α-硫辛酸抑制慢性低氧大鼠骨骼肌线粒体的氧化应激

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.28.019

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (28): 5216-5222.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.28.019

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α-硫辛酸抑制慢性低氧大鼠骨骼肌线粒体的氧化应激

肖频^{1, 2}，庞奕辉³，彭朋¹，薄海¹

武警后勤学院，1军事训练医学教研室，3远程继续教育处，天津市 300162
2武警江西总队医院药剂科，江西省南昌市 330001

出版日期:2013-07-09 发布日期:2013-07-09
通讯作者: 薄海，博士，讲师，武警后勤学院军事训练医学教研室，天津市 300162 bohaixd@126.com
作者简介:肖频，女，1975年生，汉族，主要从事临床药理学方面的研究。 zpchen_5500@126.com
基金资助:
天津市应用基础及前沿技术研究计划青年基金项目(12JCQNJC07900); 武警后勤学院博士启动基金(WYB201106)

Alpha-lipoic acid inhibits mitochondrial oxidative stress in the rat skeletal muscle with chronic hypoxia exposure

Xiao Pin^{1, 2}, Pang Yi-hui³, Peng Peng¹, Bo Hai¹

1Department of Military Training Medicine, Logistics University of Chinese People’s Armed Police Force, Tianjin 300162, China; 2Department of Pharmacy, Jiangxi Provincial Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Force, Nanchang 330001, Jiangxi Province, China;
3Department of Remote Education, Logistics University of Chinese People’s Armed Police Force, Tianjin 300162, China

Online:2013-07-09 Published:2013-07-09
Contact: Bo Hai, M.D., Lecturer, Department of Military Training Medicine, Logistics University of Chinese People’s Armed Police Force, Tianjin 300162, China bohaixd@126.com
About author:Xiao Pin, Department of Pharmacy, Jiangxi Provincial Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Force, Nanchang 330001, Jiangxi Province, China; Department of Pharmacy, Jiangxi Provincial Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Force, Nanchang 330001, Jiangxi Province, China zpchen_5500@126.com
Supported by:
Youth Foundation of Application Basis and Front Technology Research of Tianjin, No. 12JCQNJC07900*;
Science and Technology Research Foundation of Logistics University of Chinese People’s Armed Police Force, No. WYB201106*

摘要/Abstract

摘要：

背景：α-硫辛酸被誉为“全能抗氧化剂”和“线粒体营养剂”，但其是否可用于慢性低氧骨骼肌的防护，及其相关机制尚不清楚。
目的：观察α-硫辛酸对慢性低氧大鼠骨骼肌线粒体活性氧生成及抗氧化酶系的作用，并探讨α-硫辛酸作用的相关信号通路。
方法：将36只SD大鼠随机分为常氧对照组、单纯低氧组和单纯低氧+α-硫辛酸组。低氧干预为常压低氧帐篷，氧体积分数设定为11.3%；α-硫辛酸干预为标准饲料中添加α-硫辛酸(0.25%)。各种干预均持续4周。
结果与结论：α-硫辛酸显著上调Sirtuin-3表达，提高线粒体ATP合成活力和膜电位，上调线粒体态3呼吸速率、呼吸控制比和磷氧比，下调态4呼吸速率，促进并上调锰超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶等线粒体抗氧化酶系活性，从而抑制线粒体H2O2产生速率，降低线粒体丙二醛含量。表明α-硫辛酸可提高慢性低氧骨骼肌线粒体能量代谢效率，抑制活性氧生成。并通过提高线粒体抗氧化酶系活性，抑制低氧诱导的氧化应激。α-硫辛酸对低氧骨骼肌线粒体的保护效应可能与其上调态3呼吸速率有关。

关键词: 组织构建, 组织构建细胞学实验, 肌肉肌腱韧带, 慢性低氧, α-硫辛酸, 线粒体, Sirtuin-3, 氧化应激, 骨骼肌, 省级基金

Abstract:

