软骨细胞及骨髓间充质干细胞共培养修复关节软骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.32.007

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
软骨细胞：位于软骨陷窝内。幼稚的软骨细胞位于软骨组织的表层，单个分布，体积较小，呈椭圆形，长轴与软骨表面平行，越向深层的软骨细胞体积之间增大呈圆形，细胞核圆形或卵圆形，染色浅，细胞质弱嗜碱性，常见数量不一的脂滴。成熟的软骨细胞多2-8个成群分布于软骨陷窝内，这些软骨细胞由同一个母细胞分裂增殖而成，称为同源细胞群。电镜下，软骨细胞有突起和皱褶，细胞质内有大量的粗面内质网和发达的高尔基复合体及少量的线粒体。在组织切片中，软骨细胞收缩为不规则形，在软骨囊和细胞之间出现较大的腔隙。
骨髓间充质干细胞：骨髓原始间充质干细胞是骨髓基质干细胞，对骨髓中的造血干细胞不仅有机械支持作用，还能分泌多种生长因子(如白细胞介素6、白细胞介素11、白血病抑制因子、巨噬细胞集落刺激因子及干细胞因子等)来支持造血。用于骨髓间充质干细胞分离的方法主要有贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪法和免疫磁珠法。由于骨髓间充质干细胞取材方便，来源充足，增殖能力强，且具有多向分化潜能，可经多种细胞因子诱导成软骨细胞。

摘要
背景：关节软骨损伤多由创伤及骨关节炎引起，其治疗是临床研究的难点和热点。组织工程技术的发展为修复关节软骨缺损提供了新方法，但软骨细胞来源不足一直是一个难题。
目的：探讨软骨细胞及骨髓间充质干细胞共培养修复关节软骨缺损的可行性，评价修复效果。
方法：体外培养扩增猪骨髓间充质干细胞及关节软骨细胞，共培养2代，接种于聚乳酸-聚羟基乙酸聚合物上继续共培养2周，构建共培养组织工程软骨(共培养组)；以单纯软骨细胞构建组织工程软骨为对照组，回植修复关节软骨缺损；空白组软骨缺损不作处理。半年后行大体观察及组织学观察，定量检测Ⅱ型胶原染色面积及氨基糖胺聚糖含量。
结果与结论：①共培养组的修复组织呈软骨样，表面光滑平坦，与周围关节软骨组织整合良好；对照组呈纤维组织修复；而空白组则无修复；②组织学观察显示，共培养组结构致密，细胞外基质分布更均匀，与周围关节软骨组织及软骨下骨组织整合良好；③共培养组的Ⅱ型胶原染色面积及糖胺聚糖含量均优于对照组及空白组，差异有显著性意义(P < 0.05)；④综上，软骨细胞和骨髓间充质干细胞共培养构建组织工程软骨能有效修复关节软骨缺损。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-1560-052X(陈刚)

关键词: 组织构建, 软骨组织工程, 共培养, 软骨细胞, 骨髓间充质干细胞, 关节软骨缺损

Abstract:

BACKGROUND: Articular cartilage damage caused by traumatic articular cartilage defects and osteoarthritis is a common clinical disorder, and its treatment is an issue of concern. Tissue engineering provides a new method for articular cartilage repair. But insufficient cartilage cell source is always a thorny issue.
OBJECTIVE: To explore the feasibility of repairing articular cartilage defects with tissue-engineered cartilage constructed by co-culture of chondrocytes and bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs), and evaluate the curative efficacy.
METHODS: Chondrocytes and BMSCs were isolated from swine articular cartilages, expanded in vitro, mixed after the first passage, and then co-cultured for another passage. The mixed cells were seeded onto a polyglycolic acid/polylactic acid scaffold and, followed by 2 weeks co-culture, then sutured into osteochondral complex. The co-culture tissue-engineered cartilage was transplanted into the defect region. The tissue-engineered cartilage constructed with single chondrocytes served as control group. Those received no intervention as blank control group. Six months later, the gross observation and histological staining were performed, as well as the dying area of collagen type II and level of glucosamine polysaccharide were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: In the co-culture group, the tissues were chondroid with smooth and glossy surface, and well connected with the surrounding tissues. The control group presented with fiber-like tissues, while the blank control group showed no changes. The distribution of cartilaginous extracellular matrice in the co-culture group was more homogenous than the others, and there was a good connection between newly born tissues and the surrounding tissues as well as subchondral bone. Furthermore, the dying area of collagen type II and level of glucosamine polysaccharide in the co-culture group were significantly higher than those in the other groups (P < 0.05). To conclude, the co-culture of chondrocytes and BMSCs can improve the quality of tissue-engineered cartilage, which effectively contributes to the repair of articular cartilage.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Chondrocytes, Mesenchymal Stem Cells, Cartilage, Articular, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 2

