2.2  大鼠右膝关节软骨大体观察结果  正常对照组关节软骨呈灰白色，色泽光亮，软骨表面光滑平整，没有关节面裂缝及破损，没有出现软骨下骨质暴露，未见增生，见图1A；模型组关节软骨呈淡黄白色，色泽暗淡，软骨表面粗糙出现剥脱、软骨下骨质暴露、增生，见图1B。

2.3  组织病理观察结果  取关节软骨标本进行苏木精-伊红染色，正常对照组大鼠软骨表面平整，染色清晰，软骨各层清楚可辨，潮线连续完整，细胞排列规则，层次清晰，软骨基质染色均匀，细胞核清晰，见图2A；模型组大鼠软骨表面粗糙不平整，部分区域的细胞核固缩、坏死，钙化层细胞紊乱排列呈簇状，潮线紊乱不连续或消失，细胞排列紊乱，软骨基质染色明显减轻、不均，见图2B。模型组Mankin评分和OARSI分均显著高于正常对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.3  组织病理观察结果  取关节软骨标本进行苏木精-伊红染色，正常对照组大鼠软骨表面平整，染色清晰，软骨各层清楚可辨，潮线连续完整，细胞排列规则，层次清晰，软骨基质染色均匀，细胞核清晰，见图2A；模型组大鼠软骨表面粗糙不平整，部分区域的细胞核固缩、坏死，钙化层细胞紊乱排列呈簇状，潮线紊乱不连续或消失，细胞排列紊乱，软骨基质染色明显减轻、不均，见图2B。模型组Mankin评分和OARSI分均显著高于正常对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.4  酶联免疫法检测各组滑膜组织中钙结合蛋白S100A12、白细胞介素1β、半乳糖凝集素3水平  与正常对照组比较，模型对照组滑膜组织中钙结合蛋白S100A12、白细胞介素1β、半乳糖凝集素3水平显著升高(P < 0.01)；与模型对照组比较，地黄梓醇低剂量组滑膜组织中钙结合蛋白S100A12、白细胞介素1β、半乳糖凝集素3水平有所降低(P < 0.05)，地黄梓醇高剂量组滑膜组织中钙结合蛋白S100A12、白细胞介素1β、半乳糖凝集素3水平降低明显 (P < 0.01)。结果说明地黄梓醇能调控早期膝骨关节炎大鼠滑膜中钙结合蛋白S100A12、白细胞介素1β、半乳糖凝集素3水平，且地黄梓醇高剂量组明显优于地黄梓醇低剂量组，见表2，图3。

2.4  酶联免疫法检测各组滑膜组织中钙结合蛋白S100A12、白细胞介素1β、半乳糖凝集素3水平  与正常对照组比较，模型对照组滑膜组织中钙结合蛋白S100A12、白细胞介素1β、半乳糖凝集素3水平显著升高(P < 0.01)；与模型对照组比较，地黄梓醇低剂量组滑膜组织中钙结合蛋白S100A12、白细胞介素1β、半乳糖凝集素3水平有所降低(P < 0.05)，地黄梓醇高剂量组滑膜组织中钙结合蛋白S100A12、白细胞介素1β、半乳糖凝集素3水平降低明显 (P < 0.01)。结果说明地黄梓醇能调控早期膝骨关节炎大鼠滑膜中钙结合蛋白S100A12、白细胞介素1β、半乳糖凝集素3水平，且地黄梓醇高剂量组明显优于地黄梓醇低剂量组，见表2，图3。