BACKGROUND: α-lipoic acid is named as “nature antioxidant” and “mitochondrial nutrition”. But it is unclear whether α-lipoic acid can be used to protect skeletal muscle with chronic hypoxia exposure, as well as the relative mechanism.
OBJECTIVE: To observe the effect of α-lipoic acid on the antioxidant enzymes and oxidative stress in rat skeletal muscle with chronic hypoxia exposure, and to investigate the relative signaling pathway of α-lipoic acid.
METHODS: Thirty-six Sprague Dawley rats were randomly divided into three groups: normoxia control group, hypoxia control group, and hypoxia+α-lipoic acid group. Rats in the hypoxia control group were subjected to hypoxia exposure in normobaric hypoxic tent with 11.3% oxygen concentration. Rats in the hypoxia+α-lipoic acid group were induced by adding α-lipoic acid (0.25%) in the normal diet. All the interventions were lasted for 4 weeks.
RESULTS AND CONCLUSION: α-lipoic acid in hypoxia could markedly enhance the mitochondrial Sirtuin-3 expression, improve the mitochondrial adenosine triphosphate synthesis activity and membrane potential, up-regulate the mitochondrial state 3 respiratory rate, respiratory control ratio and ratio of phosphorus to oxygen, down-regulate the mitochondrial state 4 respiratory rate and promote and up-regulate the activity of mitochondrial antioxidant enzymes such as manganese superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase, thus inhibiting mitochondrial H2O2 generation rate and reducing mitochondrial malondialdehyde level. The results indicated that α-lipoic acid could improve the efficiency of energy metabolism of chronic hypoxia skeletal muscle mitochondria and inhibit reactive oxygen generation, and it could inhibit the oxidative stress through improving antioxidant enzyme activity of mitochondria. The protection mechanism of α-lipoic acid on hypoxia skeletal muscle mitochondria may be related to the increasing of mitochondrial state 3 respiratory rate.

Key words: tissue construction, cytology experiment in tissue construction, muscle tendon ligament, chronic hypoxia, α-lipoic acid, mitochondria, Sirtuin-3, oxidative stress, skeletal muscle, provincial grants-supported paper

中图分类号:

R318

肖频，庞奕辉，彭朋，薄海. α-硫辛酸抑制慢性低氧大鼠骨骼肌线粒体的氧化应激[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(28): 5216-5222.

Xiao Pin, Pang Yi-hui, Peng Peng, Bo Hai. Alpha-lipoic acid inhibits mitochondrial oxidative stress in the rat skeletal muscle with chronic hypoxia exposure[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(28): 5216-5222.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析 实验纳入大鼠36只，由于不能耐受低氧以及长期用药，单纯低氧组死亡3只，低氧+α-硫辛酸组死亡2只，最终有31只大鼠进入结果分析。

2.2 各组大鼠骨骼肌线粒体H₂O₂产生速率及丙二醛水平的变化 单纯低氧组骨骼肌线粒体H₂O₂产生速率及丙二醛水平显著高于常氧对照组(P < 0.05，P < 0.01)。与单纯低氧组比较，低氧+α-硫辛酸组骨骼肌线粒体H₂O₂产生速率及丙二醛水平明显降低(P < 0.05，P < 0.01)，见表1。

2.3 各组大鼠骨骼肌线粒体呼吸功能和能量代谢指标的变化见表2。

单纯低氧组大鼠骨骼肌线粒体ST3，RCR，ADP/O，ATP合成活力、膜电位显著低于常氧对照组 (P < 0.05)，而大鼠骨骼肌线粒体ST4显著高于常氧对照组(P < 0.05)。与单纯低氧组比较，单纯低氧+α-硫辛酸组大鼠骨骼肌线粒体ST3，RCR，ADP/O，ATP合成活力、膜电位明显升高(P < 0.05)，ST4显著降低 (P < 0.05)。

2.4 各组大鼠骨骼肌SIRT3 mRNA和蛋白表达的变化 单纯低氧组大鼠骨骼肌SIRT3 mRNA和蛋白表达均显著低于常氧对照组(P < 0.05)。与单纯低氧组比较，单纯低氧+α-硫辛酸组大鼠骨骼肌SIRT3 mRNA和蛋白表达明显升高(P < 0.05，P < 0.01)，见图1。

2.5 各组大鼠骨骼肌线粒体抗氧化酶系活性的变化 单纯低氧组大鼠骨骼肌线粒体锰超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶活性显著低于常氧对照组(P < 0.05)。与单纯低氧组比较，单纯低氧+α-硫辛酸组大鼠骨骼肌线粒体锰超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶活性明显升高(P < 0.05， P < 0.01)，见表3。

