不同部位心肌组织裂解液诱导骨髓间充质干细胞定向分化为心肌样细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2142

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (1): 32-37.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2142

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 上一篇下一篇

不同部位心肌组织裂解液诱导骨髓间充质干细胞定向分化为心肌样细胞

韦雅淑1，2，刘红静3，王慧丰1，王珺铎1，赵文婧1，陈维平1

1广西医科大学组织学与胚胎学教研室，广西壮族自治区南宁市 530021；2广西壮族自治区生殖医院，广西壮族自治区南宁市 530021；3广西科技大学医学部，广西壮族自治区柳州市 545000

收稿日期:2019-11-28 修回日期:2019-12-04 接受日期:2020-02-19 出版日期:2021-01-08 发布日期:2020-10-28
通讯作者: 赵文婧，讲师，广西医科大学组织学与胚胎学教研室，广西壮族自治区南宁市 530021 陈维平，教授，广西医科大学组织学与胚胎学教研室，广西壮族自治区南宁市 530021
作者简介:韦雅淑，女，1989年生，广西壮族自治区大化县人，壮族，2018年广西医科大学毕业，硕士，检验技师，主要从事临床检验、干细胞和组织工程应用基础研究。
基金资助:
广西高校中青年教师基础能力提升项目(2017KY0096)；广西再生医学重点实验室开放课题资助项目(桂再重开201703)

Cardiomyocyte-like differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells induced by myocardial tissue lysates from different parts of the myocardium

Wei Yashu1, 2, Liu Hongjing3, Wang Huifeng1, Wang Junduo1, Zhao Wenjing1, Chen Weiping1 #br#

#br#

1Department of Histology and Embryology, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2The Guangxi Zhuang Autonomous Region Reproductive Hospital, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 3School of Medicine, Guangxi University of Science and Technology, Liuzhou 545000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2019-11-28 Revised:2019-12-04 Accepted:2020-02-19 Online:2021-01-08 Published:2020-10-28
Contact: Zhao Wenjing, Lecturer, Department of Histology and Embryology, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China Chen Weiping, Professor, Department of Histology and Embryology, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Wei Yashu, Master, Laboratory technician, Department of Histology and Embryology, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; The Guangxi Zhuang Autonomous Region Reproductive Hospital, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the Basic Ability Promotion Project for Young and Middle-Aged Teachers of Guangxi Universities, No. 2017KY0096; the Open Project of Guangxi Key Laboratory of Regenerative Medicine, No. 201703

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
心肌组织样结构：与心肌组织结构相似，具有能够产生自律性搏动的心肌样细胞，周围含有结缔组织包裹，还含有中空性结构，管壁内表面可见单层排列、核嗜碱性的上皮样细胞，该细胞胞浆少，细胞核大而微凸。
骨髓间充质干细胞定向诱导分化为心肌组织样结构的规律：细胞由长梭形变为短杆状，出现较短小的突起，突起逐渐延长互相交错连接，形成网状；相邻细胞开始有规律地朝向同一方向整齐排列，呈“竹节状”；最后相邻细胞相互融合，形成“肌管状”的结构，能够发生有节律的收缩和舒张，频率90-110次/min。

摘要
背景：骨髓间充质干细胞可定向诱导分化形成心肌组织样结构，但利用不同部位的心肌组织制备心肌组织裂解液构建有差异的微环境，探讨骨髓间充质干细胞定向诱导效率以及相关基因表达的研究甚少。
目的：探究不同部位心肌组织裂解液对骨髓间充质干细胞定向分化为心肌样细胞的影响，评价诱导过程中相关基因的表达与心肌组织工程构建的关联。
方法：选择第3代SD大鼠乳鼠骨髓间充质干细胞，采用全心组织裂解液、心房肌组织裂解液、心室肌组织裂解液构建不同的微环境诱导骨髓间充质干细胞定向分化为心肌样细胞。倒置显微镜、透射电镜观察细胞的形态变化及其超微结构；免疫荧光染色检测α-actin、cTnI的表达；qRT-PCR检测诱导后ANP、HCN4及MLC-2v基因的表达。
结果与结论：①各诱导组的细胞均遵循相似的形态学变化规律，心肌样细胞都能够发生自律性搏动、节律性的收缩和舒张，透射电镜可见大量整齐排列的肌丝，免疫荧光染色α-actin、cTnI均有阳性表达；②全心组织裂解液诱导组能够形成米粒大小、含胶原纤维的心肌组织样结构；③心房肌组织裂解液诱导骨髓间充质干细胞定向分化形成的心房肌样细胞，自律性搏动出现较早、但搏动频率和时间较短，培养液中出现大量分泌颗粒，ANP和HCN4在心房肌样细胞中高表达；④心室肌组织裂解液诱导形成的心室肌样细胞无分泌颗粒，MLC-2v在心室肌样细胞高表达；⑤结果表明，全心组织裂解液可诱导骨髓间充质干细胞形成心肌组织样结构，心房肌组织裂解液可诱导骨髓间充质干细胞向心房肌样细胞分化，心室肌组织裂解液可诱导骨髓间充质干细胞向心室肌样细胞分化。通过构建特定的微环境，骨髓间充质干细胞可以定向分化形成不同部位的心肌样细胞，为心肌组织工程的构建积累实验室数据。

