2.1  鼻黏膜间充质干细胞的形态和表面标志鉴定结果  鼻黏膜组织贴壁后生长速度加快，7 d后可见较多贴壁细胞；贴壁细胞呈鱼群样，形态均匀；免疫荧光结果显示90%的鼻黏膜间充质干细胞表达外胚层间充质干细胞标志物vimentin、nestin和S100，提示实验获得了较高纯度的鼻黏膜间充质干细胞，见图1。

2.2  免疫荧光染色结果  成神经样细胞诱导3，5，7 d的鼻黏膜间充质干细胞呈典型的神经元样细胞形态，见图2 A-C；取成神经诱导3 d的鼻黏膜间充质干细胞，采用免疫荧光法标记神经元细胞特征性蛋白GAP-43和TUBB3，见图2D，E；取成骨诱导7 d的鼻黏膜间充质干细胞，采用免疫荧光法标记成骨细胞特征性蛋白COLⅠ和OCN，见图2G，H。

2.3  碱性磷酸酶和钙结节染色  成骨诱导7 d，碱性磷酸酶染色结果显示鼻黏膜间充质干细胞内碱性磷酸酶可被深染，见图2F；茜素红染色结果显示鼻黏膜间充质干细胞可形成明显的钙结节，见图2I。

2.4  诱导过程中神经细胞相关蛋白、成骨细胞相关蛋白以及TG2表达水平  成神经诱导培养3，5，7 d，免疫印迹法检测神经细胞相关蛋白GAP-43、TUBB3和TG2表达水平随诱导时间延长而增高，见图3。成骨诱导7 d和14 d，免疫印迹法检测成骨细胞相关蛋白COLⅠ、OCN以及TG2水平随诱导时间延长而增高，见图4。

2.5  诱导分化过程中神经营养因子和细胞外基质表达水平  成神经诱导7 d，免疫印迹法检测NT-3、BDNF和TG2水平高于未诱导对照组，见图5。成骨诱导14 d，免疫印迹法检测细胞外基质FN、LN和TG2水平高于未诱导对照组，见图6。

鼻黏膜组织中存在具有多向分化潜能的鼻黏膜间充质干细胞，而且具有取材方便、取材量较大、对嗅觉无损伤等优点，是组织工程学中优良的种子细胞^[1]。在成人鼻腔呼吸部黏膜固有层广泛存在鼻黏膜间充质干细胞，该细胞可在体外培养和扩增，并保持其干细胞特性和多向分化潜能^[2]。

组织型转谷氨酰胺酶2(tissue transgiutaminase 2，TG2)是蛋白质-谷氨酰胺γ-谷氨酰转移酶家族中Ca²⁺依赖性酶^[3]。研究表明，TG2可以通过交联和稳定各种细胞外基质，从而促进细胞的黏附、增殖和迁移^[4]。TG2不仅可以通过聚合细胞骨架的组分来稳定凋亡期间死亡细胞的结构，还可以稳定细胞膜从而防止细胞内容物渗入细胞外空间^[5]。探究干细胞分化过程中特殊蛋白的表达，对研究干细胞特性至关重要。研究报道，人源骨髓间充质干细胞向成神经样细胞分化过程中，TG2表达水平增高^[6]；在成骨诱导分化过程中，同样发现高水平的TG2^[7]。然而，TG2在鼻黏膜间充质干细胞分化过程中的表达尚无相关报道。

该研究将鼻黏膜间充质干细胞定向成骨诱导和成神经诱导，通过免疫印迹法检测诱导分化过程中TG2表达水平增高，提示TG2可能参与并促进鼻黏膜间充质干细胞分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1  设计  细胞学体外观察实验。

1.2  时间及地点  实验于2017年10月至2019年2月在江苏大学医学院基础医学研究所完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  SD大鼠4只，3周龄，SPF级，雌雄不限，体质量50 g，由江苏大学实验动物中心提供，实验动物机构许可证号：SCXK(苏)2018-0012。