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引言

细胞低氧是由于组织氧气供应或利用障碍时，细胞形态和功能发生异常改变的病理过程，常发生于移居高海拔地区人群，也是慢性阻塞性肺疾病、贫血、心力衰竭等临床疾病的主要表现^[1-3] 。低氧可导致骨骼肌蛋白合成/分解失衡、能量代谢障碍、肌细胞凋亡等，表现为骨骼肌萎缩和劳动能力降低，严重影响机体生存质量。作为机体重要的运动系统和有氧代谢器官，骨骼肌对低氧十分敏感。低氧可导致骨骼肌能量代谢障碍、细胞凋亡增加、肌纤维修复和再生能力降低等，表现为肌肉萎缩和工作能力低下^[4-6] 。因而探索抑制骨骼肌低氧损伤的有效防护措施具有重要意义。
氧化应激是低氧损伤的重要机制之一^[7] 。线粒体呼吸链通过将电子传递给氧为细胞提供90%以上能量，同时其电子漏也是内源性活性氧产生的重要机制。为了消除活性氧的氧化损伤效应，线粒体内存在大量的抗氧化酶系，包括锰超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶等^[8] 。研究表明，低氧状态下线粒体抗氧化能力低于其产生活性氧的能力，线粒体功能组分氧化损伤，导致线粒体和细胞功能异常^[9] 。此外，过量活性氧还可通过激活核转录因子κB、丝裂原活化蛋白激酶等信号通路，抑制线粒体修复和生物合成，线粒体融合/分裂失衡，促进炎症反应和细胞凋亡^[10-11] 。作者前期发现，慢性低氧诱导线粒体活性氧大量产生，通过抑制激活转录因子1通路降低线粒体抗氧化体系活性，进一步加剧氧化应激^[12] 。
α-硫辛酸是一种非酶类天然抗氧化剂，不仅可直接清除活性氧，而且还可刺激内源性抗氧化剂的再生^[13] 。此外，α-硫辛酸还是线粒体有氧代谢和能量转换相关酶的辅酶因子。因而α-硫辛酸被誉为“全能抗氧化剂”和“线粒体营养剂”，广泛应用于糖尿病、器官缺血再灌注等多种疾病的治疗^[14] 。α-硫辛酸是否可用于低氧骨骼肌的防护尚未见报道。实验建立大鼠慢性低氧模型，并给予α-硫辛酸干预，观察α-硫辛酸对慢性低氧大鼠骨骼肌线粒体活性氧生成及抗氧化酶系的作用，并探讨α-硫辛酸作用的相关信号通路。

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2011年9至12月在武警后勤学院军事训练医学教研室完成。

材料：

实验动物：清洁级健康雄性SD大鼠36只，鼠龄5个月，体质量189-216 g，由北京华阜康生科技股份有限公司提供，合格证号：SCKK(京)2009-0004。分笼饲养，自由进食水，饲养环境为20-25℃，光照12 h。实验符合动物伦理学要求。

研究α-硫辛酸作用的主要试剂及仪器：

方法：

实验分组：动物适应性喂养1周后，按随机数字法分为3组：常氧对照组、单纯低氧组和低氧+α-硫辛酸组，每组12只。

慢性低氧模型的建立及α-硫辛酸干预：参照文献[15]，将大鼠置于常压低氧帐篷，氧体积分数设定为11.3%，持续低氧暴露4周，动物每日清晨返回常氧环境1 h，打扫卫生、换食水。常氧对照组和单纯低氧组大鼠给予标准啮类动物饲料(北京华阜康生科技股份有限公司)喂养，低氧+α-硫辛酸组喂养时在标准啮类动物饲料中添加α-硫辛酸(0.25%)，该α-硫辛酸干预剂量被证明可提高大鼠骨骼肌线粒体能量代谢功能^[16] 。各组均自由进食水。

