间接共培养条件下成熟脂肪细胞诱导成骨细胞成脂横向分化的能力

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.28.001

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
细胞共培养技术：是在体外条件下将细胞与另一种细胞共同培养，还原部分体内微环境的状态下使细胞进行生长和繁殖，从而观察细胞的形态结构和生命活动变化的一种细胞培养技术。该技术具有提供大量生物性状相似的实验对象以及耗资少等优点，且排除了诱导液、血清中的干扰因素、诱导因素等不确定因素。
Transwell：是一种共培养体系装置，一类有通透性的杯状的装置，可以认为这是一种膜滤器，也可认为是一种有通透性的支架。

摘要
背景：细胞共培养技术是在体外条件下将细胞与另一种细胞共同培养。对于成骨细胞和脂肪细胞横向分化研究多采用体外条件下成脂诱导液诱导成骨细胞发生横向分化，而忽略了体内环境中细胞互相作用的因素。
目的：探讨在Transwell间接共培养条件下成熟脂肪细胞诱导成骨细胞成脂横向分化的能力。
方法：①选取小鼠成纤维样3t3-l1前体脂肪细胞进行成脂诱导为成熟脂肪细胞；②实验分组：A组接种成熟脂肪细胞(Transwell间接共培养体系下室)，B组接种小鼠成骨样细胞mc3t3-e1(以1∶4比例接种到Transwell间接共培养体系上室)，C组单独培养的小鼠成骨样细胞mc3t3-e1；③检测指标：分别在 7，14，21 d倒置相差显微镜下观察细胞形态变化，检测各组细胞三酰甘油相对含量、成脂目的蛋白PPARγ2表达，并进行油红O染色以及茜素红染色观察；以0，24，36 h为截点检测B组与C组细胞增殖抑制率的变化。
结果与结论：①培养2周时，3t3-l1细胞由长梭形变为圆形，胞质内脂滴增多呈亮圆形，油红O染色鉴定后备用；②细胞形态：B组共培养7 d时呈长梭形，未见透明脂滴；14 d时胞质内出现黑色颗粒及小圆形脂滴；21 d细胞形态由长梭形变为椭圆形或圆形，脂滴变大；③茜素红染色：7，14，21 d 时B组细胞呈染色区减少的趋势，C组细胞无明显变化均呈大片着色区；④油红O染色：7，14，21 d时，B组细胞染色区呈递增趋势且与时间成正比，C组细胞染色阴性且无明显变化；⑤三酰甘油：B组细胞三酰甘油聚集量呈递增趋势且与时间成正比，B组组间及与A组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，C组无明显变化(P > 0.05)；⑥MTT抑制率：B组细胞增殖抑制率与时间成正比，与C组差异有显著性意义(P < 0.05)；⑦Western blot实验：B组细胞PPARAγ2蛋白表达量呈递增趋势且与时间成正比，与A、C组相比，差异均有显著性意义(P < 0.05)；⑧结果提示，在Transwell间接共培养体系中，成骨细胞在成熟脂肪细胞诱导下呈现出成脂横向分化趋势，其中脂肪细胞代谢产物及细胞因子可明显抑制成骨细胞的增殖能力，其是否可以完全横向分化为脂肪细胞有待进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-6227-8014(齐新文)

关键词: 组织构建, 骨细胞, 横向分化, 细胞共培养, 脂肪细胞, 成骨细胞

Abstract:

BACKGROUND: Co-culture technique makes different kinds of cells cultured in the same system. The trans-differentiation from osteoblasts to adipocytes is usually analyzed under the action of adipogenesis inducers in vitro, but the cellular interactions in vivo are neglected.
OBJECTIVE: To investigate the trans-differentiation from osteoblasts to adipocytes in indirect co-culture using Transwell system.
METHODS: Mouse preadipocytes 3t3-l1 were induced to adipocytes. There were three groups: group A: mature adipocytes in the lower chamber of Transwell system; group B: mouse osteoblasts MC3T3-E1 in the upper chamber of Transwell system according to a ratio of 1:4 (MC3T3-E1:3t3-l1); group C: mouse osteoblasts MC3T3-E1 alone. At 7, 14, and 21 days the cell morphology was observed under inverted phase contrast microscope, the relative level of triglyceride, expression of peroxisome proliferator-activated receptor γ2 in each group were detected, and red oil O staining and alizarin red staining were performed. The cell proliferation inhibition rate in the groups B and C were detected at 0, 24 and 36 hours.
RESULTS AND CONCLUSION: At 2 weeks after culture, spindle-shaped 3t3-l1 cells changed into round, the light and round lipid droplets in the cytoplasm were increased and were reserved after identified by oil red O staining. In the group B, the cells presented with spindle shape with no transparent lipid droplets after 7-day co-culture until black granules and small round lipid droplets appeared on day 14; and the cells changed from spindle shape to oval or round, and larger lipid droplets were found on day 21. Alizarin red staining results: the staining region in the group B was on a decline with time, while the group C showed no significant changes at each time point and all appeared with large staining region. Oil red O staining results: the staining region in the group B increased gradually in a time-dependant manner, while the group C was negative for oil red O staining and showed no significant changes at different time points. The relative level of triacylglycerol in the group B was increased with time, and there was significant difference between groups A and B (P < 0.05), and the group C showed no significant differences (P > 0.05). The cell proliferation inhibiting rate in the group B was increased with time, which showed significant difference from the group C (P < 0.05). The expression level of peroxisome proliferator-activated receptor γ2 in the group B was on a rise with time, which had significant difference compared with the groups A and C (P< 0.05). These results indicate that the trans-differentiation from osteoblasts to adipocytes appears in the Transwell system, and metabolic products and cytokines of adipocytes obviously inhibit the proliferation of osteoblasts, but all above conclusions need to be studied in depth.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Coculture Techniques, Adipocytes, Osteoblasts, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

齐新文，安荣泽，李翼飞，袁小洪，陈军平，谭伟源，叶燕彬. 间接共培养条件下成熟脂肪细胞诱导成骨细胞成脂横向分化的能力[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(28): 4429-4435.

Qi Xin-wen, An Rong-ze, Li Yi-fei, Yuan Xiao-hong, Chen Jun-ping, Tan Wei-yuan, Ye Yan-bin. Trans-differentiation from osteoblasts to adipocytes in indirect co-culture[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(28): 4429-4435.

图/表（结果） 2

2.1 3t3-l1前体脂肪细胞的成脂诱导 成脂诱导2 d后，前体脂肪细胞变得更为细长，圆形，多角形的细胞消失；成脂诱导4 d时前体脂肪细胞胞质内开始出现小的脂滴，呈亮圆形，多少大小不一，胞核被推向一侧，细胞形态仍呈长梭形(见图3A)；诱导6 d，细胞胞质内的脂滴数目增加，脂滴出现融合，约30%细胞变为圆形(见图3B)；诱导培养8 d后，脂滴融合现象更加明显，并且超过细胞本身的体积，80%的前体脂肪细胞胞质内出现脂滴(见图3C)；成脂诱导第14天时，出现变化的细胞数目未见明显增加(可能与细胞状态及老化有关)，脂滴体积进一步增加，形成大的脂滴空泡(见图3D)，细胞变为圆形或者类圆形，呈典型成熟脂肪细胞的形态和特征。

2.2 细胞油红O脂肪染色鉴定 倒置相差显微镜下，小鼠3t3-l1前体脂肪细胞成脂诱导10 d后油红O染色结果显示，90%以上胞质红染(见图4)，可鉴定小鼠3t3-l1细胞分化为成熟脂肪细胞。