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引言

材料方法

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2014年1月至2015年6月在南京医科大学附属无锡第二医院转化医学中心进行细胞实验及动物实验。

1.3 材料

1.3.1 动物小型猪，1月龄，雌雄各半，泰州小型猪培育基地提供。

1.3.2 试剂与仪器 DMEM/F12培养基(Gibco公司，美国)，胰蛋白酶(Gibco公司，美国)，胎牛血清(杭州四季清公司)，Percoll分离液(Sigma公司，美国)，Ⅱ型胶原酶(Gibco公司, 美国)，六孔细胞培养板(Corning公司，美国)，25 cm²/ 75 cm²培养瓶(Corning公司，美国)，10 cm细胞培养皿(Corning公司，美国)，15 mL/50 mL离心管(Corning公司，美国)，多聚赖氨酸(Sigma公司，美国) ，聚乳酸聚羟基乙酸聚合物无纺网支架(上海易括公司)，细胞培养箱(德国Hereus BB5060型)，倒置显微镜及照相系统(Olympus公司，日本)，YJ-875型超净工作台(苏州净化设备厂)，DAB试剂盒(南京伯德生物制剂公司)，Ⅱ型胶原单克隆抗体(MAB1330，Calbiochem公司，美国)，二硫苏糖醇 (Sigma公司, 美国)，1，9-二甲基亚甲蓝(Sigma公司，美国)，硫酸软骨素(Sigma公司，美国)，碘乙酸(Sigma公司，美国)。

1.4 方法

1.4.1 实验分组 18头1月龄小型猪分别编号，按随机数字表法分入各组。空白组：软骨缺损不作处理；对照组：单纯软骨细胞培养工程软骨；共培养组：软骨细胞和骨髓间充质干细胞共培养组织工程软骨。

1.4.2 猪关节软骨细胞的分离与扩增对照组及共培养组小型猪，手术切取膝关节非负重区关节软骨，用PBS洗涤后剪成约1 mm³大小，0.25%胰酶37 ℃消化30 min后，弃上清，加入0.2%Ⅱ型胶原酶37 ℃消化4 h，过滤，滤液 1 000 r/min离心5 min，收集细胞。锥虫蓝拒染法细胞活性记数≥ 95%，原代细胞以5×10⁷ L^-1接种于25 cm²培养瓶内培养。待细胞90%融合后传代，至第2代末备用。

1.4.3 猪骨髓间充质干细胞的分离与扩增无菌条件下于猪股骨下端骨穿，抽取骨髓2 mL，用不含血清的DMEM/F12培养基制成单细胞悬液，小心加入预先有相对密度为1.108 3的Percoll分离液的离心管内，离心，吸取中间界面乳白色的单个核细胞层，洗涤后加完全培养基(含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12)重悬，接种于25 cm²培养瓶内培养。每3 d换液1次。倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，待细胞铺满瓶底的90%时传代，至第2代末备用。

1.4.4 软骨细胞的鉴定第1代软骨细胞接种于玻璃盖玻片上3 d后，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色发现，软骨细胞细胞质颜色棕黄，较深，说明软骨细胞有较高的Ⅱ型胶原表达，未有去分化现象出现，符合实验要求(图1)。

1.4.5 骨髓间充质干细胞的鉴定流式细胞仪检测第1代骨髓间充质干细胞，90.07%的细胞表达CD29，83.86%的细胞表达CD44，仅有2.82%的细胞表达CD34。说明骨髓间充质干细胞纯度较高，符合实验要求(图2)。

1.4.6 软骨细胞及骨髓间充质干细胞共培养收获第2代软骨细胞和骨髓间充质干细胞，按2∶1混合，细胞总数为1×10⁶吹匀接种于75 cm²培养瓶培养至90%融合备用。