组织标本制备：各组大鼠均于末次低氧后即刻断头处死，迅速分离双侧腓肠肌，留取1 cm³大小组织块， -80 ℃冻存，用于mRNA检测；其余组织参照作者既往研究[17] ，差速离心法提取线粒体。将大鼠肌组织剔除脂肪及结缔组织、剪碎，加100 mL介质(0.12 mol/L KCl, 20 mmol/L Hepes, 5 mmol/L MgCl₂, 1 mmol/L EDTA, pH 7.4)，匀浆1 200 r/min，上下3次。600×g离心10 min，弃沉淀。上清液于17 000×g离心10 min。沉淀悬浮在 20 mL介质中，7 000×g离心10 min。沉淀悬浮于1 mL介质中。以上操作均在冰浴中进行。线粒体蛋白含量用考马斯亮蓝法测定^[17] 。

Clark氧电极测定大鼠骨骼肌线粒体呼吸功能：参照作者既往研究[18]，采用Clark氧电极测定反应体系氧饱和度的变化，以测算线粒体耗氧速率。取1 mg线粒体蛋白加入3 mL测定介质(0.12 mol/L KCl，20 mmol/L Hepes， 5 mmol/L MgC_l2，1 mmol/L EDTA，pH 7.4)，加入1 mmol/L谷氨酸和0.1 mmol/L苹果酸启动态4呼吸。继而加入2 00 nmol ADP启动态3呼吸。ADP耗尽后回复到态4呼吸。记录耗氧曲线，计算态3和态4呼吸速率(ST3和ST4)、呼吸控制比(RCR)及磷氧比(ADP/O)。

荧光素-荧光素酶发光法测定大鼠骨骼肌线粒体ATP合成活力测定：采用荧光素-荧光素酶发光法进行测定^[19] 。反应温度为25 ℃，反应体系为0.5 mL：0.25 mol/L 蔗糖，3.0 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，0.5 mmol/L乙二胺四乙酸，0.1 mmol/L苹果酸和1 mmol/L谷氨酸，0.05 mg线粒体，20 μmol/L荧光素酶。记录以上体系中发光强度为本底，加入4 μmol/L ADP后启动反应，记录发光强度。

JC-1荧光探针检测大鼠骨骼肌线粒体膜电位：采用JC-1荧光探针检测线粒体膜电位^[20] 。0.5 mg线粒体加入0.9 mL JC-1 染色工作液，避光37 ℃水浴20 min。测定时加入 10 mmol/L谷氨酸和5 mmol/L苹果酸启动线粒体呼吸，于荧光分光光度计下测定红色荧光(激发波长525 nm，发射波长590 nm)和绿色荧光(激发波长490 nm，发射波长 530 nm)，二者比值表示为线粒体膜电位。

线粒体H₂O₂产生速率：参照文献[21]，取0.5 mg线粒体加入测定介质中，加入10 mmol/L谷氨酸和5 mmol/L苹果酸启动线粒体呼吸，继而加入5 μmol/L二氯荧光素，避光37 ℃水浴15 min置于荧光分光光度计(激发波长499 nm，发射波长521 nm)连续测定10 min，计算线粒体H₂O₂产生速率。

比色法测量大鼠骨骼肌线粒体锰超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶活性及丙二醛含量：采用比色法检测线粒体样品超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶活泼和丙二醛含量，操作严格按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书进行。

实时荧光定量PCR法检测大鼠骨骼肌Sirtuin-3(SIRT3) mRNA的表达：参照文献[22]，取冻存肌肉组织，用Trizol Reagent试剂盒抽提总RNA，总RNA定性定量检测后用反转录试剂盒进行反转录反应。SIRT3和内参基因β-actin引物参照文献[23]，由北京博雅生物有限公司合成。PCR反应体系：Buffer (10×) 2.5 µL、MgCl₂ (25 mmol/L) 2.5 µL、dNTP (2.5 mmol/L each) 0.5 µL、Primer (10 pmol) 0.6 µL、β-actin引物(10 pmol) 0.6 µL、taq酶(1×10⁶ U/L) 1 µL、cDNA 4 µL、SYBR Green I荧光染料0.5 µL、ddH₂O 13.3 µL。全过程于PCR扩增仪上进行扩增反应。反应参数：预变性94 ℃/4 min，变性94 ℃/45 s，退火56 ℃/45 s，延伸72 ℃/60 s，循环32次，终末延伸72 ℃ 10 min。连续检测荧光并记录扩增曲线，采用样点拟合法分析结果得到SIRT3和β-actin的Ct值。利用公式计算SIRT3 mRNA对β-actin的相对表达量：SIRT3表达量/β-actin表达量= 2(Ct SIRT3－Ct β-actin)。