ORCID:0000-0002-4076-6356(赵文婧)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 骨髓间充质干细胞, 全心组织裂解液">, , 心房肌组织裂解液">, , 心室肌组织裂解液">, , 心房肌">, , 心室肌">, , 心肌样细胞

Abstract: Abstract
BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells can be induced into myocardial tissue-like structure in vitro. Myocardial tissue lysates from different parts of the myocardium can be used to construct differential microenvironments. Few studies have investigated the targeted induction efficiency of bone marrow mesenchymal stem cells and the expression of related genes.
OBJECTIVE: To investigate the effects of lysates from different parts of the myocardium on the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into myocardial tissue-like structures and to assess the correlation between the expressions of related genes during induction and myocardial tissue engineering.
METHODS: Passage 3 bone marrow mesenchymal stem cells from Sprague-Dawley rats were cultured. Whole heart tissue lysate, atrial muscle tissue lysate, and ventricular muscle tissue lysate were used to construct different microenvironments to induce bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into cardiomyocyte-like cells. The morphological changes and ultrastructure of cells were observed with an inverted phase contrast microscope and transmission electron microscopy. Expression of α-actin and cTnI was detected by immunofluorescence staining. qRT-PCR was used to detect the expression of upstream molecules ANP, HCN4 and downstream molecules MLC-2v in the cAMP/PKA signaling pathway after induction.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Each induction cell group followed similar morphological changes: Cardiomyocyte-like cells were capable of autonomic beats, rhythmic contractions and relaxations; under the transmission electron microscope, there were a large number of arranged myofilaments; immunofluorescent staining showed positive expression of α-actin and cTnI. (2) The whole heart tissue lysate was able to induce the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into rice grain-sized myocardial tissue-like structures with collagen fibers. (3) Atrial muscle tissue lysate could induce bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into atrial muscle-like cells. Autonomic beats appeared earlier, but the beat frequency and duration were shorter. ANP and HCN4 were highly expressed in atrial myocytes. (4) Ventricular muscle tissue lysate induced bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into ventricular muscle-like cells with no secretory granules, and MLC-2v was highly expressed in ventricular muscle-like cells. (5) To conclude, the whole heart tissue lysate can induce bone marrow mesenchymal stem cells to form myocardial tissue-like structures. Atrial muscle tissue lysate can induce bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into atrial muscle-like cells. Ventricular muscle tissue lysate can induce bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into ventricular muscle-like cells. By constructing a specific microenvironment, bone marrow mesenchymal stem cells can be differentiated to cardiomyocytes in different parts, providing laboratory data for the construction of myocardial tissue engineering.

Key words: bone marrow mesenchymal stem cells">, , whole heart tissue lysate">, , atrial muscle tissue lysate">, , ventricular muscle tissue lysate">, , atrial muscle">, , ventricular muscle">, , cardiomyocyte-like cells

中图分类号:

韦雅淑, 刘红静, 王慧丰, 王珺铎, 赵文婧, 陈维平. 不同部位心肌组织裂解液诱导骨髓间充质干细胞定向分化为心肌样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(1): 32-37.

Wei Yashu, Liu Hongjing, Wang Huifeng, Wang Junduo, Zhao Wenjing, Chen Weiping. Cardiomyocyte-like differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells induced by myocardial tissue lysates from different parts of the myocardium [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(1): 32-37.