Transwell共培养B组、A组及C组油红O染色结果显示：①B组接种于Transwell上室的小鼠MC3T3-E1成骨样细胞呈成纤维样或三角形；共培养7 d后于倒置相差显微镜下见细胞形态开始变化为圆形，但胞质内未见明显脂滴，油红O染色未见明显红染(见图5a)；共培养14 d后，胞质内开始出现少许脂滴，偶见脂滴融合，油红O染色少量细胞出现红染；共培养21 d后，细胞变圆且膨胀，胞质内脂滴数量明显增多，仍然有细胞呈梭形及三角形，油红O染色可见细胞大量红染，但无成熟脂肪细胞明显(见图5b)；②C组单独培养的MC3T3-E1小鼠成骨样细胞形态也未见明显改变，细胞数量未见明显减少，行油红O染色未见明显的红染(见图5c)。本镜下图像选取无偏向性，选取图片为多个图片及多个视野的平均中性图片。该处本应该量化比较(即应用灰度值进行量化)，这样更客观及更加容易和科学选取平均值作为结局指标。由于图片阳性阴性对照较明显，固本实验未采取量化比较(茜素红染色试验的比较为量化，原因同上)。

2.3 茜素红染色结果 共培养组B组7 d时茜素红染色明显，14 d时染色区开始出现减少，21 d时染色区明显减少；C组采在培养7，14，21 d后采用茜素红染色检测未见染色区明显变化(见图6)。

2.4 Transwell 间接共培养条件下细胞增殖抑制率的检测(MTT法) 采用t 检验对 0 h B、C组间比较，差异无显著性意义(P > 0.05)；24 h时，B组抑制率为(64.917±0.002)%，C组抑制率为(23.333±0.034)%)，差异有显著性意义(P < 0.05)；36 h时，B组抑制率为(71.000±0.004)%，C组抑制率为(56.333±0.003)%，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图7。

2.5 三酰甘油相对含量的测定 分别取7，14，21 d为截点终止细胞生长，BCA法测量三酰甘油相对含量，B组与C组相比采用t 检验，14，21 d两组细胞三酰甘油相对含量以及B组间14 d和21 d 的三酰甘油相对含量比较，差异有显著性意义(P < 0.05)；7 d 时B组与C组及C组组间7，14，21 d三酰甘油相对含量比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，见图8。B组细胞14 d左右出现形态变化，胞质内出现透明圆形脂滴，21 d时细胞大部分由长梭形变为圆形、椭圆形，胞质内脂滴变大变亮。

2.6 Western blot法测PPARγ2蛋白表达量 分别提取A、B、C组细胞，提取细胞裂解液后经SDS-PAGE凝胶电泳后分离目的蛋白，孵育抗体后给予发光剂后于X胶片上曝光，用Quantity One软件测量其灰度值。统计处理对比后发现B组与C组在14 d和21 d比较以及B组3个时间段自我比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，B组与A组在3个时间段比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1及图9。

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引言

骨质疏松症具有低骨量以及骨组织微结构破坏的特点，是一种能导致骨脆性增加继而容易发生骨折的疾病。骨质疏松症等骨量减少性疾病由多种因素导致，其发病机制尚末完全明确，治疗也停留在较初级阶段^[1-2]。研究骨质疏松发生过程中骨髓腔内成骨细胞减少以及脂肪细胞量增多的可能机制成为了近年来的热门与难点^[3-6]。国内外研究者证明，在体外条件下利用鸡尾酒序贯诱导法可使松质骨的成骨细胞横向分化为成熟的脂肪细胞^[7-8]。

