔支架，将复合支架制成直径 1.0 cm的圆片，依次经过固定、冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、展片与烘片行一般物理性状观察、苏木精-伊红染色和Masson染色观察内部结构；再将另一圆片依次经过固定、洗涤、脱水、置换、浸透、包埋后聚合、临界点干燥、喷镀、安置处理后制成超薄切片进行电镜扫描，观察其超微结构特性。结果显示胶原-壳聚糖复合支架外观呈微黄色，半透明状，可见微孔状结构，柔韧适度，富有弹性，抗张强度约为4.0 MPa，孔径大小基本一致，保持在80-260 μm，孔隙率在95%以上，且孔与孔相互贯通，呈立体网状结构。结果说明胶原-壳聚糖复合支架的结构和物理性状符合组织工程心瓣膜材料的要求。

胶原凝胶支架为细胞生长提供了一个适宜的微环境，其适当的机械性能和结构特性不仅促进细胞与细胞、细胞与外基质的相互作用，还可促进生长因子的释放，以及细胞外基质的沉积。胶原蛋白具有较低的免疫反应，可促进细胞增长和黏附，并且不会引起炎症或细胞毒性反应。Choe等^[22-23]应用Ⅰ型胶原作为生物材料支架成功构建出肺纤维母细胞体外三维培养模型。Chen等^[24]应用胶原“脚手架”构建了人乳腺癌MCF-7细胞三维耐药模型。

2.2.2 高分子聚合材料 聚乳酸-羟基乙酸共聚物由乳酸和羟基乙酸单体随机聚合而成，是一种可降解的功能高分子有机化合物，无毒，具有良好的生物相容性及成囊和成膜的性能，被广泛应用于肿瘤工程领域。例如有研究观察超声引导下瘤内注射多西他赛聚乳酸-羟基乙酸微球对荷人三阴性乳腺癌裸鼠移植瘤增殖的抑制作用。实验采用乳化溶剂挥发法制备多西他赛聚乳酸-羟基乙酸微球，扫描电镜观察微球的表面形态及粒径，高效液相色谱法测定包封率、载药率及体外释放情况。建立荷人三阴性乳腺癌裸鼠移植瘤模型，随机分为5组，模型组无处理；微球组在肿瘤内注射空白聚乳酸-羟基乙酸微球1次；多西他赛瘤内注射组在肿瘤内注射多西他赛注射液(多西他赛剂量为10 mg/kg)，每10 d给药1次，连续4次；多西他赛聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球低剂量组在肿瘤内注射载药微球(多西他赛剂量为20 mg/kg)1次；多西他赛聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球高剂量组在肿瘤内注射载药微球(多西他赛剂量为40 mg/kg)1次。结果显示，多西他赛聚乳酸-羟基乙酸微球平均粒径23.1 μm，包封率为96.3%，载药率为4.82%，40 d累积释放药物85.7%；超声引导下多西他赛聚乳酸-羟基乙酸微球瘤体内注射具有明显的抗肿瘤作用，高剂量组抑瘤率达65.7%，彩色多普勒超声见肿瘤血流信号明显减少，病理学检查见肿瘤组织大片坏死，提示超声引导下瘤内注射多西他赛聚乳酸-羟基乙酸微球可明显抑制荷人三阴性乳腺癌裸鼠移植瘤增殖。Tang等^[25]利用聚乳酸-羟基乙酸共聚物“脚手架”成功构建了肝癌裸鼠模型和体外三维模型。Loessner 等^[26]利用羟基乙酸构建的口腔鳞状细胞癌模型，病理切片发现高度增殖的细胞位于肿瘤模型表层，而凋亡或坏死细胞处在中心，这表明此模型肿瘤块的含氧水平与体内实体肿瘤类似，此外，发现细胞在羟基乙酸支架中释放促血管生成分子(血管内皮生长因子，白细胞介素8和碱性成纤维细胞生长因子)，与肿瘤内缺氧那一部分组织相一致。

还有学者利用多孔的聚乳酸-羟基乙酸共聚物/聚乳酸微粒与其他各种材料，如脱乙酰壳多糖或聚乙烯醇混合成生物可降解的聚合材料^[27]，该微粒的优点就是可提供一个大的表面区域，可更好地促进细胞黏附和生长。研究显示聚乳酸/聚乙烯醇聚合微粒促人乳腺癌细胞株MCF-7的黏附性明显优于普通材料，MCF-7在微颗粒包绕的环境中生长，最后形成集落细胞群；这些结果可初步证明微粒作为支架用于肿瘤模型是可行的。