膝骨关节炎是全世界主要的健康问题也是老龄化社会中最常见的疾病^[1]，其病理学特征在于进行性加重的关节软骨退化、骨赘形成、软骨下骨囊肿、关节间隙变窄和关节组织间歇性炎症反应等^[2]。膝骨关节炎的主要临床表现为膝关节移动时疼痛(从坐到站立)、活动受限、晨僵、摩擦音、骨性膨大、“交锁”感等，特别是爬楼梯时疼痛明显，休息后可缓解^[3]。据报道，在安大略省西部和麦克马斯特大学骨关节炎指数中，滑膜炎与最大膝关节疼痛严重程度密切相关^[4-5]。在膝骨关节炎早期，滑膜分泌炎症递质可能是诱导膝骨关节炎发病的重要因素之一，伴随着膝骨关节炎的进一步加重，在这一过程中滑膜始终参与其病理过程^[6]。滑膜组织中钙结合蛋白S100A12、白细胞介素1β、半乳糖凝集素3是诱导膝骨关节炎病理过程中软骨基质降解和破坏的重要因子^[7]。基于目前临床策略治疗膝骨关节炎仍有许多不足，现有的几种药物有很大的毒副作用风险，尤其是对于老年人群，例如乙酰氨基酚引起的肝毒性、非类固醇抗炎药引起的胃肠道毒性作用以及阿片类药物引起的跌倒、骨折和神经错乱等^[8]。将中药应用于临床一直是热门研究，地黄梓醇是从地黄中提取出来的一种环烯醚萜苷化合物，药理作用包括抗细胞凋亡、抗炎等^[9]。为进一步探讨地黄梓醇对早期骨关节炎的作用机制，该研究采用酶联免疫吸附法检测地黄梓醇对早期膝骨关节炎大鼠滑膜组织中钙结合蛋白S100A12、白细胞介素1β、半乳糖凝集素3水平表达的调控作用，阐明地黄梓醇治疗早期膝骨关节炎的作用机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2019年1至5月在南京中医药大学动物实验中心完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  48只成年雄性Wistar大鼠，体质量(290±10) g，由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供，许可证号：SCXK(苏)2017-0001，分笼饲养，以玉米芯鼠饲料(购于南京江宁区龙泉饲料经营部)喂养，采取自由饮水饮食。室内环境：温度控制在(23±2) ℃；人工光照12 h/d；通风良好，气流量≤0.2 m/s；氨浓度<14 mg/m³；相对湿度50%-65%。

1.3.2  实验药物及试剂  S100A12 ELISA试剂盒(批号：E20181201A，货号：CK-E30711R，上海碧云天生物科技有限公司)；半乳糖凝集素3 ELISA试剂盒(批号：E20181201A，货号：CK-E94644R，上海碧云天生物科技有限公司)；白细胞介素1β ELISA试剂盒(批号：E20181201A，货号：CK-E30419R，上海碧云天生物科技有限公司)；地黄梓醇(西安明朗科技生物有限公司)；木瓜蛋白酶(上海恒远生物科技有限公司)；半胱氨酸(上海恒远生物科技有限公司)；水合氯醛(上海恒远生物科技有限公司)。

1.3.3  实验仪器  分析天平(塞多利斯科仪器(北京)有限公司，型号：BSA124S，精度：十万分之一)；烘箱(巴姆(上海)测控技术有限公司，型号：101-2AS)；蒸馏水制水器(上海亚荣生化仪器厂，型号：SZ-97A)；超纯水机(上海和泰仪器有限公司，型号：Master-D UVF)；水浴锅(郑州博科仪器设备有限公司，型号：HW-5L)；酶标仪(美国伯腾仪器有限公司，型号：ELx800)；不同规格的移液器(eppendorf)等。

1.4  实验方法

1.4.1  动物分组及造模  适应性喂养1周后，精准称质量，按体质量由小到大顺序进行编号，采用随机数字表法分成模型组34只，正常对照组14只。早期膝骨性关节炎大鼠模型制备、分组及成功标准参照文献[10-13]，34只大鼠于实验开始后第1，4，7天于右膝关节常规剃毛消毒后关节腔注射4%木瓜蛋白酶联合0.03 mol/L半胱氨酸溶液0.2 mL。正常对照组关节腔注射等量生理盐水。实验开始后第10天随机抽取正常对照组大鼠4只，模型组大鼠4只，采用7%水合氯醛腹腔过量注射麻醉处死后，去除右后肢内侧股骨髁软骨关节面周围软组织，凿取0.3 cm×0.3 cm关节软骨，凿下的每个关节表面软骨附带少量软骨下骨进行组织病理学检查，并使用Mankin和OARSI评分验证结果^[14-15]。造模成功后，将剩余模型大鼠随机分成3组：模型对照组、地黄梓醇低剂量组、地黄梓醇高剂量组，每组10只。

1.4.2  药物干预  依据《中药药理研究方法学》剂量估换计算公式 ^[12]，将推荐成人每日服药量折算为实验大鼠每日服药量。地黄梓醇高剂量组按照100 mg/kg配制，地黄梓醇低剂量组按照10 mg/kg配制(地黄梓醇溶剂为实验室提供的超纯水)，造模成功后第2天早8点给药，每只大鼠按照0.2 mL/kg药物灌胃，正常对照组、模型对照组予同等量生理盐水灌胃，均为1次/d(早8：00)，连续药物灌胃28 d。