1.4.7 支架处理将聚乳酸聚羟基乙酸聚合物支架剪成直径4 mm大小，浸泡无菌10%多聚赖氨酸，无菌环境下晾干，环氧乙烷消毒后备用。

1.4.8 组织工程软骨的构建收获共培养细胞和软骨细胞，调整细胞浓度至4×10¹⁰ L^-1，取24个备用支架，置于六孔培养板内(每孔1个)，每个支架缓慢滴加40 µL细胞悬液(勿使悬液溢出支架外)，待细胞悬液渗入支架内，将支架移入 37 ℃，体积分数5%CO₂的培养箱静置4 h。每孔加2 mL培养液，1 d后加足量培养液，隔日换液，培养2周(图3)。

1.4.9 动物实验各组小型猪，以氯胺酮肌注，戊巴比妥钠静脉维持麻醉。常规消毒一侧膝关节，取膝关节前正中切口切开皮肤皮下组织及深筋膜，外翻髌骨，暴露股骨髁。以4 mm环锯于股骨髁负重面钻孔做软骨缺损模型(图4A)。空白组关闭伤口。对照组植入相应编号的组织工程软骨(图4B)，共培养组植入相应编号的共培养组织工程软骨(图4C)，均用4-0可吸收缝线固定于周围软骨，常规闭合伤口。半年后处死，取材检测。

1.5 主要观察指标

1.5.1 大体标本观察取组各实验膝关节，大体观察缺损处修复情况，包括修复组织的色泽、形态、组织弹性、表面光滑度。切面观察修复处组织的形态，与周围组织的结合情况。

1.5.2 组织学观察各组标本用40 g/L多聚甲醛固定，每个标本取9张切片分别用苏木精-伊红染色，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色(SP法DAB显色)镜下观察。应用Image-proplus 6.0图像分析系统对Ⅱ型胶原免疫组织化学染色切片行Ⅱ型胶原染色面积半定量分析。

1.5.3 糖胺聚糖含量检测每个样本加1 mL消化液(含 1 mmol/L EDTA，300 mg/L木瓜蛋白酶，2 mmol/L二硫苏糖醇)匀浆，65 ℃消化1 h后加消化终止液(含50 mmol/L Tris/HCL，20 mmol/L碘乙酸)至5 mL终止消化待测。吸取样品100 µL加2.5 mL显色剂(含3.04 g/L甘氨酸，16 mg/L 1，9二甲基亚甲蓝，2.37 g/L NaCL)混匀，反应15 s，于525 nm波长处比色，测定吸光度。以硫酸软骨素为标准品，绘制标准曲线。计算糖胺聚糖含量(比色法)。

1.6 统计学分析实验数据以x(_)±s表示，采用SPSS 13.0 软件对实验结果进行处理，各组之间比较采用单因素方差分析，各组之间两两比较采用q 检验，检验水准为α=0.05。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

种子细胞来源不足是制约软骨组织工程临床应用的重要因素，其选择及体外培养扩增是软骨组织工程领域的一个研究热点。取自体软骨细胞，分离培养扩增，体外构建组织工程软骨，回植修复关节软骨缺损，已取得了较好的临床效果^[9-12]。诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化，也能够构建较高质量的组织工程软骨^[13-15]。但关节软骨细胞来源有限，体外长时间培养易致细胞老化失活^[16-17]。而经骨髓间充质干细胞诱导分化生成的软骨细胞表型易丢失，软骨质量欠佳^[18-19]。故单独以软骨细胞或骨髓间充质干细胞构建工程软骨都存在一定的局限性。