丝素是天然高分子聚合物，由蚕丝蛋白、单纤维蛋白和丝胶蛋白等组成^[28-29]，具有良好的生物相容性和生物可降解性，有一定的机械强度并能增进细胞的黏附和增殖^[30-34]。Tan等^[35]应用丝素蛋白“脚手架”体内三维培养骨肉瘤细胞，研究骨肉瘤的生理功能，发现骨肉瘤细胞在3D丝素支架表面生长，能够表达低氧诱导因子1a和碱性成纤维细胞生长因子，并且表达水平接近严重联合免疫缺陷移植瘤小鼠的表达水平。

2.2.3 有机材料复合物 琼脂糖和藻酸盐都是从藻类提取的线性多糖，经纯化处理后可避免引起移植后免疫反应^[36]，但藻酸盐机械性能和细胞黏附性差。将天然高分子壳聚糖和藻酸盐结合后的多通道支架可以克服这些缺陷。Santini等^[37]利用3%琼脂成功构建出人骨肉瘤MG-63体外三维培养模型。Akeda 等^[38]利用藻酸盐支架材料构建出人骨肉瘤LM-8裸鼠模型。随着对材料-生物体相互作用机制的深入研究，对生物材料的要求已从包括机械强度、亲水性、可降解性和易加工程度等理化性能和生物相容性的基本要求，发展到对生物材料形状结构进行精密设计和加工，以及对生物材料表面进行改造和修饰，赋予生物材料特定的生物活性和功能^[39-40]。

随着对生物支架材料、材料-生物体相互作用机制研究的深入，仿生支架材料将成为最理想的生物支架材料^[41]。然而，细胞的习性也会依赖于这些生物材料的各种特性，包括他们的化学性能如材料的表面特性(疏水性/亲水性，质地)和结构(孔隙率，表面积，网络性)。作为合成支架只是简单的模拟天然组织，还达不到肿瘤体内微环境结构，所以要想更进一步达到肿瘤体内微环境层面是一项复杂而又具有挑战性的任务。

2.3 三维培养方式 细胞三维培养方式分静止性和动力性两种。静止性三维培养是把细胞直接种植在三维载体上，体外不施加任何物理方法进行的培养。由于重力作用，细胞多聚集到载体的底部和载体之外，使细胞分布不均，从而影响了细胞生长，不利于细胞诱导分化，这限制了该项技术的应用。随着三维培养技术的不断发展，动力性三维细胞培养逐渐受到国内外学者的青睐，其为细胞生长提供了适宜的生物性微环境和力学刺激，从而更好地促进细胞功能的发挥。动力性三维细胞培养的优点在于：其一，能使细胞均匀分布在三维载体中，可减少接种细胞数量；其二，能够促进氧气和营养物质向载体内部输送，促进载体中黏附生长细胞的增殖；其三，为细胞生长提供了适宜的生物性微环境和力学刺激，促进细胞功能和定向分化能力的发挥。

1992年美国国家航空和宇宙航行局在地面上模拟微重力条件下细胞的生长而开发的一种新型细胞及组织培养装置——旋转壁式生物反应器^[42-43]，此种反应器能克服许多二维细胞培养条件的限制。在此种反应器内由于细胞所受剪切力极低，而且细胞之间有三维联系的机会，因而所培养的细胞功能更接近于自然细胞，并且可形成更接近自然的组织。Radtke 等^[44]以多孔胶原微载体为支架，利用旋转壁式生物反应器通过高速旋转和低速旋转两种不同幅度成功培养出三维上皮细胞模型。1994年Freed等^[45]首次建立了微重力条件下小牛软骨细胞的三维培养模型，获得了与体内软骨组织形态和功能相似的组织块。liu等^[46]以改良透明质酸、胶原蛋白和纳米羟基磷灰石复合材料为“脚手架”，利用动态应变循环灌注生物反应器模仿骨组织的机械力学微环境，动态性三维培养前成骨干细胞MC3T-E1，结果显示细胞在支架中分散动态生长并伸出伪足，体外培养12 d后胶原蛋白1表达水平增强，骨桥蛋白表达降低。Goral等^[47]利用一种基于灌注的微流体反应装置，在不添加任何生物支架材料的条件下创造一个适合于肝细胞动态生长的流体微环境，结果显示这种培养方式极大促进了肝细胞膜的极性表达，使肝细胞缝隙连接并形成类似微管形网络结构。Yeatts等^[48]利用管状流体系统生物反应器，以藻酸盐珠作为支架三维动态培养人间充质干细胞，研究显示这种生物反应器动态培养方式相比静态培养更能促进间充质干细胞的增殖和分化。由上可见，当前的三维细胞培养系统越来越趋向于模拟体内正常环境。

