细菌纳米纤维素与聚乙烯醇复合水凝胶管的生物相容性表征

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.34.011

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (34): 5474-5480.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.34.011

• 纳米生物材料 nanobiomaterials • 上一篇下一篇

细菌纳米纤维素与聚乙烯醇复合水凝胶管的生物相容性表征

唐敬玉¹，包露涵¹，李雪¹，陈琳¹，洪枫^1，2

¹东华大学化学化工与生物工程学院微生物工程与工业生物技术研究组，上海市 201620；²纤维材料改性国家重点实验室(东华大学)，上海市 201620

收稿日期:2017-07-03 出版日期:2017-12-08 发布日期:2018-01-04
通讯作者: 洪枫，研究员，东华大学化学化工与生物工程学院微生物工程与工业生物技术研究组，上海市 201620
作者简介:唐敬玉，男，1987年生，山东省临沂市人，汉族，东华大学在读博士，主要从事生物医用材料研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(51373031)；上海市科委“科技创新行动计划”项目(15520720800)；纤维材料改性国家重点实验室资助课题(LK1617)

Biocompatibility of bacterial nanocellulose and bacterial nanocellulose/polyvinyl alcohol composite hydrogel tubes

Tang Jing-yu¹, Bao Lu-han¹, Li Xue¹, Chen Lin¹, Hong Feng^{1, 2}

¹Group of Microbiological Engineering and Industrial Biotechnology, College of Chemistry, Chemical Engineering and Biotechnology, Donghua University, Shanghai 201620, China; ²State Key Laboratory for Modification of Chemical Fibers and Polymer Materials, Donghua University, Shanghai 201620, China

Received:2017-07-03 Online:2017-12-08 Published:2018-01-04
Contact: Feng F. Hong, Professor, Group of Microbiological Engineering and Industrial Biotechnology, College of Chemistry, Chemical Engineering and Biotechnology, Donghua University, Shanghai 201620, China
About author:Tang Jing-yu, Studying for doctorate, Group of Microbiological Engineering and Industrial Biotechnology, College of Chemistry, Chemical Engineering and Biotechnology, Donghua University, Shanghai 201620, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 51373031; the grant from the Science and Technology Commission of Shanghai Municipality, No. 15520720800; the grant from the State Key Laboratory for Modification of Chemical Fibers and Polymer Materials (Donghua University), No. LK1617

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

细菌纳米纤维素：是一种由微生物(如木葡糖酸醋杆菌等)分泌的多糖类高分子材料，具有与植物纤维素相同的化学组成，均为吡喃葡萄糖单体由β-1，4糖苷键构成的葡聚糖。与伴生半纤维素和木质素的植物纤维素相比，细菌纳米纤维素具有更高的化学纯度，独特的纳米纤维网络结构和更好的生物相容性，被广泛用于创伤敷料、人工皮肤和组织工程支架等。

聚乙烯醇：是一种水溶性的合成高分子，通过反复冻融的物理交联过程可制备成水凝胶材料，具有很好的弹性，与人体软组织的机械力学性能相近，被广泛研究用于医用敷料、人工血管和软骨组织工程支架等。研究证实，聚乙烯醇的高亲水特性可限制血浆蛋白在其表面的吸附，减少血小板的黏附，具有良好的血液相容性，然而这种特性同样限制了细胞在其表面的黏附，在应用于人工血管时不利于内皮层的形成。

背景：前期研究通过相分离技术制备了细菌纳米纤维素/聚乙烯醇复合管，显著改善了单纯细菌纳米纤维素管的机械力学性质，但对复合管生物相容性的研究并不充分。

目的：分析细菌纳米纤维素/聚乙烯醇复合管的生物相容性。

方法：通过单硅胶管和双硅胶管两种生物反应器，在线培育获得两种不同结构细菌纳米纤维素管，分别记为S-BNC和D-BNC；采用相分离方法将两种细菌纳米纤维素管分别与聚乙烯醇复合，制备细菌纳米纤维素/聚乙烯醇复合管；通过溶血率、血浆复钙、血小板黏附实验评价S-BNC、D-BNC、S-BNC/聚乙烯醇复合管及D-BNC/聚乙烯醇复合管材料的血液相容性。将4种管材料分别与猪髋骨内皮细胞(或人血管平滑肌细胞)共培养，3，7 d后，采用活死细胞染色观察细胞在材料表面生长情况。