图/表（结果） 4

2.1 骨髓间充质干细胞多向分化潜能及细胞表面标志物鉴定结果[3] 成骨诱导培养2周，细胞呈多角形，成骨诱导培养3周，细胞逐渐聚集，茜素红染色可见橘红色钙盐；成脂诱导培养1周，细胞内出现脂滴，随诱导时间增长，脂滴数量增多，油红O染色细胞内可见红色脂滴。骨髓间充质干细胞表面抗原标志物CD90、CD29的阳性率分别为98.2%，98.9%，造血干细胞表面抗原标志物 CD34、CD45的阳性率分别为0.254%，0.214%。
2.2 骨髓间充质干细胞经全心组织裂解液、心房肌组织裂解液、心室肌组织裂解液定向诱导分化过程中的细胞形态变化全心组织裂解液定向诱导骨髓间充质干细胞分化过程中，光镜下观察细胞形态为“长梭形”，见图1A，形成“短杆状”，出现较短小的突起，突起逐渐延长互相交错连接，形成“网状”；相邻细胞开始有规律地朝向同一方向整齐排列，呈“竹节状”；最后相邻细胞相互融合，形成“肌管状”的结构，能够发生有节律的收缩和舒张，频率90-110次/min。诱导后63 d大体可见米白色的心肌组织样结构，见图1B。
在相同诱导时间下，心房肌组织裂解液和心室肌组织裂解液诱导组未出现细胞大量聚集、隆起的心肌组织样结构。心房肌组织裂解液诱导组和心室肌组织裂解液诱导组均形成肌管样结构，见图1C，D，但心房肌组织裂解液诱导组发生自律性搏动的时间较早，搏动频率和持续时间也较短。心房肌组织裂解液诱导骨髓间充质干细胞定向分化可见大量膜包的分泌颗粒，见图1E；而在心室肌组织裂解液诱导组中，没有观察到有此现象，见图1F。

2.3 各诱导组形成心肌样细胞的超微结构观察经透射电镜观察心肌样细胞胞质内均有大量整齐排列的肌丝，见图2A；心房肌组织裂解液诱导组细胞内有大量电子密度高的膜包分泌颗粒，见图2B。

2.4 免疫荧光染色检测心肌样细胞α-actin、cTnI的表达各诱导组细胞免疫荧光染色可见细胞核呈蓝色荧光，α-actin、cTnI呈绿色荧光。心房肌组织裂解液组、心室肌组织裂解液组、全心组织裂解液组的细胞胞质中均有阳性表达，见图3，但在骨髓间充质干细胞中不表达。

2.5 qRT-PCR检测ANP、HCN4和MLC-2v在心肌样细胞的表达以骨髓间充质干细胞作为参照，在正常SD乳鼠心肌细胞中ANP、HCN4和MLC-2v均表达，且表达量最高 (P < 0.05)。在全心组织裂解液诱导组中3种基因都有表达，但表达量低于正常心肌细胞组(P < 0.05)。ANP和HCN4只在心房肌组织裂解液诱导组中表达，而在心室肌组织裂解液诱导组中几乎不表达(P < 0.05)；MLC-2v只在心室肌组织裂解液诱导组中表达，而在心房肌组织裂解液诱导组中几乎不表达(P < 0.05)，见表2。

