不同质量浓度神经肽培养正常人成骨细胞的增殖活性

摘要/Abstract

摘要：

背景：大量的研究表明神经因素可调节骨代谢，迄今为止已发现5种神经肽参与骨代谢过程。
目的：进一步验证神经肽类物质对培养的正常人成骨细胞主要生物学行为的影响。
方法：分别以0.02，0.1，1 mg/L 3种质量浓度的降钙素基因相关肽、血管活性肠肽、物质P、神经肽Y、去甲肾上腺素、骨形态发生蛋白作用于成骨细胞，通过噻唑蓝法比较不同因子的效应、同一因子不同质量浓度的作用以及骨形态发生蛋白与其他5种因子复合后的效应。
结果与结论：5种神经肽类物质及骨形态发生蛋白均能促进成骨细胞的增殖，其中神经肽Y效应最强。并且除了骨形态发生蛋白外，其余5种因子的效应均与剂量成反比。结果提示，5种神经肽类因子及骨形态发生蛋白均能不同程度地促进成骨细胞活性，这从一个侧面对某些肽类物质促进成骨的现象做出了解释。

关键词: 神经肽, 成骨细胞, 生物学活性, 降钙素基因相关肽, 血管活性肠肽, 物质P, 神经肽Y, 酪氨酸羟化酶, 骨形态发生蛋白

Abstract:

BACKGROUND: A large number of studies have demonstrated that neural factors can regulate bone metabolism. To date, 5 types of neuropeptides have been found to participate in bone metabolism.
OBJECTIVE: To verify the effects of neuropeptides on the biological activities of normal osteoblasts in vitro.
METHODS: The osteoblasts were stimulated by calcitonin gene-related peptide, substance P, vasoactive intestinal peptide, neusopeptide Y, noradrenaline, and bone morphogenetic protein (BMP) with concentrations of 0.02, 0.1, 1 mg/L, respectively. The effects of different factors single or associated with BMP were examined by the means of methyl thiazolyl tetrazolium.
RESULTS AND CONCLUSION: The five neuropeptides and BMP could promote osteoblast proliferation. The effect of neusopeptide Y was the strongest, and the effect of other factors was negatively related with dose. Results revealed that neuropeptides and BMP could augment the activities of osteoblasts at the different extent. This could help to explain the osteoblastic improvement of neuropeptides.

中图分类号:

R318

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R318

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参考文献

引言

材料方法

讨论

大量的临床与实验观察表明骨的生长、修复与再建均受神经系统的调控^[1] 。对哺乳动物进行的绝大多数研究均显示，通过手术或化学方法去神经支配的动物，尽管骨矿物沉着和结构可能发生改变，但骨的生长几乎不发生变化。在人类，Glem观察到大脑损伤可刺激骨痂形成与骨折愈合。Dyck认为去神经支配是引起骨折不连和延迟愈合的原因。尽管各学者的研究结果有相驳之处，但是神经系统对于骨生理、病理的调节作用已是公认的事实。目前已报道的参与骨代谢调控的多肽类物质有多种，如BMP、转化生长因子β为代表的骨生长因子，CGRP、神经肽Y、VIP、P物质、TH为代表的神经肽类物质，胰高血糖素样肽(glucagon-like peptide，GLP)、葡萄糖依赖性胰岛素肽(glucose-dependent insulinotropic peptide，GIP)等^[2-3] 。它们被认为是间充质细胞包括骨髓干细胞有丝分裂和/或骨细胞功能的局部调节因子。研究发现中枢神经损伤可引起血清和骨痂中BMP和神经肽类物质的表达发生改变^[4-6] ，体外研究显示肽类物质与 BMP均具有促进成骨细胞增殖的效应，可引起细胞外骨钙素及碱性磷酸酶活性的增高。
在有关5种神经肽类的研究中，对于CGRP的研究最为广泛而深入。已发现有两种降钙素基因即α、β基因，它们分别编码CGRP-α与CGRP-β，而CGRP-β并不像CGRP-α一样具有成骨效应^[7] 。CGRP纤维在骨中分布最为丰富，其主要作用有以下几点：①CGRP是目前已知最有效的血管扩张剂之一^[8] ，可参与骨局部血流的生理调节，与炎症因子一起协同诱导局部水肿的产生。Li等^[9]的研究表明CGRP是通过调节一氧化氮合成酶的表达和活性而在骨折的愈合过程中发挥作用^[10] 。②CGRP有刺激成骨的作用。CGRP在体外可刺激骨集落的增加。③CGRP还可抑制破骨细胞活性和骨吸收作用，并可诱导成骨细胞增殖和骨形成^[11] 。正常人血液循环中存在微量的CGRP，但是由于其作用于骨的有效浓度明显高于循环中的血浆浓度，因此认为CGRP可能是作为一个局部因素来调节骨细胞的功能的。
关于P物质，Hill等^[12]发现其与CGRP共同存在于骨、骨髓、骺板、韧带及肌肉中，但CGRP纤维相对更为丰富。并且在骨中，两者共同分布于骨发生活跃的部位。另外Chung等^[13]揭示了物质P也有刺激成骨的能力，只不过其效应较CGRP为低。从而证实了物质P像CGRP一样是骨干细胞有丝分裂和/或骨细胞功能的局部调节因子。VIP纤维绝大部分分布于骨膜，在骨内主要分布于骨髓与骨骺，其分布与血管无关。VIP在体外可有效地刺激骨吸收，同CGRP一样其循环浓度低于它作用于骨的有效浓度，因此VIP也是骨代谢的局部调节因子。酪氨酸羟化酶是儿茶酚胺生物合成的关键酶，Bjurholm等^[14]通过对酪氨酸羟化酶的阳性染色发现了骨中儿茶酚胺类(如去甲肾上腺素)神经纤维的存在。酪氨酸羟化酶在局部主要通过合成去甲肾上腺素而发挥作用。在骨中神经肽Y与酪氨酸羟化酶神经共同存在于接近生长板的骨骺区和骨髓中，并与血管分布相关。神经肽Y与去甲肾上腺素是强有力的血管收缩剂，共同调节骨组织的血流量。Panuccio^[15]报道神经肽Y可通过激素影响成骨细胞活性，从而降低骨转化。
以上对于5种肽类物质的研究绝大部分是在组织水平进行的，而在细胞水平，尤其具体到某一类型的细胞深入研究5种肽的作用的报道非常少。Bjurholm等^[16]利用成骨样细胞UMR106进行的研究表明细胞表面具有CGRP、VIP、神经肽Y、去甲肾上腺素、PTH的受体，从而说明这些肽类可通过受体对细胞产生影响。Hohmann等^[17]的实验表明VIP可通过cAMP依赖机制引起骨吸收，并进一步推测，这种效应是通过作用于成骨细胞受体，而后引起成骨细胞与破骨细胞之间的动态相互作用发生变化，最后导致的骨吸收。
由于不同物种之间的种系差异，因此各实验结果存在不同程度的差别，不能完全用来解释人类骨生理、病理上的现象。另外，利用肿瘤来源的成骨细胞系进行研究得出的结论也有一定的局限性。同时，作为骨代谢的局部调节因子，肽类因子产生作用的局部有效浓度及最佳浓度是多少还不清楚。成骨细胞的来源目前还未明确，一般认为成骨细胞属于基质细胞系，此基质细胞是从造血干细胞分离出来的^[18-24] ，具有分化为网状细胞、成纤维细胞、成骨系细胞、脂肪基质细胞的能力。可见基质细胞中只有一部分是骨祖细胞，能分化为成骨细胞，这部分细胞称为确定性的骨祖细胞。另外，骨外器官尚广泛存在骨祖细胞^[25] ，这些细胞只有在诱导因子(如BMP等)的诱导下才具有成骨能力^[26] ，因此称为可诱导性骨祖细胞。目前认为骨内膜与外膜细胞、骨衬细胞和骨细胞均属于前类，而间充质细胞可能属于后一类。Park等^[27]分离培养了人的牙乳头细胞，通过检测具有成骨细胞表型及矿化能力，从而认为人的牙乳头细胞具有成骨潜能。Koyama等[28-29]从牙浆组织中分离获得了干细胞，这种细胞具有多向潜能，经体外培养可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞。
本研究利用正常人胚胎骨成功地分离和培养了正常人的成骨细胞，并系统地研究了3种不同数量级浓度的神经肽对于成骨细胞生物学行为的影响。结果表明各种肽类物质均能不同程度地引起正常人成骨细胞的增殖，其中以神经肽Y与VIP的效应最强，另外几种肽的作用无明显差异。各种神经肽分别进行的3种质量浓度的实验，结果均表明0.02 mg/L的作用最强。可以初步认为它们的最佳效应浓度在10^-2数量级附近，并且肽类因子与BMP对于成骨细胞生物学行为的影响是具有浓度相关性的，从而为进一步探讨各种肽的最低有效浓度和最佳效应浓度提供了理论依据。当然，在体内的成骨过程是一个依赖于成骨细胞与破骨细胞活性的复杂的动态过程。但是以上的发现还是可以从一个侧面对肽类物质促进成骨的现象做出解释，神经肽对于成骨细胞具有直接的刺激作用，这无疑是对骨组织的神经调控理论是一个必要的补充。另外，目前对成骨因子诱导成骨机制的研究不断深入，但由于神经肽的提取困难，获取量少、价格昂贵，使其大规模的研究及应用受到一定限制，了解各种肽的最低有效浓度和最佳效应浓度，是各国学者极关注的问题。这对于以后进一步研究把肽类因子作为药物在临床中用来促进成骨有一定的指导意义。

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