结果与结论：①血液相容性：4组管的溶血率均小于0.5%。D-BNC管的血浆复钙时间显著快于S-BNC管 (P < 0.05)；两复合管的血浆复钙过程较相应的单细菌纳米纤维素管均有减缓(P < 0.05)，两复合管血浆复钙时间无差异。血小板在两种纯细菌纳米纤维素管的内表面均发生了较大的形变，并且相互聚集，形成很多血小板栓子；两复合管的血小板黏附数量明显减少，且D-BNC/聚乙烯醇复合管血小板黏附量显著多于S-BNC/聚乙烯醇复合管；②细胞相容性：4组管材料均支持猪髋骨内皮细胞的生长，两复合管较对应的单细菌纳米纤维素管效果更好；4组管材料均支持人血管平滑肌细胞的生长，相对于单纯细菌纳米纤维素管，复合管可显著促进细胞的生长，其中以D-BNC/聚乙烯醇复合管的效果最好；③结果表明：细菌纳米纤维素/聚乙烯醇复合管具有良好的血液相容性与细胞相容性。

ORCID: 0000-0001-7551-3925(唐敬玉)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 细菌纳米纤维素, 聚乙烯醇, 血小板黏附, 内皮细胞, 平滑肌细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Based on our previous findings, the mechanical properties of bacterial nanocellulose (BNC) tubes were improved by composite with polyvinyl alcohol (PVA) using phase separation method. However, the biocompatibility of the composite tubes is rarely reported.

OBJECTIVE: To evaluate the biocompatibility of BNC and BNC/PVA composite tubes.

METHODS: Two types of BNC tubes (S-BNC and D-BNC) with different structures were online prepared in two bioreactors (single-silicone tube bioreactor and double-silicone tubes bioreactor respectively). BNC/PVA composites were prepared based on both BNC tubes using a phase separation method. The hemocompatibility of these tubes including hemolytic ratio, plasma recalcification and platelet adhesion were compared. Living/dead staining method was used to evaluate the cell growth after 3 and 7 days incubation since the endothelial and smooth muscle cells were seeded on the lumen surfaces of the BNC and BNC/PVA composite tubes, respectively.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Hemocompatibility: The hemolytic ratios of four kinds of tubes were all below 0.5%. The plasma recalcification time of D-BNC tube was significantly shorter than that of S-BNC tube (P < 0.05). The plasma recalcification processes of two composites were slowed as compared with corresponding BNC tubes (P < 0.05). No significant difference in plasma recalcification was detected between the two composites. The platelets adhered on the inner surface of two pure BNC tubes showed greater deformation and aggregated distribution, which led to the formation of platelet plugs. The platelet adhesion of BNC/PVA composites was dramatically reduced. The D-BNC/PVA composite tube showed more platelet adhesion than the S-BNC/PVA composite tube. (2) Cytocompatibility: Pig iliac endothelial cells could grow on the lumen surface of these four kinds of tubes. And the composites showed better growth as compared with corresponding pure BNC tubes. Human vascular smooth muscle cells could also grow on the lumen surface of four kinds of materials. As compared with the pure BNC tubes, the composites led to improvement in cell growth, and the D-BNC/PVA composite tube showed the best result. To conclude, the BNC/PVA composite tube has good hemocompatibility and cytocompatibility.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Blood Vessel Prosthesis, Nanofibers, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

唐敬玉，包露涵，李雪，陈琳，洪枫. 细菌纳米纤维素与聚乙烯醇复合水凝胶管的生物相容性表征[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(34): 5474-5480.

Tang Jing-yu, Bao Lu-han, Li Xue, Chen Lin, Hong Feng.

Biocompatibility of bacterial nanocellulose and bacterial nanocellulose/polyvinyl alcohol composite hydrogel tubes

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(34): 5474-5480.

图/表（结果） 6

2.1 管材的形貌特征图1显示了两种细菌纳米纤维素管内表面是开放多孔的纳米纤维网络形貌；与聚乙烯醇复合后，聚乙烯醇沉积在纳米纤维网络空隙内，使复合管内表面更加致密，呈现出聚乙烯醇沉积的纳米纤维网络结构。

2.2 溶血率实验图2显示所有管的溶血率均小于0.5%，表明对红细胞没有破坏性影响。S-BNC管和D-BNC管的溶血率分别为(0.24±0.06)%和(0.27±0.04)%，两者没有显著差异；与聚乙烯醇复合后，溶血率均略有增加，并且S-BNC/聚乙烯醇复合管的溶血率(0.38±0.07)%略高于D-BNC/聚乙烯醇复合管(0.32±0.05)%，样本间误差均小于0.1%。

2.3 血浆复钙时间测定图3描述了贫血小板血浆与不同管共培育后的复钙动力学曲线，随着血浆复钙凝结的进行，405 nm下的吸光度值不断增加，一般定义达到最大吸光度值一半的时间为血浆复钙时间^[19]。结果显示，D-BNC管组血浆复钙时间为4.9 min，显著快于S-BNC管组的6.1 min(P < 0.05)。与聚乙烯醇复合后，血浆复钙过程与相应的单BNC管相比均有减缓(P < 0.05)，其中D-BNC/聚乙烯醇复合管组的血浆复钙时间为7.5 min，与S-BNC/聚乙烯醇管组的结果相近(7.2 min)，表明复合管对内源性凝血途径的激活程度更小，但是两种复合管的差异并不明显(P > 0.05)。