1.3.2  实验试剂  胎牛血清、DMEM/F12培养基(Gibco公司)；0.25%胰酶(Sigma公司)；兔抗TG2、兔抗vimentin、兔抗nestin、兔抗S100、鼠抗COLⅠ、鼠抗NT-3、鼠抗BDNF、兔抗FN、兔抗LN、兔抗OCN、兔抗GAP-43、兔抗β3-tubulin(TUBB3)、内参鼠抗β-actin、羊抗兔IgG-Cy3、羊抗小鼠IgG-Cy3和羊抗小鼠IgG-HRP、羊抗兔IgG-HRP (武汉博士德生物公司)；碱性磷酸酶检测试剂盒(索来宝公司)；茜素红染料(Gibco公司)；培养瓶和培养板(Corning公司)。

1.4  方法

1.4.1  鼻黏膜间充质干细胞的分离培养  SD大鼠颈椎脱臼处死，无菌条件下沿鼻腔向上至内眦部剪开皮肤，暴露鼻中隔黏膜，取出鼻中隔置PBS中，剥离全层鼻黏膜，弃去鼻中隔软骨；鼻黏膜置于4 ℃ PBS中漂洗3次，用眼科剪充分剪碎，置于37 ℃培养箱中胰酶消化15 min，      1 000 r/min离心5 min，弃上清，将碎组织块接种于含有体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12的密闭培养瓶，置于细胞培养箱中培养；每3 d换液1次，当细胞铺满瓶底80%时进行传代；将第3代细胞接种于1块48孔培养板，免疫荧光标记vimentin、S100、nestin，鉴定干细胞特性。

免疫荧光操作步骤：细胞用40 g/L多聚甲醛4 ℃固定过夜，分别于0.1% Triton X-100和3% BSA中封闭30 min，加入兔抗vimentin、兔抗S100和兔抗nestin(均为1∶300)于4 ℃孵育过夜，PBS漂洗3次；加入羊抗兔IgG-Cy3   (1∶200)于37 ℃孵育1 h，PBS漂洗3次；DAPI复染细胞核30 min，PBS漂洗3次；甘油封固，于Leica荧光显微镜下观察并摄片。

1.4.2  成骨诱导方法  取生长状况良好的第3代鼻黏膜间充质干细胞，接种于6孔和48孔细胞培养板，当细胞铺满培养板底85%时，弃去培养液，PBS洗2次，加入足量的成骨诱导培养基(含10 mmol/L β-磷酸甘油钠、25 μg/L抗坏血酸、体积分数为15%胎牛血清、0.1 µmol/L地塞米松的DMEM培养基)，诱导时间设定为7 d和14 d。

1.4.3  成神经诱导方法  取生长状况良好的第3代鼻黏膜间充质干细胞，接种于6孔和48孔培养板，当细胞铺满培养板底70%时，弃去培养液，PBS洗2次，加入成神经诱导培养基(含50 mg/L全反式维甲酸，20 μg/L音猬因子，    20 μg/L神经生长因子)，诱导时间设定为3 d和7 d。

1.4.4  免疫荧光染色  取成神经诱导3 d的鼻黏膜间充质干细胞，采用免疫荧光法标记神经元细胞特征性蛋白GAP-43和TUBB3；取成骨诱导7 d的鼻黏膜间充质干细胞，采用免疫荧光法标记成骨细胞特征性蛋白COLⅠ和OCN。免疫荧光操作步骤见1.4.1。

1.4.5  碱性磷酸酶染色  按照试剂盒说明书配制工作液，取成骨诱导培养7 d的鼻黏膜间充质干细胞，弃去培养液，PBS漂洗3次，加入工作液，37 ℃孵育1 h，甘油封固，于显微镜下观察染色情况并拍摄图片。

1.4.6  钙结节染色  取成骨诱导培养7 d的鼻黏膜间充质干细胞，40 g/L多聚甲醛固定20 min，ddH₂O小心漂洗3次；干燥；加入适量的0.3%茜素红染液作用30 min；弃去染液；再次干燥；甘油封固，倒置显微镜观察细胞外钙盐沉积情况并拍摄图片。