细胞共培养技术是在体外条件下将细胞与另一种细胞共同培养，还原部分体内微环境的状态下使细胞进行生长和繁殖，从而观察细胞的形态结构和生命活动变化的一种细胞培养技术^[9-10]。该技术具有提供大量生物性状相似的实验对象以及耗资少等优点，且排除了诱导液、血清中的干扰因素、诱导因素等不确定因素^[11]。目前国内外共培养的研究多倾向于诱导干细胞向另一种终末分化的细胞分化，如上皮、神经、骨骼肌、脂肪、成骨、韧带、软骨细胞等^[12-15]。对于成骨细胞和脂肪细胞横向分化研究多采用体外条件下成脂诱导液诱导成骨细胞发生横向分化，而忽略了体内环境中细胞互相作用的因素。文章采用脂肪细胞在Transwell间接共培养条件下诱导成骨细胞成脂横向分化，验证在骨量减少性疾病的发病过程中，骨髓腔内成骨细胞的分化及稳定性是否因共存的脂肪细胞而发生改变，检测和评估分化过程中细胞及特殊蛋白的表达，为骨量减少性疾病如骨质疏松症发病机制的探讨和疾病治疗提供新的理论依据和思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞体外观察实验。

1.2 时间及地点 于2013年8月至2014年3月在遵义医学院珠海校区中心实验室完成。

1.3 材料 DMEM (hyclone美国)；0.25%Trypsin，DMSO (广州凯基生物工程有限公司)；IBMX(北京北纳创联生物工程研究所)；胎牛血清(Gibco美国)；大鼠抗小鼠一抗(Santa cruz美国)；羊抗大鼠二抗(武汉博士德生物科技有限公司)；蛋白抽提试剂盒、Bca蛋白浓度试剂盒、茜素红染色试剂盒、油红O染色试剂盒(广州杰特伟生物科技有限公司)；MD-bio MARKER(广州威佳科技有限公司)；四唑盐MTT(MBchem公司)；三酰甘油检测试剂盒、碱性磷酸酶染色试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养及制备 本实验采用3t3-l1小鼠前体脂肪细胞和mc3t3-e1小鼠成骨样细胞，均购自美国ATCC(上海)公司。

均采用高糖DMEM完全培养基培养，每3 d换液1次，消化采用含有0.02%EDTA的0.25%胰酶消化。mc3t3-e1小鼠成骨细胞应选择体积分数为5%胎牛血清、4%完全培养基以及1%DMSO的冻存液，3t3-l1小鼠前体脂肪细胞应选择体积分数为9%胎牛血清、1%DMSO的冻存液进行冻存备用。操作前将准备物品放置于超净台内，以紫外照射超净台及操作间30 min以上，所有试剂放于37 ℃恒温水浴箱中溶解待用。细胞复苏采取快速复温法，复苏后温度37 ℃条件培养，每日观察，隔日换液。

3t3-l1小鼠前体脂肪细胞的成脂诱导：采用鸡尾酒法诱导小鼠前体脂肪细胞(3t3-l1细胞)获得成熟脂肪细胞。待3代以后的3t3-l1细胞生长融合至80%左右时，将细胞密度调整为1×10⁵后将细胞接种到6孔板中后，放置于体积分数5%CO₂，温度37 ℃条件培养箱中培养。隔天观察并加入成脂诱导液，14 d约80%前体脂肪细胞变为成熟脂肪细胞。

1.4.2 Transwell间接共培养体系的建立和实验分组 向六孔板3t3-l1小鼠前体脂肪细胞成脂诱导14 d时停止诱导，培养液更换为高糖DMEM完全培养基，按照4∶1比例，用细胞计数板将mc3t3-e1小鼠成骨细胞悬液浓度调整为2.5x10⁴后加入到Tanswell小室中(见图1)，将小室放入六孔板中后将小室体系放入培养箱内，体积分数5%CO₂，温度37 ℃条件下培养。隔天换液，每日镜下观察记录。分组：①体系中上室mc3t3-e1小鼠成骨细胞设为实验组B组(见图1)；②体系中下室3t3-l1小鼠成熟脂肪细胞设为实验组A组(见图2)；③高糖DMEM完全培养基单独培养的mc3t3-e1细胞设为对照组C组。