参考文献

[1] WEI Q, FRENETTE PS. Niches for Hematopoietic Stem Cells and Their Progeny. Immunity. 2018;48(4):632-648.
[2] ZHENG Y, WANG G, CHEN R, et al. Mesenchymal stem cells in the osteosarcoma microenvironment: their biological properties, influence on tumor growth, and therapeutic implications. Stem Cell Res Ther. 2018; 9(1):22.
[3] 刘红静,王慧丰,韦雅淑,等.胰腺组织裂解液诱导骨髓间充质干细胞分化为胰岛样结构的鉴定[J].中国组织工程研究,2019,23(13): 2088-2093.
[4] GABORIT N, LE BOUTER S, SZUTS V, et al. Regional and tissue specific transcript signatures of ion channel genes in the non-diseased human heart. J Physiol. 2007;582(Pt 2):675-693.
[5] GOSWAMI SK, SHAFIQ S, SIDDIQUI MA. Modulation of MLC-2v gene expression by AP-1: complex regulatory role of Jun in cardiac myocytes. Mol Cell Biochem. 2001;217(1-2):13-20.
[6] MINAMISAWA S, GU Y, ROSS J JR, et al. A post-transcriptional compensatory pathway in heterozygous ventricular myosin light chain 2-deficient mice results in lack of gene dosage effect during normal cardiac growth or hypertrophy. J Biol Chem. 1999;274(15):10066-10070.
[7] GRISCELLI F, GILARDI-HEBENSTREIT P, HANANIA N, et al. Heart-specific targeting of beta-galactosidase by the ventricle-specific cardiac myosin light chain 2 promoter using adenovirus vectors. Hum Gene Ther. 1998;9(13):1919-1928.
[8] O’BRIEN TX, LEE KJ, CHIEN KR. Positional specification of ventricular myosin light chain 2 expression in the primitive murine heart tube. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993;90(11):5157-5161.
[9] FRANZ WM, BREVES D, KLINGEL K, et al. Heart-specific targeting of firefly luciferase by the myosin light chain-2 promoter and developmental regulation in transgenic mice. Circ Res. 1993;73(4): 629-638.
[10] MILLER-HANCE WC, LACORBIERE M, FULLER SJ, et al. In vitro chamber specification during embryonic stem cell cardiogenesis. Expression of the ventricular myosin light chain-2 gene is independent of heart tube formation. J Biol Chem. 1993;268(33):25244-25252.
[11] BOUCHEZ C, DEVIN A. Mitochondrial Biogenesis and Mitochondrial Reactive Oxygen Species (ROS): A Complex Relationship Regulated by the cAMP/PKA Signaling Pathway. Cells. 2019;8(4). pii: E287.
[12] YANG L. Neuronal cAMP/PKA Signaling and Energy Homeostasis. Adv Exp Med Biol. 2018;1090:31-48.
[13] KIM JM, CHOI JS, KIM YH, et al. An activator of the cAMP/PKA/CREB pathway promotes osteogenesis from human mesenchymal stem cells. J Cell Physiol. 2013;228(3):617-626.
[14] SHI W, GAO Y, WANG Y, et al. The flavonol glycoside icariin promotes bone formation in growing rats by activating the cAMP signaling pathway in primary cilia of osteoblasts. J Biol Chem. 2017;292(51): 20883-20896.
[15] SIDDAPPA R, MARTENS A, DOORN J, et al. cAMP/PKA pathway activation in human mesenchymal stem cells in vitro results in robust bone formation in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105(20): 7281-7286.
[16] WANG C, LIU D, ZHANG C, et al. Defect-Related Luminescent Hydroxyapatite-Enhanced Osteogenic Differentiation of Bone Mesenchymal Stem Cells Via an ATP-Induced cAMP/PKA Pathway. ACS Appl Mater Interfaces. 2016;8(18):11262-11271.
[17] VITALI E, CAMBIAGHI V, SPADA A, et al. cAMP effects in neuroendocrine tumors: The role of Epac and PKA in cell proliferation and adhesion. Exp Cell Res. 2015;339(2):241-251.
[18] FUENTES F, ALARCÓN M, BADIMON L, et al. Guanosine exerts antiplatelet and antithrombotic properties through an adenosine-related cAMP-PKA signaling. Int J Cardiol. 2017;248:294-300.
[19] CHOI J, JUNG WH, KRONSTAD JW. The cAMP/protein kinase A signaling pathway in pathogenic basidiomycete fungi: Connections with iron homeostasis. J Microbiol. 2015;53(9):579-587.
[20] MACHADO J, MANFREDI LH, SILVEIRA WA, et al. Calcitonin gene-related peptide inhibits autophagic-lysosomal proteolysis through cAMP/PKA signaling in rat skeletal muscles. Int J Biochem Cell Biol. 2016;72:40-50.
[21] MONTERISI S, LOBO MJ, LIVIE C, et al. PDE2A2 regulates mitochondria morphology and apoptotic cell death via local modulation of cAMP/PKA signalling. Elife. 2017;6. pii: e21374.
[22] GE GH, DOU HJ, YANG SS, et al. Glucagon-like peptide-1 protects against cardiac microvascular endothelial cells injured by high glucose. Asian Pac J Trop Med. 2015;8(1):73-78.
[23] WANG D, LUO P, WANG Y, et al. Glucagon-like peptide-1 protects against cardiac microvascular injury in diabetes via a cAMP/ PKA/Rho-dependent mechanism. Diabetes. 2013;62(5):1697-1708.
[24] NEVIERE R, DELGUSTE F, DURAND A, et al. Abnormal Mitochondrial cAMP/PKA Signaling Is Involved in Sepsis-Induced Mitochondrial and Myocardial Dysfunction. Int J Mol Sci. 2016;17(12). pii: E2075.
[25] CARDOSO-MOREIRA M, HALBERT J, VALLOTON D, et al, Gene expression across mammalian organ development. Nature. 2019;571 (7766):505-509.
[26] 徐亦辰,刘玲珑,赵文婧,等.骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞相关基因表达与形态结构发生的关联[J].中国组织工程研究, 2017,21(13): 1974-1979.
[27] HARRIS JP, BHAKTA M, BEZPROZVANNAYA S, et al. MyoR modulates cardiac conduction by repressing Gata4. Mol Cell Biol. 2015; 35(4): 649-661.
[28] GEORGE V, COLOMBO S, TARGOFF KL. An early requirement for nkx2.5 ensures the first and second heart field ventricular identity and cardiac function into adulthood. Dev Biol. 2015;400(1):10-22.
[29] TONG YF. Mutations of NKX2.5 and GATA4 genes in the development of congenital heart disease. Gene. 2016;588(1):86-94.