引物序列：

Western blot法检测大鼠骨骼肌线粒体SIRT3蛋白的表达：参照文献[24]的方法，线粒体匀浆测定SIRT3表达量，以细胞色素氧化酶Ⅳ为内参。取线粒体蛋白，使蛋白终浓度为10 g/L，将样品根据浓度不同加入2×SDS上样缓冲液，混合液100 ℃加热5 min，冰浴冷却。配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳15%分离胶， 5%积层胶，按预定顺序用20 µL微量加样器将蛋白质样品10 µL加入样品孔，并于一加样孔加入预染Marker 5 µL。80 V电泳20 min后，120 V 电泳2 h。

采用湿法电转印，电泳300 mA，1 h。根据PVDF膜上预染Marker转移情况，判断蛋白的转移情况。用抗体稀释液按照1∶2 000稀释兔抗大鼠SIRT3抗体。用PBST洗涤PVDF膜，将膜放入可加热封接的塑料袋中。以0.1 mL/cm²的量加入稀释的一抗，室温温育2 h或4 ℃过夜PBS洗涤3次。然后用抗体稀释液按照 1∶1 000稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗。用PBST洗涤PVDF膜，将膜放入可加热封接的塑料袋中。以0.1 mL/cm2的量加入稀释的二抗，室温温育1 h。充分洗涤后，用ECL反应液做发光底物，在暗室用X射线胶片压片曝光，显影、定影后，扫描定量各条带相对灰度值。以常氧对照组条带灰度值为100%，其他2组条带灰度值与常氧对照组条带灰度值的比值，即为其相对表达量(%)。

主要观察指标：大鼠腓肠肌的线粒体呼吸速率，H₂O₂产生速率，ATP合成活力，膜电位，线粒体锰超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶活性，线粒体丙二醛含量，SIRT3 mRNA和蛋白表达。

统计学分析：实验所得各组数据均采用x(_)±s表示，由第一作者应用SPSS 13.0统计软件包进行单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