1.4.7  免疫印迹检测  取成神经诱导培养3，5，7 d以及成骨诱导7 d和14 d的鼻黏膜间充质干细胞，PBS洗3遍，加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制剂，置于冰上裂解30 min，将裂解过的细胞蛋白置于EP管内，加入loading-buffer及二巯基乙醇，置于沸水中煮5 min使蛋白质变性；加样品于10% SDS-PAGE电泳分离蛋白样品，350 mA恒流转膜  90 min，PVDF膜用3%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗(成骨诱导：兔抗TG2、鼠抗COLⅠ、兔抗OCN；成神经诱导：兔抗TG2、兔抗GAP-43、兔抗TUBB3)4 ℃孵育12 h；TBST漂洗3次，10 min/次；加入抗兔或抗鼠IgG-HRP (1∶5 000) 37 ℃孵育1 h，TBST漂洗3次，10 min/次；超敏形ECL发光液显示阳性条带，在Typhoon系统上扫描结果，Image J软件分析灰度值，以β-actin为内参，实验重复3次。

取成神经诱导7 d的鼻黏膜间充质干细胞，按上述免疫印迹法检测NT-3、BDNF和TG2的表达水平。取成骨诱导14 d的鼻黏膜间充质干细胞，免疫印迹法检测细胞外基质FN、LN和TG2的表达水平。

1.5  主要观察指标  ①成神经诱导环境中，鼻黏膜间充质干细胞表达TUBB3和GAP-43水平；②成骨诱导环境中，鼻黏膜间充质干细胞表达OCN和COLⅠ的水平；③鼻黏膜间充质干细胞成神经和成骨诱导分化过程中TG2的表达水平；④鼻黏膜间充质干细胞成神经和成骨诱导分化过程中细胞外基质和细胞生长因子的表达水平。

1.6  统计学分析  使用SPSS 22.0统计学软分析，计量资料用x(_)±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

鼻黏膜间充质干细胞属于多功能干细胞，可在体外被诱导分化其他类型细胞。作者以往的研究工作表明，鼻黏膜间充质干细胞在特殊的条件下培养，不仅可以向神经样细胞(神经元样细胞和少突胶质样细胞)，亦可向成骨细胞分化^[8-12]，这显示出鼻黏膜间充质干细胞在中枢神经系统和骨骼疾病中巨大的应用潜能。然而，鼻黏膜间充质干细胞在分化过程中一些特殊蛋白的表达，则需要进一步探讨。该实验旨在研究TG2在鼻黏膜间充质干细胞成骨和成神经样细胞诱导分化过程中的表达。实验结果表明鼻黏膜间充质干细胞向成骨细胞分化过程中，随着诱导时间的延长，TG2表达水平伴随着成骨细胞相关蛋白表达水平增高而增高，同样的结果也出现在鼻黏膜间充质干细胞向神经样细胞诱导分化过程中。

TG2是Ca²⁺依赖性交联酶的转谷氨酰胺酶家族的一员，不仅具有交联细胞外基质及细胞生长因子的作用^[13-18]，还具备蛋白激酶以及额外的非酶功能^[19]。研究表明，TG2在干细胞增殖和分化过程中起重要作用，诱导人源骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化过程中，TG2的表达水平明显增高；在最近的研究报道中TG2则被视为成骨细胞分化的判断生物指标^[13]。在课题组以往的实验中，以腺病毒为TG2基因载体转染鼻黏膜间充质干细胞，使其过表达TG2，研究结果表明，TG2基因修饰的鼻黏膜间充质干细胞易向神经样细胞分化^[20]。