引言

材料方法

1.1 设计体外细胞培养、定向诱导及鉴定。
1.2 时间及地点实验于2017年9月至2018年4月在广西医科大学组织学与胚胎学实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物健康SPF级7 d龄SD大鼠乳鼠60只，雌雄不拘，体质量12-17 g；成年SD大鼠45只，雌雄不拘，体质量250-580 g，由广西医科大学实验动物中心提供，动物使用许可证号：SCXK桂2014-0002。
1.3.2 实验试剂与仪器 DMEM培养基(Wisent，加拿大)；胎牛血清(Gibico，美国)；TritonX-100、EDTA、多聚甲醛、青链霉素混合剂、成脂诱导剂、成骨诱导剂(Solarbio，中国)；α-Actin、cTnI多克隆抗体，FITC标记的山羊抗兔多克隆抗体(北京博奥森，中国)；RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒(Takara，日本)，AceQTM qPCR SYBR Green Master Mix(诺唯赞，南京)。
1.4 实验方法
1.4.1 骨髓间充质干细胞系的建立及鉴定[3] 取新生7 d的SD乳鼠，麻醉后分离股骨，1 mL注射器抽吸骨髓，转移至15 mL离心管中，自然沉降5 min，离心(700 r/min，5 min)，收集细胞沉淀，加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM，制备成单细胞悬液，接种于24孔板，于37 ℃、体积分数为5%CO2恒湿培养箱中原代培养。连续传代后，取生长良好的第3代骨髓间充质干细胞，分别加入成脂、成骨诱导剂诱导分化及流式细胞术检测细胞表面标志CD34、CD45、CD29、CD90的表达。

1.4.2 全心组织裂解液、心房肌组织裂解液、心室肌组织裂解液及诱导剂的制备 ①取成年SD大鼠45只，体积分数为5%乙醇进行皮肤消毒处理，2%戊巴比妥钠(1.5 mg/kg)经耳缘静脉注射麻醉，SD大鼠四肢展开，腹部朝上固定，使用灭菌后的眼科剪从鼠胸部的剑突处剪开左胸部，做一个T形切口暴露心脏，10 min之内完成取材，装入高压灭菌含PBS的EP管，-196 ℃液氮保存；②用预冷的无菌PBS对心脏完成冲洗，去除杂质血水，冰上操作；③在超净操作台用预冷无菌PBS冲洗心脏中的杂质血块，分离心包、脂肪及血管后，再用PBS冲洗数次，使用眼科剪分离出心房肌、心室肌，剪成约1 cm3大小的组织块，全心组织裂解液仅分离脂肪和结缔组织；④取出分离干净的心脏、心房肌、心室肌，在装有无菌PBS中再次分离被膜及血管，并用预冷PBS冲洗数次，使用剪刀将心脏、心房肌、心室肌剪成大小约1 mm3的组织块；⑤分别取少量心脏、心房肌、心室肌组织块置于无菌2 mL离心管中，以1∶2的体积比加入无血清的H-DMEM，夹入1颗大钢珠、2颗小钢珠，置于组织研磨器中研磨2次，每次65 Hz，180 s；⑥收集心脏、心房肌、心室肌组织裂解液于50 mL无菌塑料离心管中进行高速低温离心30 min(4 ℃，10 000 r/min)，用注射器吸取上清，0.22 μm滤器过滤，分装于EP管中，-80 ℃储存；⑦使用前将全心组织裂解液、心房肌组织裂解液、心室肌组织裂解液分别与含体积分数10%胎牛血清的H-DMEM按10 μL/mL配置。