鉴于单独采用软骨细胞或骨髓间充质干细胞构建工程软骨都存在一定的局限性，那么软骨细胞和骨髓间充质干细胞共培养能否扬长避短^[20-22]，构建出更高质量的工程软骨？Chen等^[23]将人软骨细胞与骨髓间充质干细胞以半透膜间隔，进行非接触共培养，1周后检测发现共培养组的骨髓间充质干细胞的aggrecan和Ⅱ型胶原表达增加，故他们认为在共培养体系中软骨细胞能诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。Tsuchiya等^[24]将牛软骨细胞和人骨髓间充质干细胞共培养，发现共培养组生长明显优于单纯软骨细胞组，且牛来源的Ⅱ型胶原表达增加，故他们认为骨髓间充质干细胞能够促进软骨细胞增殖和细胞外基质的合成。在作者前期的研究中，将兔骨髓间充质干细胞与兔关节软骨细胞在体外共培养1代，接种于聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架，构建组织工程软骨。作者发现共培养构建的工程软骨体积大，光滑，有弹性，组织学观察显示细胞增殖旺盛，分布均匀，排列紧密，较多细胞外基质融合成片，有软骨陷窝形成；Ⅱ型胶原染色面积、糖胺聚糖含量等均高于单纯软骨细胞培养组，同时发现兔软骨细胞与兔骨髓间充质干细胞按2∶1的比例共培养时，效果最佳^[8]。

目前在体外已经能够构建出高质量的组织工程软骨，那么将工程软骨移植入体内修复关节软骨缺损效果如何呢^[25-26]？Komárek等^[27]等将组织工程软骨以纤维蛋白凝胶固定于软骨下骨，修复关节软骨缺损，92.3%获得了满意效果，但该方法固定较差，易造成工程软骨的移位、丢失和塌陷。Knecht等^[28]比较了软骨缝合、纤维蛋白凝胶、穿骨缝合工程软骨的生物力学性能，发现穿骨缝合固定工程软骨生物力学性能最好，而纤维蛋白凝胶固定性能最差。但穿骨固定的工程软骨和周围组织的融合仍然较差。那么，如何才能实现组织工程软骨更加牢固的固定，更快的愈合，同时于周围组织更好的融合？杨强等^[29]将犬股骨头负重区骨柱脱细胞处理制备骨支架，利用软骨细胞外基质制备软骨支架，采用相分离技术制备骨-软骨双层支架。将成软骨诱导的骨髓间充质干细胞接种于双层支架，构建骨软骨复合体，修复犬股骨头负重区软骨缺损，结果发现软骨缺损效果不佳。作者前期体外分离培养扩增猪成骨细胞及关节软骨细胞，分别接种于磷酸三钙和聚乳酸聚羟基乙酸聚合物上培养2周，通过缝合组成自体骨软骨复合体，并将该复合体嵌入缺损区，修复关节软骨缺损。以组织工程软骨缝合固定为对照。半年后取材检测。作者发现骨软骨复合体组的大体观察及组织学评分等方面均优于对照组^[30]。作者的实验不同于杨强等^[29]以骨髓间充质干细胞作为种子细胞，而是采用成骨细胞和软骨细胞作为种子细胞，具有良好的软骨及骨的表型，通过缝合方式构成骨软骨复合体，能够实现工程软骨较好的固定，以利与周围组织融合，从而达到良好的修复效果。因此作者认为，体外高质量的组织工程软骨，结合体内良好的固定技术，才能较好的修复关节软骨缺损。

在本次研究中，体外培养扩增猪关节软骨细胞及骨髓间充质干细胞，共培养2代，接种于聚乳酸聚羟基乙酸聚合物上继续共培养2周构建共培养组织工程软骨。以单纯软骨细胞构建组织工程软骨为对照，通过缝合固定于磷酸三钙形成骨软骨复合体，回植修复关节软骨缺损。半年后行大体观察，组织学切片，Ⅱ型胶原免疫组化染色，定量检测Ⅱ型胶原染色面积及氨基糖胺聚糖含量。结果发现，共培养组的修复组织呈软骨样，表面光滑平坦，与周围关节软骨组织整合良好。组织学观察显示其结构致密，细胞外基质分布更均匀，与周围关节软骨组织及软骨下骨组织整合良好。Ⅱ型胶原染色面积及糖胺聚糖含量均优于对照组及空白组。作者认为，软骨细胞和骨髓间充质干细胞体外共培养构建了高质量的组织工程软骨，通过缝合于磷酸三钙构成骨软骨复合体，实现了体内环境下的良好固定，从而较好的修复了关节软骨缺损。

综上所述，以软骨细胞和骨髓间充质干细胞作为种子细胞，体外扩增后，共培养构建高质量组织工程软骨，通过缝合的方式组成骨软骨复合体移植物，可实现良好固定，愈合较快，组织工程软骨与宿主关节软骨间整合好，能有效修复关节软骨缺损。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程