2.4 血小板黏附表征图4显示，血小板在两种纯细菌纳米纤维素管的内表面均发生了较大形变，并且相互聚集，形成很多血小板栓子，但两种管上的黏附没有明显区别；而与聚乙烯醇复合后，血小板的黏附数量明显减少，并且血小板没有明显的形变；两种复合管的血小板黏附表现出了明显不同，D-BNC/聚乙烯醇复合管的内表面黏附的血小板显著多于S-BNC/聚乙烯醇复合管。

2.5 猪髋骨内皮细胞在管材内表面的生长图5显示了猪髋骨内皮细胞在不同管内表面生长3，7 d后的生长状态。经活/死细胞染色试剂盒染色后，活细胞在荧光显微镜下呈现出绿色荧光，而死细胞呈现出红色荧光。结果表明，所有管材均支持内皮细胞的生长，在培育的第3天，细胞数量较少，但培育7 d后，细胞大量生长，在材料表面形成了内皮细胞层。相比较而言，内皮细胞在S-BNC管的生长状态优于在D-BNC管上的结果，主要表现为较少的死细胞和均匀的内皮细胞层。当与聚乙烯醇复合后，培育第3天时，两种类型复合管上的细胞数量同样较少，与相应的纯BNC管上的结果相似；培育7 d后，形成的内皮细胞层明显更加致密均匀，发射出更强的荧光强度，表明了更好的内皮细胞相容性。两种复合管在内皮细胞相容性上看不出明显差异。

2.6 人血管平滑肌细胞在管材内表面的生长图6显示，平滑肌细胞可以在两种类型的纯细菌纳米纤维素管上生长，但生长缓慢，7 d后不能形成像内皮细胞那样的细胞层，两种细菌纳米纤维素管之间的差异并不明显；与聚乙烯醇复合可显著改善平滑肌细胞的生长，主要表现为在培育的第3，7天有相对更多的细胞生长，在复合管表面形成了大面积的细胞聚集区；D-BNC/聚乙烯醇复合管具有最优的平滑肌细胞生长状态，在培育7 d后细胞生长已基本覆盖整个表面，形成了平滑肌层。

参考文献

[1]Hess F.History of (micro) vascular surgery and the development of small-caliber blood vessel prostheses(with some notes on patency rates and re-endothelialization). Microsurgery.1985;6(2):59-69.

[2]Isenberg BC,Williams C,Tranquillo RT.Small-diameter artificial arteries engineered in vitro. Circ Res.2006;98(1):25-35.

[3]Klemm D,Kramer F,Moritz S,et al.Nanocelluloses: a new family of nature-based materials.Angew Chem Int Ed Engl. 2011;50(24):5438-5466.

[4]Petersen N,Gatenholm P.Bacterial cellulose-based materials and medical devices: current state and perspectives.Appl Microbiol Biotechnol.2011;91(5):1277-1286.

[5]Czaja W,Krystynowicz A,Bielecki S,et al.Microbial cellulose -the natural power to heal wounds. Biomaterials. 2006;27(2): 145-151.

[6]Bäckdahl H,Helenius G,Bodin A,et al.Mechanical properties of bacterial cellulose and interactions with smooth muscle cells. Biomaterials.2006;27(9):2141-2149.

[7]Wan YZ,Hong L,Jia SR,et al.Synthesis and characterization of hydroxyapatite–bacterial cellulose nanocomposites. Compos Sci Technol.2006;66(11-12):1825-1832.

[8]Klemm D,Schumann D,Udhardt U,et al.Bacterial synthesized cellulose — artificial blood vessels for microsurgery.Prog Polym Sci.2001;26:1561-1603.

[9]Bodin A,Bäckdahl H,Fink H,et al.Influence of cultivation conditions on mechanical and morphological properties of bacterial cellulose tubes.Biotechnol Bioeng. 2007;97(2):425-434.

[10]Putra A,Kakugo A,Furukawa H,et al.Tubular bacterial cellulose gel with oriented fibrils on the curved surface.Polymer.2008; 49(7):1885-1891.

[11]Scherner M,Reutter S,Klemm D,et al.In vivo application of tissue-engineered blood vessels of bacterial cellulose as small arterial substitutes: proof of concept?J Surgl Res.2012; 189(2): 340-347.

[12]Bäckdahl H,Bo R,Gatenholm P.Observations on bacterial cellulose tube formation for application as vascular graft.Mater Sci Eng C.2011;31(1):14-21.

[13]Hong F,Wei B,Chen L.Preliminary Study on biosynthesis of bacterial nanocellulose tubes in a novel double-silicone-tube bioreactor for potential vascular prosthesis.Biomed Res Int. 2015;2015:560365.

[14]Millon LE,Mohammadi H,Wan WK.Anisotropic polyvinyl alcohol hydrogel for cardiovascular applications.J Biomed Mater Res B Appl Biomater.2006;79B(2):305-311.