1.4.3 细胞油红O染色 ①3t3-l1前体脂肪细胞成脂诱导14 d时油红O鉴定；②选择共培养体系中A组、B组及C组第0，7，14，21天成脂分化的鉴定检测。培养箱中取出细胞，PBS冲洗2遍。加入少量40 g/L多聚甲醛溶液固定60 min，弃掉固定液后PBS清洗3遍。向标本加入6∶4比例配制油红O工作液染色30 min。弃工作液，PBS清洗2次以上至无色，显微镜下拍照观察记录。

1.4.4 三酰甘油相对含量的测定 按照7，14，21 d 3个时间点检测实验组、对照组的三酰甘油相对含量，按照制备裂解液、测定蛋白浓度、测定三酰甘油浓度的步骤操作并记录，每样本重复6次。严格按照试剂盒说明书操作：采用酶偶联比色法测定，参照样品所得蛋白浓度计算三酰甘油相对含量。

1.4.5 茜素红染色检测 该检测用于成骨细胞的鉴定以及对于A，B组以及C组在0，7，14，21 d成骨标志物表达量进行检测。细胞弃掉培养液，PBS缓慢清洗3遍；用体积分数10%中性甲醛固定4 min后PBS清洗2遍。0.1%茜素红染液染色30 min，去离子水冲洗至无色。显微镜下观察、拍照并记录。

1.4.6 MTT细胞增殖抑制率的检测 将96孔板按照0，24，36 h、分为3组，收集对数期细胞，边缘孔PBS填充，体积分数5%CO₂、37 ℃孵育。每孔加入细胞数量为5×10³，2 h后观察细胞贴壁状况，每孔细胞铺板面积约为60%；细胞贴壁后加入FCCM条件培养基300 μL/孔标记为0 h组^[16]；按24，36 h终止细胞增殖，每孔避光加入0.1%MTT 15 μL；4 h后加入DMSO 150 μL /孔；震荡10 min后于烘箱内孵育约5 min后观察培养板颜色发生变化后选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的吸光度(A)值。计算细胞增殖抑制率(%)=(1-B组平均A值/C组平均A值)×100%。以上操作重复6次。

1.4.7 Western blotting检测Transwell间接共培养体系中3t3-l1细胞、mc3t3-e1细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(Peroxisome proliferator-activated receptor γ2，PPARγ2)的表达量改变 ①细胞总蛋白的提取：弃掉细胞培养基，加入蛋白裂解液，吸出细胞裂解液转移至EP管中。高速离心后吸取上清蛋白液，转移到新的去酶EP管中，并保存于-80 ℃超低温冰箱内；②BCA法检测总蛋白含量：按50∶1比例配制适量BCA工作液，各孔加入200 μL BCA工作液，酶标板放置于摇床震荡30 s，37 ℃放置30 min，在562 nm波长条件下比色测定。以标准蛋白浓度为横坐标，A值为纵坐标，绘制出标准曲线。得到成熟3t3-l1小鼠脂肪细胞总蛋白浓度为1.391 g/L，mc3t3-e1小鼠成骨细胞总蛋白浓度为1.12 g/L；③SDS-PAGE凝胶电泳：目的蛋白相对分子量为55 000-67 000，所以分离胶浓度采用最佳范围在20 000-80 000 的10%分离胶。上样后进行电泳检测，然后应用马考斯亮蓝法检测目的蛋白，转印后封闭液封闭，一抗孵育，二抗孵育，清洗，曝光。β-actin内参的孵育与显色后用Quantity One图像软件进行分析，并记录灰度值。

1.5 主要观察指标 7，14，21 d在倒置相差显微镜下观察细胞形态，检测各组细胞三酰甘油相对含量、成脂目的蛋白PPARγ2表达，并行油红O染色以及茜素红染色观察；以0，24，36 h为截点检测B组与C组增殖抑制率的变化。