1.4.3  标本采集  参照文献[10]采集滑膜组织，于药物干预结束后第1天早8：00过量麻醉处死大鼠，采用10%强力消毒冷溶液完全浸泡10 min，然后大鼠置于超净工作台，仰卧位固定，常规术野消毒，选择右后肢内侧打开右膝关节腔，由髌骨下缘向上延续可见有一层平滑光亮呈淡黄色的滑膜组织，完全剥离滑膜组织然后以手术刀片完整切下。将滑膜组织分离后，按照1∶9=质量(g)∶体积(mL)加入预冷的生理盐水，制成10%匀浆液，机械匀浆，直至呈均匀的乳胶状，然后3 000 r/min离心10 min，吸取上清液分装保存于-80 ℃冰箱保存。

1.4.4  ELISA法检测滑膜组织中钙结合蛋白S100A12、白细胞介素1β、半乳糖凝集素3水平  严格按照ELISA试剂盒说明书执行。钙结合蛋白S100A12、白细胞介素1β、半乳糖凝集素3蛋白标准液于用前24 h内准备。①从室温平衡20 min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4 ℃；②设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL；样本孔先加待测样本10 μL，再加样本稀释液40 μL；空白孔不加；③除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100 μL，用封板膜封住反应孔，37 ℃水浴锅或恒温箱温育60 min；④弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次；⑤每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min；⑥每孔加入终止液50 μL，15 min内使用酶标仪在450 nm波长处测定各孔的吸光度值。在EXCEL工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应吸光度值为纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算滑膜组织中钙结合蛋白S100A12、白细胞介素1β、半乳糖凝集素3水平。

1.5  主要观察指标  ELISA法检测地黄梓醇对各组滑膜组织中钙结合蛋白S100A12、白细胞介素1β、半乳糖凝集素3水平的影响。

1.6  统计学分析  采用SPSS 25.0软件对实验数据进行分析处理。计量资料以x(_)±s表示，多组间采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，两组间比较采用LSD检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

膝骨关节炎是全世界的主要健康问题，并且由于人口老龄化，其疾病负担持续增加，从而引起生活质量的下降及巨大的人力和经济损失^[15]。目前对于此类疾病尚无特效药治疗，西医在早期主要使用镇痛药、局部外用止痛药、非类固醇类消炎药、糖皮质激素、软骨保护药等效果尚可，但也只能暂时改善症状，到了晚期不得不选择手术治疗^[16]。膝骨关节炎诊疗的发展前景是早期发现、早期诊断、早期治疗，是提高疾病预后的关键^[9]。2018年统计中国已有1亿人饱受骨关节炎的折磨^[17]，其中以膝关节的发生率较高^[18]。骨关节炎到2020年将成为第四大致残性疾病^[19]。软骨细胞是关节软骨中最主要细胞类型，通过分泌软骨细胞外基质及蛋白酶类维持软骨细胞外基质代谢平衡，参与关节软骨稳态维持，并受多种生长因子、细胞因子和机械刺激所调控。一旦软骨细胞受损失去维持关节软骨稳态的能力将导致软骨退变并最终引起骨关节炎。有学者提出滑膜炎先于关节软骨的破坏，以滑膜炎性病变为切入点，可能是治疗膝骨关节炎的新靶点^[20]。研究表明，炎症与膝关节骨关节炎的疼痛敏化有关，这就意味着抗炎治疗策略能够减轻一些患者的疼痛并改善关节功能^[21-22]。钙结合蛋白S100A12、白细胞介素1β、半乳糖凝集素3致炎因子在早期膝骨关节炎进展过程中起到重要作用^[6]，抑制炎症因子水平将成为该研究的主要内容。