[15]Millon LE,Guhados G,Wan W.Anisotropic polyvinyl alcohol-Bacterial cellulose nanocomposite for biomedical applications.J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2008;86B(2): 444-452.

[16]Cutiongco MFA,Goh SH,Aid-Launais R,et al.Planar and tubular patterning of micro and nano-topographies on poly(vinyl alcohol) hydrogel for improved endothelial cell responses. Biomaterials. 2016;84:184.

[17]Gupta S,Greeshma T,Basu B,et al.Stiffness and wettability dependent myoblast cell compatibility of transparent poly(vinyl alcohol) hydrogels.J Biomed Mater Res B Appl Biomater.2013; 101(2):346-354.

[18]Chaouat M,Visage CL,Baille WE,et al.A Novel Cross-linked Poly(vinyl alcohol) (PVA) for Vascular Grafts.Adv Funct Mater. 2008;18(19):2855-2861.

[19]Leitão AF,Gupta S,Silva JP,et al.Hemocompatibility study of a bacterial cellulose/polyvinyl alcohol nanocomposite.Colloids Surf B Biointerfaces.2013;111:493-502.

[20]Millon LE,Wan WK.The polyvinyl alcohol-bacterial cellulose system as a new nanocomposite for biomedical applications.J Biomed Mater Res B Appl Biomater.2006;79(2):245-253.

[21]Tang J,Bao LH,Li X,et al.Potential of PVA-doped bacterial nano-cellulose tubular composites for artificial blood vessels.J Mater Chem B.2015;3(43):8537-8547.

[22]Tang J,Li X,Bao LH,et al.Comparison of two types of bioreactors for synthesis of bacterial nanocellulose tubes as potential medical prostheses including artificial blood vessels.J Chem Technol Biotechnol.2017;92:1218-1228.

[23]Dee KC,Puleo DA,Bizios S.An Introduction to Tissue-Biomaterial Interactions.John Wiley & Sons, 2002.

引言

近年来，心血管疾病的发病率不断增高。对一些病情严重的患者，血管移植是挽救患者生命的有效治疗手段。临床用于心血管替换的移植物主要是病患自身健康的乳内动脉或隐静脉，然而一些患者由于自身其他疾病的原因，缺乏健康血管用于心血管的替换，因此自体来源血管远不能满足临床需求^[1-2]。在大口径血管替换中成功应用的膨体聚四氟乙烯和涤纶聚酯材料，在应用于小口径血管移植时存在栓塞和内膜增生等问题，尚未成功应用。目前，临床上仍旧缺乏应用于小口径血管替换的人工血管，因此该领域的研究吸引了众多研究者的关注。

细菌纳米纤维素是一种由微生物(如木葡糖酸醋杆菌等)分泌的多糖类高分子材料，具有与植物纤维素相同的化学组成，均为吡喃葡萄糖单体由β-1，4糖苷键构成的葡聚糖。与伴生半纤维素和木质素的植物纤维素相比，细菌纳米纤维素具有更高的化学纯度，独特的纳米纤维网络结构和更好的生物相容性，被广泛用于创伤敷料、人工皮肤和组织工程支架等^[3-7]。其优良的特性同样吸引了众多研究者将其制备成各种各样的小口径管，在小口径血管的替换上具有很好的应用潜力^[8-12]。在众多研究中，通过硅胶管组成的特殊生物反应器在线培育细菌纳米纤维素管是制备小径管的主要方法^[13]。然而，这些小口径细菌纳米纤维素管没有弹性，在机械力学性能上存在不足，但其独特的纳米纤维网络为复合其他材料以增强性能提供了良好结构基础。

聚乙烯醇是一种水溶性的合成高分子，通过反复冻融的物理交联过程可制备成水凝胶材料，具有很好的弹性，与人体软组织的机械力学性能相近，被广泛用于医用敷料、人工血管和软骨组织工程支架等^[14-19]。研究证实，聚乙烯醇的高亲水特性可限制血浆蛋白在其表面的吸附，减少血小板的黏附，具有很好的血液相容性，然而这种特性同样限制了细胞在其表面的黏附，在应用于人工血管时不利于内皮层的形成^[16，19]。Cutiongco等^[16]通过在聚乙烯醇水凝胶表面设计微纳米的纹路形貌，显著改善了细胞的黏附和增殖。