线粒体氧化应激增加是低氧损伤骨骼肌的重要机制之一^[25-26] 。实验中，单纯低氧组骨骼肌线粒体活性氧生成速率显著增加，丙二醛水平明显升高。同时线粒体ATP合成活力显著降低，反映线粒体结构和功能完整性的膜电位明显下降。这表明，实验中的慢性低氧模型导致大鼠骨骼肌线粒体明显的氧化损伤。实验还发现，低氧暴露同时补充α-硫辛酸，大鼠骨骼肌线粒体活性氧生成速率和丙二醛水平显著降低，线粒体ATP合成活力和膜电位显著升高。α-硫辛酸是一种强抗氧化剂，在生物体内可转化为还原型的二氢硫辛酸，α-硫辛酸和二氢硫辛酸具有较低的氧化还原电势，可消除多种氧自由基，也可还原再生维生素C、维生素E、辅酶Q等多种氧化型抗氧化剂[27-28]。在α-硫辛酸干预糖尿病、心肌缺血再灌注损伤等疾病的研究中，均发现其抑制线粒体氧化应激和改善能量代谢的效应^[29-30] 。文章首次证明α-硫辛酸对慢性低氧骨骼肌线粒体的保护效应。 Sirtuin-3(SIRT3)是依赖于烟碱胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的去乙酰化酶，在哺乳动物中定位于线粒体，通过对酪氨酸乙酰化的相关线粒体蛋白脱乙酰基，正性调控线粒体的氧化还原和能量代谢反应^[31-32] 。实验发现慢性低氧明显抑制骨骼肌SIRT3 mRNA和蛋白表达。Pellegrini等^[33]在人乳腺癌细胞中发现，低氧暴露24h时SIRT3表达显著升高，而持续暴露48 h后，SIRT3表达逐渐降低，这与作者的研究结果一致。此外，实验发现补充α-硫辛酸完全逆转了慢性低氧对骨骼肌SIRT3表达的抑制效应。Valdecantos等^[34]也发现α-硫辛酸可上调非酒精性脂肪肝肝细胞SIRT1和SIRT3的表达。α-硫辛酸上调SIRT3的机制尚不清楚。最近Wagner等^[35]报道，α-硫辛酸孵育C2C12骨骼肌细胞可上调过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α表达。过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α被证明通过活化结合于SIRT3基因启动子的雌激素受体α，刺激SIRT3的表达^[36]。Levett等^[37]发现，慢性低氧导致骨骼肌过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α表达降低。因而推测，α-硫辛酸可能通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α途径上调SIRT3表达，SIRT3参与了α-硫辛酸对骨骼肌抵抗低氧应激的健康效应。文章中，慢性低氧暴露显著下调线粒体抗氧化酶系的活性，包括锰超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶。锰超氧化物歧化酶将线粒体呼吸链产生并释放入线粒体基质的超氧阴离子催化歧化形成相对较稳定的H₂O₂，继而谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶将H₂O₂还原为H₂O。低氧暴露同时补充α-硫辛酸显著增加了锰超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶的活性。值得注意的是，Balkova等^[38]报道，外源性补充抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸抑制了低氧心肌锰超氧化物歧化酶的表达。作者前期也发现，运动预适应提高线粒体抗氧化能力反而抑制了内源性抗氧化体系锰超氧化物歧化酶和解偶联蛋白3对低氧的应答^[39] 。因而α-硫辛酸上调线粒体抗氧化酶系活性与其清除自由基功能无关，可能与α-硫辛酸上调SIRT3表达相关。SIRT3可通过多条途径刺激线粒体抗氧化酶系^[40-42] 。Qiu等^[43]发现SIRT3催化锰超氧化物歧化酶中乙酰化的酪氨酸进行脱乙酰基反应，从而增加锰超氧化物歧化酶的活性。此外，他们还发现在SIRT3缺陷鼠中过表达锰超氧化物歧化酶不能提高线粒体活性氧清除能力，这表明SIRT3是锰超氧化物歧化酶抗氧化活性的必要条件。Kong等[44]利用RNA干扰技术抑制C2C12骨骼肌细胞SIRT3表达，发现过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α相关的锰超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶表达均降低。此外，SIRT3可降低Foxo3a的乙酰化水平，提高依赖于Foxo3a的过氧化氢酶的表达和活性^[45] 。推测α-硫辛酸可能通过上调SIRT3途径刺激线粒体抗氧化酶系活性，进而抑制活性氧引起的氧化应激。文章中，慢性低氧暴露导致所有测定的骨骼肌线粒体力能学参数均异常。此外，与单纯低氧暴露比较，补充α-硫辛酸明显增加ST3，而ST4明显降低，因而RCR和ADP/O显著增加。作者前期研究表明，线粒体活性氧生成速率与态4呼吸速率正相关，活性氧可诱导线粒体质子漏，刺激呼吸链解偶联，降低能量转换效率^[18]。因而实验结果提示补充α-硫辛酸降低了活性氧在线粒体呼吸中所占比例，相对增加了氧化磷酸化所占比例。研究表明，低氧抑制线粒体呼吸链复合体Ⅰ的活性是线粒体能量代谢障碍和活性氧产生增多的主要原因^[46]。Ahn等^[47]利用免疫共沉淀技术发现SIRT3可与复合体Ⅰ结合，通过催化NDUFA9等亚基去乙酰基，促进复合体Ⅰ活性并提高细胞ATP水平。此外，SIRT3还可通过去乙酰基反应激活线粒体呼吸链中的NADH脱氢酶和ATP合成酶，以及三羧酸循环中琥珀酸脱氢酶等关键酶活性^[48-50] 。推测α-硫辛酸通过上调SIRT3增强线粒体呼吸速率和氧化磷酸化效率，在提高线粒体能量输出水平的同时抑制了活性氧的生成。总之，α-硫辛酸可上调SIRT3表达，提高线粒体能量代谢效率，抑制活性氧生成；并上调线粒体抗氧化酶系活性，提高活性氧清除能力。从而抑制低氧诱导的线粒体氧化应激，提高骨骼肌线粒体对低氧的抵抗力。

α-硫辛酸抑制慢性低氧大鼠骨骼肌线粒体的氧化应激

Alpha-lipoic acid inhibits mitochondrial oxidative stress in the rat skeletal muscle with chronic hypoxia exposure

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