课题组以往研究认为膝骨关节炎患者血液及关节外组织中分泌的S100A12进入血液循环后，到达患者的关节周围组织如滑膜，则可促进滑膜炎的产生；与以往的研究类似，S100A12具有炎性趋化作用，参与滑膜炎性损伤，进而影响软骨及关节骨的破坏及增生等改变；骨关节炎严重程度与S100A12的表达水平呈正相关^[6]。对于髋骨关节炎患者也有相同的临床试验结果^[23]。临床研究发现白细胞介素1β在膝骨关节炎患者关节软骨中大量表达^[24]，白细胞介素1β水平越高其骨关节炎严重程度越重^[25]。研究表明半乳糖凝集素3可通过促炎作用加速骨关节炎进展^[26-27]，半乳糖凝集素3水平越高骨关节炎越严重^[28]。S100A12在炎性细胞因子环境下可以驱动膝骨关节炎患者白细胞介素1β水平升高^[29]。研究表明半乳糖凝集素3是白细胞介素1β介导的炎症反应的放大器^[30]，同时促炎细胞因子白细胞介素1β的表达可以影响半乳糖凝集素3而加速依赖性小梁骨丢失和骨强度降低，加速膝骨关节炎的进展^[31]。

地黄是传统四大怀药之一，熟地黄主归肝肾两经，具有补阴血、益肾精的功效。《本草纲目》：“填骨髓，长肌肉，生精血”，肯定了熟地黄对筋骨肌肉虚劳诸证的补益作用。目前熟地黄在临床上已经被广泛用于治疗炎性疾病^[32]。地黄梓醇是从地黄中提取出来的一种环烯醚萜苷化合物，2015版《中国药典》明确规定了地黄梓醇作为地黄质量控制的指标^[33]。地黄梓醇的药理作用包括抗细胞凋亡、抗炎等^[9]，但缺乏相应的基础研究支持。

      该实验通过研究不同浓度地黄梓醇对早期膝骨关节炎模型大鼠滑膜组织中S100A12、白细胞介素1β、半乳糖凝集素3水平的影响，来探讨地黄梓醇治疗早期膝骨性关节炎的作用机制，结果表明地黄梓醇可以降低滑膜组织中S100A12、白细胞介素1β、半乳糖凝集素3水平，提示可以将地黄梓醇用于临床治疗早期膝骨关节炎，通过降低滑膜组织中炎症因子水平、减轻炎症反应而实现减缓膝骨关节炎进展。

基于课题组之前临床试验研究结果，以及结合此次研究，取得了以下几项新进展：①实验结果再次证实炎性细胞因子S100A12水平与早期膝骨关节炎的相关性；②完善了从单个炎性细胞因子S100A12水平的研究到多个炎性细胞因子S100A12、白细胞介素1β、半乳糖凝集素3水平研究；③将传统中药地黄应用于实验研究，并探讨地黄梓醇对于早期膝骨关节炎治疗的可行性，完善了之前临床研究的不足。

      考虑到目前临床就诊患者均未能重视肌肉和运动对骨关节炎治疗的重要作用。基于此前临床研究及此次实验研究的结果，接下来将中药地黄与运动疗法相结合应用于临床将成为下一步研究的重点。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

地黄梓醇：是从地黄中提取出来的一种环烯醚萜苷化合物，2015 版《中国药典》明确规定了地黄梓醇可作为地黄质量控制的指标。地黄梓醇的药理作用包括抗细胞凋亡、抗炎等。

半乳糖凝集素3：具有争议的促炎或抗炎活性，取决于各种因素，包括其细胞内或细胞外定位以及与这些过程有关的靶细胞。一方面半乳糖凝集素3通过清除凋亡的中性粒细胞可能有助于消除炎症；另一方面，半乳糖凝集素3通过加强巨噬细胞、肥大细胞和自然杀伤细胞以及T和B淋巴细胞的活化而显示出大部分促炎作用。

基于目前临床策略治疗膝骨关节炎仍有许多不足，现有的几种药物有很大的毒副作用风险，尤其是对于老年人群，例如乙酰氨基酚引起的肝毒性、非类固醇抗炎药引起的胃肠道毒性作用以及阿片类药物引起的跌倒、骨折和神经错乱等。将中药应用于临床一直是热门研究，地黄梓醇是从地黄中提取出来的一种环烯醚萜苷化合物，药理作用包括抗细胞凋亡、抗炎等。目前临床上主要应用氨基葡萄糖来进行膝骨关节炎患者软骨修复，但周期较长且效果仍不明显，接下来课题组将着重于研究中医药对膝骨关节炎患者软骨修复的研究，为临床提供更多选择且减轻患者经济压力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程