鉴于细菌纳米纤维素和聚乙烯醇两种材料各自的特性，为弥补各自性能的不足，研究者将两种材料复合，制备了多种增强的水凝胶状复合材料，应用于生物材料研究。然而，目前对管状细菌纳米纤维素/聚乙烯醇复合材料的研究依旧较少，尤其缺乏对其生物相容性的研究。Millon等^[20]通过在细菌纳米纤维素匀浆悬液中添加聚乙烯醇后进行反复冻融，制备了具有类似人血管组织机械力学性质的细菌纳米纤维素/聚乙烯醇复合管，但这种方法破坏了细菌纳米纤维素的纳米纤维网络结构，并且在植入后随着聚乙烯醇的溶解，细菌纳米纤维素碎屑可能会进入血液，引起严重后果。在课题组的前期研究中，曾以两种不同的天然细菌纳米纤维素管为基底材料，通过相分离技术制备了两种不同结构形貌的细菌纳米纤维素/聚乙烯醇复合管，相比于细菌纳米纤维素管，复合管的机械力学性质得到了显著改善，但对复合管生物相容性的研究并不充分^[21]。因此，此次研究参照课题组以往方法再次制备了两种不同类型的细菌纳米纤维素管，并以此为基材，利用相分离技术将其与聚乙烯醇复合，制备了两种类型的细菌纳米纤维素/聚乙烯醇复合管，系统表征了复合前后的血液相容性和细胞相容性，评价了细菌纳米纤维素管及细菌纳米纤维素/聚乙烯醇复合管在小口径人工血管中的应用潜力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计对比观察性实验。

1.2 时间及地点实验于2013至2016年在东华大学完成。

1.3 材料猪髋骨内皮细胞和人血管平滑肌细胞(中国科学院上海生科院细胞资源中心)；木葡糖酸醋杆菌DHU-ZCY-1(来自海南椰国食品有限公司)；酵母粉(Oxoid公司)；活/死细胞染色试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；1%双抗(上海碧云天生物技术有限公司)；DMEM高糖培养液(HyClone公司)；枸橼酸钠采血管(山东省成武县医用制品厂)；场发射扫描电子显微镜(Hitachi S-4800，Hitachi公司)；扫描电子电镜(JSM-5600LV，JEOL公司)；酶标仪(1510，Thermo公司)；二氧化碳培养箱(BB-15，Thermo公司)；荧光显微镜(BX53，Olympus公司)；恒温摇床(HYG-A，苏州培英实验设备有限公司)；葡萄糖、胰蛋白胨、氢氧化钠、柠檬酸、聚乙烯醇、无水乙醇、氯化钙、戊二醛等(国药集团化学试剂有限公司)。

实验动物：健康成年雄性新西兰大白兔，体质量2.0-3.0 kg，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(沪)2012-0002。

1.4 实验方法

1.4.1 细菌纳米纤维素管的制备采用课题组已报道的单硅胶管反应器和双硅胶管反应器^[21]，以实验室保藏的木葡糖酸醋杆菌DHU-ZCY-1分别培育两种不同类型的细菌纳米纤维素管(分别记为S-BNC管和D-BNC管)。单硅胶管反应器的构造如Bodin等^[9]所述，将外径为3 mm、壁厚为0.5 mm、长为6 cm的硅胶管用硅胶塞固定在内径为8 mm的玻璃管中心，形成可容纳约10 mL培养液的空腔用于S-BNC管的制备，硅胶管腔内通入氧气，透过硅胶管壁向培养液供氧。制备D-BNC管的双硅胶管反应器由2个硅胶管套装而成，与单硅胶管反应器相同的小硅胶管被固定在内径为8 mm，壁厚为0.5 mm的大硅胶管中心，同样形成约容纳10 mL培养液的空腔，整个反应器置于氧气中，通过两个硅胶管的管壁向培养液供氧^[13]。配制含有50 g/L葡萄糖、5 g/L酵母粉、5 g/L蛋白胨、1 g/L柠檬酸、1 g/L KH₂PO₄和2 g/L Na₂HPO₄的培养液，121 ℃温度下灭菌 20 min后备用。取2环斜面保存的木葡糖酸醋杆菌，接种于100 mL培养液中，置于30 ℃的恒温摇床内160 r/min摇动培育24 h后获得种子悬液，取20 mL种子悬液置于180 mL新鲜培养液中，继续摇动培育4 h后，吸取10 mL置于上述生物反应器空腔内，30 ℃静置培育10 d后获得细菌纳米纤维素管。为去除杂质，培育获得的细菌纳米纤维素管经去离子水冲洗除去可溶性物质后，置于10 g/L NaOH溶液中，80 ℃处理4 h，去除细菌，然后用超纯水反复冲洗至洗液pH为中性，获得的细菌纳米纤维素管用于制备复合管。

1.4.2 细菌纳米纤维素/聚乙烯醇复合水凝胶管的制备采用相分离技术制备细菌纳米纤维素/聚乙烯醇复合管^[21]，首先将聚乙烯醇溶解于95 ℃的超纯水中，配制含有100 g/L聚乙烯醇和体积分数20%乙醇的混合水溶液，冷却至室温备用。将上述纯化得到的两种类型的细菌纳米纤维素管分别套在直径为3 mm的玻璃棒表面，用滤纸吸除细菌纳米纤维素管壁内的大部分水后，用橡胶塞固定于内径为5 mm、外径为7 mm的聚丙烯管中心，形成容纳聚乙烯醇溶液的空腔。将聚乙烯醇混合水溶液注入空腔后封闭，室温静置24 h后置于-80 ℃冷冻4 h，取出并迅速打开聚丙烯管两端的固定塞后，置于-20 ℃无水乙醇中静置24 h，取出后用超纯水置换出乙醇，获得两种类型的细菌纳米纤维素/聚乙烯醇复合水凝胶管。