1.4.3 定向诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞取生长良好的第3代骨髓间充质干细胞，在扩增培养至细胞集落汇合占据瓶底面积60%-80%时，加入全心组织裂解液诱导剂、心房肌组织裂解液诱导剂、心室肌组织裂解液诱导剂连续诱导培养。倒置显微镜下观察细胞形态、结构变化并记录，隔日换液。
1.4.4 免疫荧光组织化学染色鉴定诱导八九周时，挑选大体观察可见的心肌组织样结构，40 g/L多聚甲醛固定24 h，体积分数为50%，75%，85%，95%，100%乙醇脱水，二甲苯透明后石蜡包埋、切片。①将切片浸入二甲苯中脱蜡5 min；
②分别经过无水乙醇2次5 min、体积分数为90%乙醇2次5 min、体积分数为70%乙醇2次5 min、蒸馏水2次
5 min；③将柠檬酸盐放入微波炉中加入至沸腾，放入切片继续煮沸10 min进行抗原修复，取出切片，降至常温后用PBS冲洗；④滴加山羊血清封闭液，37 ℃孵育3 min；⑤在切片的组织上滴加体积分数为3%过氧化氢15 min；⑥1×PBS冲洗3×3 min，用免疫组化笔圈住组织所在部位；⑦参考说明书滴加稀释后的一抗α-Actin、cTnI，空白对照组以PBS代替一抗，置于4 ℃冰箱孵育过夜；⑧从冰箱中取出切片，待恢复至室温后用1×PBS漂洗，5×3 min；⑨滴加FITC荧光二抗，避光条件下孵育30 min，PBS漂洗5×3 min；⑩避光条件下DAPI孵育10 min，PBS漂洗5×3 min，最后用抗荧光淬灭剂封固。
1.4.5 透射电镜观察心肌样细胞诱导约8周，收集各组心肌样细胞，1×PBS漂洗标本3次；4%戊二醛固定样本24 h；1×PBS冲洗，5 min×3次；环氧树脂包埋过夜；切片机切片，200目铜网捞片；双重电子染色，透射电镜下观察并摄片。
1.4.6 qRT-PCR检测ANP、HCN4、MLC-2v的相对表达量诱导约6周，分别取未诱导骨髓间充质干细胞、全心组织裂解液诱导组细胞、心室肌组织裂解液诱导组细胞、心房肌组织裂解液诱导组细胞以及SD乳鼠心肌细胞，通过Taraka RNA提取试剂盒对细胞总RNA进行提取，使用超微分光光度仪检测RNA的纯度和浓度，再将所提取的RNA进行反转录为cDNA，进行实时荧光定量PCR检测各组细胞ANP、HCN4、MLC-2v的相对表达量，引物序列见表1。

1.5 主要观察指标 ①不同部位的心肌组织裂解液诱导骨髓间充质干细胞定向分化为心肌组织样结构、心房肌样细胞、心室肌样细胞过程中的形态变化规律；②诱导后各组细胞免疫荧光染色α-actin、cTnI的表达；③qRT-PCR检测各组细胞的ANP、HCN4、MLC-2v相对表达量；④透射电镜观察心肌样细胞的形态结构。
1.6 统计学分析采用SPSS 17.0软件进行数据统计分析。数据均以x±s表示，经方差齐性检验，方差齐采用t 检验，方差不齐则采用校正t 检验进行统计处理。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