GAP-43和TUBB3是神经元特异性的细胞质蛋白，被认为在神经突形成、再生和可塑性中起关键作用^[21-23]。COLⅠ和OCN被认为在骨形成代谢调节中发挥重要作用，是促成骨细胞和骨骼构建的天然蛋白^[24-25]。碱性磷酸酶和矿化物沉积被视为成骨分化的“金指标”^[26]，这些实验数据进一步证实了鼻黏膜间充质干细胞可在体外向成骨细胞和神经样细胞分化。该研究中，Western blot和免疫荧光数据说明鼻黏膜间充质干细胞可在特殊培养条件下向成骨细胞和神经样细胞分化，并且随着诱导时间的延长，神经细胞相关蛋白和骨相关蛋白表达水平增高，而且TG2的表达与神经相关蛋白和骨相关蛋白表达呈正相关。研究表明，TG2可通过整合素而调控细胞黏附、扩散、迁移、存活和分化，整合素信号通路的激活有利于干细胞向神经样细胞分   化^[26-27]。TG2不仅可通过LRP5/6跨膜受体激活β-catenin信号通路，促进间充质干细胞向成骨细胞分化^[28]，而且TG2可交联细胞外基质和细胞生长因子，以形成有利于分化的细胞微环境。TG2可控制细胞生长、存活、分化和凋亡，并参与神经退行性疾病和骨细胞构建和重塑^[29-30]。鼻黏膜间充质干细胞具有向其他胚层细胞分化的潜能，分化过程常伴随着细胞骨架的改变，TG2直接参与细胞骨架的构建和重塑，具有重要的调节作用。鼻黏膜间充质干细胞成神经分化过程中，NT-3和BDNF的表达与TG2的表达有同样的趋势，神经营养因子的堆积促进了鼻黏膜间充质干细胞向神经样细胞分化；在成骨诱导过程中，鼻黏膜间充质干细胞中细胞外基质(FN和LN)的表达与TG2亦有同样的增高趋势。研究表明，神经营养因子(NT-3和BDNF)和细胞外基质(FN和LN)可被TG2交联而沉积^[31-33]。鼻黏膜间充质干细胞分化过程中，TG2与神经营养因子和细胞外基质的沉积形成一个正反馈，致使鼻黏膜间充质干细胞在分化过程中具有良好的细胞外环境，在特定的诱导培养条件下易向其他类型细胞分化。

综上所述，TG2在鼻黏膜间充质干细胞向成骨细胞和成神经样细胞分化过程中具有重要的调节作用，课题组将继续深入探讨TG2的具体调节机制。

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文题释义：

组织型转谷氨酰胺酶：可催化蛋白分子内和分子之间的共价键交联。组织型转谷氨酰胺酶主要以3种形式存在，即细胞内型、细胞膜型和分泌型(以microparticles形式分泌)。分泌到细胞之间的组织型转谷氨酰胺酶2的主要功能是将细胞分泌的细胞外基质分子交联成为三维网络，为细胞生长提供微环境。此外，组织型转谷氨酰胺酶2还可将生长因子与细胞外基质交联。

鼻黏膜间充质干细胞：鼻腔黏膜包括呼吸部黏膜和嗅部黏膜，关于嗅黏膜干细胞和嗅鞘细胞修复神经系统损伤的研究较多，而对呼吸部黏膜干细胞的研究相对较少。呼吸部黏膜面积较大，包括中、下鼻甲及相应的鼻道及鼻中隔中下份黏膜，与嗅黏膜相比，呼吸部黏膜的取材量较大，手术操作更方便，损伤很小，尤其是对嗅觉无损伤，因此对呼吸部黏膜干细胞的研究更有应用价值。

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鼻黏膜间充质干细胞是源自颅神经嵴的特殊干细胞群，该细胞仍保留多向分化潜能。鼻黏膜间充质干细胞可以从几种成人组织中分离，例如牙髓和嗅黏膜。鼻中隔下部嗅黏膜附近的大鼠呼吸道黏膜也含有一群鼻黏膜间充质干细胞。鼻呼吸道黏膜具有高度可取和再生性，因此提供了丰富的鼻黏膜间充质干细胞来源。研究表明，移植鼻黏膜间充质干细胞至大鼠体内，可在不同的组织内分化为特定的细胞，同时该细胞可分泌大量的神经营养因子和细胞外基质，在局部可形成良好的细胞外环境，促进损伤组织的再生修复。

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