1.4.3 微观形貌观察冷冻干燥后的细菌纳米纤维素管经喷金处理后，用场发射扫描电子显微镜观察管内表面的微观形貌；细菌纳米纤维素/聚乙烯醇复合管冻干并喷金处理后，用普通扫描电子电镜观察形貌。

1.4.4 管材料的血液相容性表征

血液的准备：用枸橼酸钠采血管经兔耳缘静脉采集兔全血，用于细菌纳米纤维素管和细菌纳米纤维素/聚乙烯醇复合管的血液相容性表征。采集的兔全血经100×g离心10 min后，收集的上清液为富血小板血浆，用于血小板黏附实验；收集下层沉淀获得红细胞，用于材料溶血率测试；采集的兔全血经2 000×g离心后收集上清液，获得贫血小板血浆，用于血浆复钙时间测试。

溶血率实验：将细菌纳米纤维素管和细菌纳米纤维素/聚乙烯醇复合管浸泡于体积分数75%的乙醇水溶液12 h后，用生理盐水置换出乙醇，沿管纵向剖开，裁剪成长15 mm、宽9 mm的矩形膜片，内表面向上平铺于24孔板的底部，不添加材料但添加2 mL超纯水的孔设置为阳性对照，不添加材料和超纯水的孔设置为阴性对照，向每个实验样品孔和阴性对照孔内添加2 mL生理盐水和1.5×10⁸个兔血红细胞，37 ℃静置培育2 h后，将红细胞悬液转移到离心管内，750×g离心5 min后，取200 µL上清液，测其在540 nm波长下的吸光度值A，并以此计算溶血率。依据美国材料与试验协会公布的ASTM F 756-2000标准，溶血率为0-2%的材料为不溶血材料，溶血率在2%-5%之间为轻微溶血材料，溶血率> 5%为溶血材料。溶血率=(阳性对照A值－实验样品A值)/(阳性对照组A值－阴性对照A值)×100%。

血浆复钙时间测定：为测试不同材料对内源性凝血途径的激活程度，参照Leitão等^[19]描述的测试方法，将细菌纳米纤维素管和细菌纳米纤维素/聚乙烯醇复合管材料同样平铺于24孔板内，不添加材料的空白孔作为阴性对照，向每孔加入500 µL贫血小板血浆，37 ℃100 r/min摇动培育1 h后，吸取100 µL血浆，置于96孔板内，向含材料的实验组添加100 µL 0.025 mol/L CaCl₂，阴性对照组添加100 µL生理盐水，立即置于37 ℃酶标仪内，测定405 nm处的吸光值变化，读数间隔为30 s。

血小板黏附实验：为表征血小板在材料内表面的黏附情况，向平铺于24孔板内的细菌纳米纤维素管和细菌纳米纤维素/聚乙烯醇复合管材料表面添加500 µL富血小板血浆，37 ℃静置培育2 h后，用生理盐水浸洗3次，每孔加入2 mL 含25 g/L戊二醛的PBS溶液固定12 h，然后用超纯水浸洗3次，依次用体积分数25%、50%、75%、95%和无水乙醇处理10 min，最后用叔丁醇置换出乙醇后冷冻干燥，通过扫描电子显微镜检测血小板在管材内表面的黏附。

1.4.5 管材料的细胞相容性表征经体积分数75%乙醇浸泡灭菌的细菌纳米纤维素管和细菌纳米纤维素/聚乙烯醇复合管，再浸泡在PBS中置换出乙醇，同样纵向剖开，裁剪成长15 mm、宽9 mm的矩形膜片，内表面向上平铺于24孔板内，并用无菌钢环固定，向每孔内添加400 µL含有体积分数10%胎牛血清、1%双抗的DMEM高糖培养液浸润12 h，然后分别向不同孔内种植10⁴个猪髋骨内皮细胞或人血管平滑肌细胞，置于37 ℃二氧化碳培养箱内培育。在培育的第3，7天，用活/死细胞染色试剂盒对细胞染色后，于荧光显微镜下观察细胞生长状态。

1.5 主要观察指标 4组管材料的血液相容性与细胞相容性。

1.6 统计学分析采用Origin 8.0对实验数据进行单因素方差分析和t 检验。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