3.1 微环境心脏是结构极为复杂的有腔器官，其心肌组织包括心房肌、心室肌。心肌细胞根据分布和功能的不同，分为心室肌细胞、心房肌细胞、窦房结细胞(包括移行细胞、起搏细胞和浦肯野纤维)。心房肌细胞和心室肌细胞是工作细胞，执行收缩功能，而窦房结细胞是自律性细胞，它组成心内特殊传导系统。心房肌细胞结构与心室肌细胞相似，但也存在差异。心房肌细胞除收缩功能以外，还具有内分泌功能，能够参与细胞的代谢，而心室肌细胞相关的报道较少。这些差异在诱导骨髓间充质干细胞定向分化为不同心肌样细胞模型中是否存在区别，目前尚未有文献报道。如何构建骨髓间充质干细胞体内外诱导条件，使其向所需的细胞、组织定向分化是急需解决的难题。若能通过控制诱导条件，有效监控骨髓间充质干细胞在体内的生物学行为，使其向特定种类的心肌细胞分化，就有可能将来在临床上达到特异性和预期性的治疗心脏疾病的目标。
干细胞具有“环境依赖性分化”的特性。该实验采用全心组织裂解液、心房肌组织裂解液和心室肌组织裂解液分别构建不同的微环境，探究不同部位组织裂解液对骨髓间充质干细胞定向分化的影响。各诱导组细胞的形态变化规律相似：细胞由长梭形变为短杆状，细胞的突起互相连接形成网状，网状的细胞开始端端相接，连接处膨大增厚逐渐形成“竹节样结构”，最后融合成“肌管样结构”。虽然表现相似的形态变化规律，但心房肌和心室肌裂解液诱导组未出现细胞大量聚集卷起、形成“心肌组织样结构”的现象，推测与诱导微环境的单一性有关，越是接近全心组织的微环境，越有利于构建适宜心肌组织发育的条件，形成的形态结构会更接近正常心肌组织。各诱导组细胞在融合成肌管样结构后都出现自律性搏动，心房肌组织裂解液诱导组出现肌管样结构并发生自律性搏动的时间比心室肌组织裂解液诱导组早、搏动频率较低、搏动持续时间较短。造成以上现象差异的原因可能与不同部位的心肌组织裂解液构建的微环境有关。
该研究qRT-PCR检测发现心房肌样细胞高表达ANP，推测细胞周围的分泌颗粒含有ANP。ANP是心房钠尿肽，主要由心房肌细胞合成、分泌，可以促进排钠、排尿，有较强的舒张血管功能，所以心房肌组织裂解液诱导组出现的肌管样结构可发生节律性的收缩和舒张。在哺乳动物心脏中以窦房结HCN4含量最丰富[4]，占HCN总量的80%以上。HCN4可以编码超极化激活阳离子电流(If)通道结构蛋白，参与窦房结细胞自发性舒张期膜去极化过程，与心脏起搏的产生和调节密切相关，也参与交感神经对心率的调节。心房肌组织裂解液构建的微环境中，心房肌样细胞高表达HCN4，推测骨髓间充质干细胞定向诱导分化为心房肌样细胞已开始具备分泌心房钠尿肽和类似窦房结的功能，所以发生自律性搏动的时间较心室肌裂解液诱导组早。MLC-2v是心室肌细胞特异的最早期分子标志[5-7]，MLC-2v mRNA特异性表达于心脏肌管形成的早期阶段[8]。在成年体内MLC-2v几乎广泛表达于心室肌细胞[9]；在胚胎细胞培养体系内，发性收缩功能形成于MLC-2v mRNA开始表达[10]。该实验中MLC-2v在心室肌组织裂解液诱导组高表达，说明心室肌裂解液构建的微环境促进骨髓间充质干细胞向心室肌样细胞分化。
3.2 cAMP/PKA信号通路 cAMP是常见的第二信使，PKA是cAMP的主要效应器，cAMP的生理功能通过PKA实现[11-12]。cAMP/PKA信号通路能够调节骨髓间充质干细胞的分化，促进成骨和骨组织形成的研究较多[13-16]。cAMP/ PKA信号通路存在于多种细胞中，调节细胞的增殖和分化，包括细胞增殖与黏附[17]、抗血栓形成[18]、铁稳态[19]、骨骼肌自噬[20]、
线粒体功能等[21]。cAMP可直接作用于3个主要靶点：PKA、cAMP激活的交换蛋白(Epac)和环核苷酸门控离子通道(CNGCs)。研究表明，GLP-1通过cAMP/PKA介导的途径对Rho下游抑制，导致NADPH氧化酶的表达随之下降[22]，保护糖尿病患者的心脏微血管损伤[23]。线粒体cAMP/PKA信号的异常参与脓毒症引起的线粒体和心肌功能障碍[24]，可见cAMP/PKA信号通路与心肌的形态、结构有密切关系。ANP和HCN4都是cAMP/PKA信号通路的上游分子，ANP在胞外表达，HCN4在胞膜上表达，二者能够激活cAMP促进其受体PKA发生一系列的级联反应。MLC是cAMP信号通路的下游分子，推测心室肌组织裂解液内含有的未知因子可能具有去磷酸化功能，激活cAMP/PKA下游信号通路，促进内皮细胞、平滑肌细胞的舒张。cAMP/PKA信号通路对骨髓间充质干细胞定向诱导分化为心肌组织样结构的影响，有待进一步使用阻断剂深入探讨。
3.3 早期特异性基因与晚期特异性基因 CARDOSO-MOREIRA等[25]提出假说：器官在发生、发育早期受到较大程度的结构和功能性限制，难以发生大幅变动，发育后期由于环境因素等导致的适应性变化使得形态和功能发生改变较为容易。课题组前期对心脏发育的早期特异基因NKx2.5、GATA-4进行检测，发现骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞过程中，心肌细胞特异基因的表达与心肌样细胞的形态特征、特殊结构发生密切相关，具有典型的时序性和空间性[26]。GATA-4转录因子中含有高度保守的DNA结构域，在心脏发育过程中起调控作用，并有组织特异性的表达模式。GATA4和Nkx2.5是胚胎心脏发育中最早表达的特异性转录因子之一，对心脏的正常发育发挥着重要作用[27]。Nkx2.5的表达有促进和维持心脏成熟及心脏传导的功能[28]。作为心脏发育早期的特异性基因，GATA-4和NKx2.5不仅各自在心脏早期发育中对心肌细胞的分化及整个心管的形成起重要调控作用，两者之间的相互协调可激活心脏的正常发育过程特异基因的表达[29]。该实验利用3种不同部位的心肌组织裂解液构建有差异的微环境，诱导形成心房肌样细胞、心室肌样细胞。这2种细胞开始具备心室肌细胞和心房肌细胞的形态和功能，推测晚期特异性基因ANP、HCN4和MLC-2v随着形态结构和功能的完善，基因表达的组织特异性显著升高，证实CARDOSO-MOREIRA等[25]提出的假说，发育后期由于环境因素导致的适应性变化使得形态和功能发生改变。
综上所述，不同部位的心肌组织裂解液能够定向诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌组织样结构、心房肌样细胞和心室肌样细胞，但诱导过程中产生的心肌组织样结构、心房肌样细胞和心室肌样细胞的功能还不完善，所以晚期特异性基因的表达与正常心肌细胞还存在差异。该实验观察到部分心房肌样细胞有向窦房结样细胞分化的趋势，应该进一步探究窦房结样细胞分化发育的基本规律。今后将进一步模拟体内微环境，维持和促进心肌组织样结构的长期、稳定持久的发育，为构建类器官奠定实验基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