2.4 细胞外环境影响因素 利用肿瘤工程构建的肿瘤模型可连续分泌血管内皮生长因子和血小板生长因子来诱导血管再生和稳固血管^[49]，它模仿了在血管再生期间内皮细胞和基质之间的相互生理作用，这项技术已被成功地应用于癌症研究中。这种三维培养方法相比二维能更准确地复现体内肿瘤生长特性和化疗药物对肿瘤生长的抑制机制^[50-57]。因此，很多学者认为可通过抗血管生成来治疗肿瘤，但最近生物研究怀疑在限制肿瘤血管生成的同时会不会有不良反应发生，如血栓形成、大出血，甚至会有变异的亚种肿瘤细胞生成^[58-60]。鉴于此，能否设计一个肿瘤模型来研究肿瘤细胞对脉管系统的作用？可否进一步认识细胞外基质、蛋白酶和其他分子，是起促进还是抑制作用？

Fischbach-Teschl和Stroock^[61]提出利用水凝胶矩阵仿灌注来模拟微脉管系统，就可以回答第一个疑问。这种技术在被证实之前，Fischbach-Teschl和Stroock还专门提出要把肿瘤细胞和其他非肿瘤细胞综合到这个培养平台来研究血管生成机制^[62-63]。各种蛋白质、糖蛋白和多糖组成细胞外基质，以及这些分子是通过如何组装和分布来影响肿瘤细胞的习性是要回答上面提出第二个问题的关键。通过解耦联、细胞与细胞外基质的相互作用，以及组织缺氧这些方式，发现细胞与细胞外基质的相互作用可以调解血管生长因子和白细胞介素8的分泌，这在口腔鳞状细胞癌细胞系及胶质母细胞瘤细胞系已得到证实，同时也表明在这些细胞系中缺氧是调节血管内皮生长因子生成的关键^[64]。就肿瘤血管生成因子分泌而言，不同肿瘤存在其特异性，只控制血管生长因子这一个因素不足以持续抑制肿瘤的生长，因此有必要从细胞外基质中探索其他生血管开关组件。有研究指出基底膜的特定序列层粘连蛋白111负责传送正确信号给乳腺上皮细胞确保其生成乳腺组织^[65]。随着乳腺癌的进展，这些信号会逐渐丢失，随之而来是正常组织结构的丧失，这会诱导血管内皮生长因子表达并激活血管生成级联反应的开关^[66]。利用这类培养方法研究不同肿瘤类型可以发现一些新奇的可溶性和非溶性调节血管因子。因此，许多技术被开发来研究肿瘤微环境在肿瘤发生、发展和抵抗治疗中的作用，这也预示肿瘤生物学在未来可能会成为生物工程一个重要的发展方向。

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引言

众所周知，体内肿瘤微环境非常复杂，细胞被细胞外基质所包裹，细胞与基质间处于动态的相互作用，同时还有信号分子及细胞因子等参与。相比于体内的肿瘤细胞，传统的体外二维培养细胞呈现出的恶性程度明显下降，细胞相关的性质如分化、极性、细胞间通讯及与细胞外基质接触等均发生了变化，因而并不能代表体内的状况^[1-2]，因此其结果总是不能很好地诠释体内体系，这就造成了模型与真实肿瘤病灶之间的差距。

目前的组织工程领域发展迅速，在某些领域已可重现天然组织的形貌、结构或化学组成，并已实现基本修复组织、可替代天然组织的目标^[3]。反观肿瘤领域，大量研究都未重视肿瘤所处的三维微环境，还只是处于较滞后的状态。于是Ghajar 等^[4]提出了“肿瘤工程”这一理念，即将组织工程化技术应用于肿瘤构建上。2007 年，Fischbach 等^[5]首次将组织工程技术用于体内肿瘤模型的构建。肿瘤工程的核心就是建立细胞与生物材料的三维空间复合体，即具有生命力的活体组织，用以对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代。

三维培养是利用各种方法及材料使细胞呈空间立体方式生长，更接近于体内生长模式，形成类似体内组织的结构，发挥其功能。自Roux于1885年从鸡胚中分离细胞首次建立体外细胞组织培养以来，单层细胞组织培养技术已有百余年的历史。1907年，Harrison培养蛙胚神经成功，创立的悬滴培养法是最早的动物细胞二维培养法。1个多世纪以来，单层细胞组织培养有了蓬勃发展，特别是在制药或疫苗合成等产业化领域。但是在很多情况下，单层细胞组织培养技术所取到的研究结果和体内的情况不符合，因为细胞在体内的生长环境是立体的，细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间处于动态相互作用。体外二维培养很难反映细胞在体内的生长变化，因而迫切需要建立一套细胞组织培养技术既能使细胞生长传代，还能最大程度地维持其体内性状，并分化产生新的组织结构，以便全面研究发育过程。随着肿瘤工程的新兴发展，三维细胞组织培养技术就应运而生了，现就肿瘤细胞的三维培养技术进行阐述。