两种生物反应器具有不同的供氧方式和水平，培育获得的S-BNC管和D-BNC管具有不同的特征^[13，21-22]。先前的研究发现，S-BNC管和D-BNC管具有不同的管壁厚度和纤维网络结构^[21]。两种细菌纳米纤维素管为复合管的制备提供了不同的基底材料，与聚乙烯醇复合后，S-BNC/聚乙烯醇和D-BNC/聚乙烯醇复合管的管壁厚度又发生了改变，这种管壁尺寸的变化导致了复合管内、外表面形貌的不同，S-BNC/聚乙烯醇复合管的外层由多孔连通的聚乙烯醇构成，内层为类似细菌纳米纤维素的纳米纤维网络构成，网络空隙被聚乙烯醇填充，致密少孔；D-BNC/聚乙烯醇复合管的内、外两层均为聚乙烯醇沉积的纳米纤维网络构成，含量没有显著的区别，均为0.3%左右，纳米纤维网络的含水量均高达99.7%，但D-BNC管的轴向拉伸力学性质、缝合强度等力学性能显著强于S-BNC管^[21]。与聚乙烯醇复合后，S-BNC/聚乙烯醇和D-BNC/聚乙烯醇复合管的纤维素含量分别为0.4%和0.9%，机械力学性质均得到了不同程度的提高^[21]。两种复合管成分的差异，以及表面形貌的不同可能会引起生物相容性的差异。在制备复合管时，细菌纳米纤维素管壁内的水被吸出，网络塌陷，尽管在注入聚乙烯醇后的静置过程中，塌陷的网络可吸取聚乙烯醇溶液而有一定程度的恢复，但并不能完全恢复，最终仅少量聚乙烯醇渗透进细菌纳米纤维素管的内层纤维网络中，经分相过程后沉积在网络孔隙内，形成了如图1所示的内表面形貌。细菌纳米纤维素管内表面纳米级纤维具有很高的比表面积，并且纤维网络多孔联通，血液可渗透进管壁网络中，导致大量血浆蛋白的吸附，这可能导致了更大的内源性凝血途径的激活程度^[19]，正因为此，两种细菌纳米纤维素管均表现出比复合后更快的血浆复钙过程和更多的血小板粘附，与Leitão等^[19]的研究结果一致。D-BNC管更高的内源性凝血途径激活程度可能与其较厚的管壁相关，而S-BNC稀疏的外层纤维网络可能对凝血的激活程度较小。但是，与目前临床上应用最广泛的膨体聚四氟乙烯相比，细菌纳米纤维素的促凝血作用明显小得多，这与其高持水量和亲水特性有关。ePTFE是一种高度疏水的惰性材料，与血液接触后具有更强的蛋白吸附能力，对内源性凝血途径的激活程度比细菌纳米纤维素更大^[19]。与细菌纳米纤维素相比，ePTFE可促使血小板上的CD62P和CD63因子更多的表达，激活更多的血小板，引起更多的血小板黏附和聚集^[19]。

与聚乙烯醇复合后，聚乙烯醇在细菌纳米纤维素管壁网络内沉积后堵塞了纤维网络，减少了与血液接触的界面，并且聚乙烯醇具有很高的亲水性，可以减少血浆蛋白的吸附^[16，19]，因此复合管的血浆复钙时间得到了延长。Leitão等^[19]研究发现，细菌纳米纤维素/聚乙烯醇复合膜比细菌纳米纤维素膜更少促进血小板CD62P和CD63的表达，对血小板的激活较小。此次研究中由于D-BNC管的管壁厚，与聚乙烯醇复合后的纤维素占比更高，分布在内表面的细菌纳米纤维素管更多，因此D-BNC/聚乙烯醇复合管内表面黏附了相对更多的血小板。内皮细胞层分布在血管的最内层，具有抑制凝血，分泌内皮生长因子和NO等多种因子，调控细胞生长等重要的生理功能，因此人工血管应支持内皮细胞的生长^[23]。细菌纳米纤维素管内表面的纳米纤维网络可吸附细胞培养液中的蛋白，这为内皮细胞的黏附提供了支持；此外，其纳米纤维网络与人体胶原纤维网络结构相似，可为细胞的迁移提供支架，因此实验发现内皮细胞可以在细菌纳米纤维素管表面迅速生长，形成内皮层。尽管两种不同类型的细菌纳米纤维素管的内表面均由纳米纤维网络构成，但仍旧存在一些差异，如纤维直径分布，网络孔隙等^[22]，这可能是导致内皮细胞生长状态不同的原因。与聚乙烯醇复合后，管材内表面致密的纳米纤维网络促进了内皮细胞的生长，改善了聚乙烯醇不利于细胞在其表面黏附和不利于内皮层形成的不足^[16，19]。