不同部位心肌组织裂解液诱导骨髓间充质干细胞定向分化为心肌样细胞

Cardiomyocyte-like differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells induced by myocardial tissue lysates from different parts of the myocardium

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 4

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[2]	梁学奇, 郭黎姣, 陈贺捷, 武杰, 孙雅琪, 邢稚坤, 邹海亮, 陈雪玲, 吴向未. 泡状棘球绦虫原头蚴抑制骨髓间充质干细胞向成纤维细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 996-1001.
[3]	耿瑶, 尹志良, 李兴平, 肖东琴, 侯伟光. hsa-miRNA-223-3p调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1008-1013.
[4]	伦志刚, 金晶, 王添艳, 李爱民. 过氧化物还原酶6干预骨髓间充质干细胞增殖及体外向神经谱系诱导分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1014-1018.
[5]	朱雪芬, 黄成, 丁健, 戴永平, 刘元兵, 乐礼祥, 王亮亮, 杨建东. 胶质细胞神经营养因子诱导骨髓间充质干细胞向功能性神经元分化的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1019-1025.
[6]	裴丽丽, 孙贵才, 王弟. 丹酚酸B抑制骨髓间充质干细胞氧化损伤及促进分化为心肌样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1032-1036.
[7]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[8]	陈俊毅, 王宁, 彭称飞, 朱伦井, 段江涛, 王烨, 贝朝涌. 脱钙骨基质与慢病毒介导沉默P75神经营养因子受体转染骨髓间充质干细胞构建组织工程骨[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 510-515.
[9]	姜涛, 马磊, 李志强, 寿玺, 段明军, 吴硕, 马创, 魏琴. 血小板衍生生长因子BB诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3937-3942.
[10]	孙建威, 杨新明, 张瑛. 孟鲁司特联合骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤模型大鼠[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3962-3969.
[11]	张立书, 刘安琪, 何小宁, 金岩, 李蓓, 金钫. Alpl基因影响骨髓间充质干细胞治疗溃疡性结肠炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3970-3975.
[12]	郝晓娜, 张英杰, 李玉云, 许涛. 过表达脯氨酰寡肽酶的骨髓间充质干细胞修复肝纤维化模型大鼠[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3988-3993.
[13]	刘建友, 贾中伟, 牛佳伟, 曹鑫杰, 张栋, 魏杰. 构建股骨3D数字化模型提出一种新的股骨颈前倾角测量方法[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(24): 3779-3783.
[14]	黄茂茂, 胡月, 王彬川, 张驰, 谢羽婕, 王剑雄, 汪丽, 胥方元. 缺血性脑卒中康复近10年国际文献计量学及可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3725-3733.
[15]	朱蕊, 曾庆, 黄国志. 铁死亡与脑卒中[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3734-3739.