1.6 统计学分析 统计分析采用SPSS 19.0软件，使用方差分析进行组内及组间的差异性比较；对于细胞增殖抑制率和三酰甘油相对含量的测定比较采用t 检验。数据以x(_)±s表示，P < 0.05表示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

共培养技术分为3种。第1种是应用最早的直接共培养方法，即将不同种细胞直接混合培养。第2种Transwell小室培养法(非直接接触共培养法)是将插入式培养皿放入相应规格的细胞培养板中，上下两层的细胞由0.22 μm的过滤膜隔开，通过细胞因子及代谢产物的互通产生相互作用，也是近年来比较热门的细胞培养技术，其优点是排除其他干预因素，明确靶性关系及细胞分开培养便于观察及检测等。本实验上、下室接种细胞的比例参考Lovati等^[12]的方法，因为Lovati证实在细胞共培养体系建立时以1∶4的比例接种诱导细胞和靶细胞所产生的效果最明显。第三种是三维培养中细胞通过紧密连接或缝隙连接等方式建立联系，在基因表达、基质分泌及细胞功能活动等方面与二维培养均有明显差异。本实验采取Transwell非接触性间接共培养体系，采用 1∶4的上下室比例将小鼠成骨样细胞接种于上室，成熟脂肪细胞接种于下室，共培养7 d观察上室成骨样细胞呈长梭形，共培养14 d时可见上室细胞仍呈长梭形，胞质内逐渐出现黑色颗粒物质及少量脂滴，培养至21 d，上室细胞形状出现变化，部分细胞变得圆钝，胞质内脂滴聚集增多，但一小部分细胞仍无明显变化。通过油红O染色和茜素红染色试验表明3t3-l1前体脂肪细胞的成脂诱导成功，以及共培养条件下成骨细胞向脂肪细胞横向分化的发生。

三酰甘油的含量是脂肪细胞分化的标志，当三酰甘油合成速度大于脂解速度时就会产生三酰甘油的积累，在脂肪细胞积累三酰甘油过程中，脂解变化可能存在两种情况：①脂解作用减弱，促进三酰甘油积累；②为满足三酰甘油合成所需要的大量游离脂肪酸，脂肪细胞不仅通过吸取培养液中游离脂肪酸，还自身分解游离脂肪酸来获取。本实验中以细胞内蛋白含量作为参照，对间接共培养体系中的MC3T3-E1小鼠成骨样细胞组三酰甘油含量进行测定，在7d时未见明显增多，在培养14 d时开始大量出现三酰甘油的积累，到培养21 d时达峰值，与对照组(C组)比较差异有显著性意义，本实验从效应学的角度表明成熟脂肪细胞可以诱导成骨样细胞发生成脂的横向分化。

横向分化是近年来公认的骨质疏松发病的可能机制之一，骨髓腔内的成骨细胞具有横向分化为脂肪细胞的潜能^[17-18]，Kim等^[19]研究发现成脂转录因子PPARγ、C/EBPα是成脂分化过程中的重要分子开关，上调PPARγ、C/EBPα的表达使得成骨细胞向脂肪细胞横向分化；Wnt信号通路是成脂-成骨的作用靶点，抑制PPARγ的表达可抑制成脂分化，加强Runx2的表达可以促进成骨的形成^[20]。PPARγ有3个亚型：PPARγ1、PPARγ2和PPARγ3，其中PPARγ2特异地表达于脂肪组织特别是在成脂早期分化中特异表达，PPARγ2的表达水平与成脂分化的程度呈正相关，PPARγ2被认为在成脂分化早期有着重要的作用^[21-24]。Sadie-Van等^[24]发现骨质疏松症患者多数存在着髓内脂肪细胞数量增多的现象。也证实PPARγ信号的增强会使得髓腔内脂肪细胞-成骨细胞比例失衡现象的发生，骨髓内存在的脂肪组织及其分泌因子，如Aguoti蛋白以及Aguoti相关蛋白(AGRP)等会抑制成骨细胞的增殖能力和前体成骨细胞的成骨分化能力。本实验在Transwell间接共培养体系中诱导小鼠MC3T3-E1成骨样细胞组(B组)、3t3-l1小鼠成熟脂肪细胞组(A组)及高糖DMEM完全培养基单独培养的mc3t3-e1细胞组(C组)各7、14、21 d后，采用Western blot法检测PPARγ2含量，结果显示B组在培养7 d时几乎不表达，14 d时开始表达，虽与7 d组表达差异具有显著性意义，但是表达量不高；至21 d时表达量出现增高，其与7 d组、14 d组目的蛋白表达量差异显著。B组与C组比较差异有显著性意义，B组与A组比较差异明显。表明在B组细胞共培养21 d后PPARγ2蛋白具有表达增多趋势，说明在Transwell间接共培养体系中，成骨细胞在成熟脂肪细胞及其分泌因子诱导下呈现出成脂横向分化趋势，但是细胞蛋白表达量未能达到成熟脂肪细胞目的蛋白表达量，说明还未能完全转化为成熟脂肪细胞，是否随时间的延长逐渐向成熟脂肪细胞分化还是会出现停滞分化现象，需要更进一步的研究和探讨。