Bäckdahl等^[6]研究证实细菌纳米纤维素膜疏松的网络结构对平滑肌细胞的铺展生长不利，这符合此次研究观察到的平滑肌细胞在两种细菌纳米纤维素管上生长缓慢的现象。与聚乙烯醇复合显著改善了平滑肌细胞在材料表面的铺展生长，这是两种材料性能互补的结果。有研究证实，聚乙烯醇的高亲水特性不支持细胞的黏附，但可通过在表面设计纹路而获得改善^[16]。D-BNC/聚乙烯醇复合管更优的平滑肌细胞生长，可能是复合管内表面具有更多的细菌纳米纤维素网络分布，类似于聚乙烯醇表面的纹路，支持了细胞生长。这里制备的两种细菌纳米纤维素/聚乙烯醇复合管的内层主要为细菌纳米纤维素，并且具有密实、粗糙的纤维网络，显著促进了细胞的生长，为血管再生提供了良好支架。

综上所述，S-BNC管机械力学性质较弱，但其稀疏的外层纤维网络对凝血的激活程度较小，可引入更多的聚乙烯醇在其网络内沉积。D-BNC管表面纤维致密，对内源性凝血途径的激活程度较大，但其机械力学性质更强。两种不同类型的细菌纳米纤维素管为复合材料的制备提供了不同的基底材料。与聚乙烯醇复合可显著改善细菌纳米纤维素管机械力学性质、血液相容性和生物相容性。S-BNC/聚乙烯醇复合管引起较少的血小板黏附，促进了内皮细胞层的形成，但机械力学性质弱于D-BNC/聚乙烯醇复合管，适合静脉血管替换。D-BNC/聚乙烯醇复合管具有更优的机械力学性质，对内皮细胞和平滑肌细胞的生长具有明显的促进，具有支持血管再生的潜力，是动脉血管替换的更优选择。此外，细菌纳米纤维素管和细菌纳米纤维素/聚乙烯醇复合管在人工血管及其他管状医用替代品，如人工食管和人工尿道中也具有很好的潜在应用价值。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

细菌纳米纤维素与聚乙烯醇复合水凝胶管的生物相容性表征

Biocompatibility of bacterial nanocellulose and bacterial nanocellulose/polyvinyl alcohol composite hydrogel tubes

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 6

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	张立创, 徐浩, 马迎辉, 熊梦婷, 韩海慧, 鲍嘉敏, 翟伟韬, 梁倩倩. 免疫调控淋巴回流功能治疗类风湿关节炎的机制及前景[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1459-1466.
[2]	朱兵兵, 邓江华, 陈晶晶, 慕晓玲. 白细胞介素8受体可提高脐带间充质干细胞迁移和向损伤内皮的黏附[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1045-1050.
[3]	张玉杰, 杨建东, 蔡俊, 朱守雷, 田原. 大蒜素抑制大鼠血管内皮细胞增殖并诱导其凋亡的机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1080-1084.
[4]	田川, 朱向情, 杨再玲, 鄢东海, 李晔, 王严影, 杨育坤, 何洁, 吕冠柯, 蔡学敏, 舒丽萍, 何志旭, 潘兴华. 骨髓间充质干细胞调控猕猴卵巢的衰老[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 985-991.
[5]	杨峰, 赵骞, 张世轩, 赵铁男, 冯博. 雷帕霉素联合CD133抗体支架预防血管再狭窄的有效性和安全性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 579-584.
[6]	张通, 蔡金池, 袁志发, 赵海燕, 韩兴文, 王文己. 基于透明质酸的复合水凝胶修复骨关节炎软骨损伤：应用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 617-625.
[7]	文科, 卢彦青, 侯楠, 马瑞娜, 崔鹏程, 吕蝶, 徐小丽. 生物材料与组织工程技术在鼓膜缺损重建中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(10): 1620-1624.
[8]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[9]	张雯雯, 金颂峰, 赵国梁, 宮丽鸿. 复方中药稳斑汤减少同型半胱氨酸诱导大鼠心肌微血管内皮细胞凋亡的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 723-728.
[10]	蒋欣, 乔良伟, 孙东, 李明, 房军, 曲青山. 肾移植患者血清中长链非编码RNA PGM5-AS1表达及调控人肾小球内皮细胞的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 741-745.
[11]	李黎, 马力. 磁性壳聚糖微球固定化乳糖酶及其酶学性质[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 576-581.
[12]	王向, 韦朝俊, 王尧, 潘裕佳, 刘大男. 构建过表达FNDC5慢病毒载体抑制平滑肌细胞的增殖与迁移[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(35): 5670-5675.
[13]	刘小元, 李蕾, 张凯, 李君, 韩祥祯, 何惠宇. 骨髓间充质干细胞膜片复合3D打印马鹿角粉/丝素蛋白/聚乙烯醇支架的体内成骨[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(34): 5420-5426.
[14]	李辰凯, 秦文, 刘纯, 陈文扬, 赵红斌. 3D电喷印法制备凹凸棒石/聚己内酯支架及体外成骨诱导性能[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(34): 5459-5464.
[15]	张峰. 聚醚醚酮和钛网材料修补颅骨缺损远期效果及不良事件的差异：前瞻性、单中心、非随机对照、2年随访临床试验方案[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(34): 5501-5505.