对于骨髓组织内脂肪细胞的功能有以下3种认识：①脂肪细胞仅具有填充骨髓腔的作用而无造血功能；②脂肪细胞仅为造血和骨折愈合等病理生理过程提供能量支持；③脂肪细胞支持如造血细胞、淋巴细胞等的分化发育，为其提供物质基础^[25-26]。Runx2与碱性磷酸酶是成骨的早期标志，在PCR和Western blot等实验检测中可得到在FCCM条件培养基条件下，前体成骨细胞的碱性磷酸酶染色减少，表明碱性磷酸酶表达下降，表明FCCM条件培养基可以下调成骨分化。FCCM是脂肪条件培养基，由体积分数10%胎牛血清的完全培养基培养成熟脂肪细胞12 h后离心取上清所得。目前对于横向分化方面的研究涉及FCCM培养基的应用较少，本实验在MTT法检测细胞增殖抑制率中应用了该条件培养基培养小鼠成骨样细胞MC3T3-E1，分别取时间点0，24，36 h为节点，经MTT检测后得出B组细胞 24 h组与36 h组增殖抑制率与对照组C组相比差异有显著性意义。本实验中Transwell体系共培养21 d后，B组成骨细胞组茜素红染色明显减少，而油红O染色区域明显增多，表明早期成骨标志物表达下调，而成脂标志物表达增多；2个实验结果共同印证了FCCM培养基及脂肪细胞的分泌产物确实有抑制前体成骨细胞的增殖以及成骨分化的作用。

Fredrickson等^[27]通过对677例男性研究后发现体脂含量与骨量的大小呈反比，并且体脂含量多少与不同种类激素分泌水平密切相关。例如脂肪可以通过脂联素、瘦素等途径作用致骨密度下降^[28-29]。是否可以认为在骨质疏松发病过程中，尤其是肥胖患者的骨髓腔内出现了脂肪细胞“过剩”现象，脂肪细胞大量存在并分泌细胞因子及代谢产物，使成骨细胞发生成脂横向分化的趋势增加而加重骨质疏松发生。那么是否可以通过减少患者体脂含量从而减少骨髓腔内成骨细胞向脂肪细胞转化，从而达到预防和治疗骨量丢失性疾病的作用。

不足与展望：①成骨细胞-脂肪细胞共培养条件可使得成骨细胞有横向分化的趋势但并没有完全还原体内环境的情况下进行；②不能完全确定成骨细胞是否分化成为了成熟脂肪细胞；③在本实验的基础上进一步探讨特定细胞因子如肿瘤坏死因子在其中的作用，或通过特定基因敲除研究上游细胞通路等^[30]，在以上学者进行研究的基础上更加深入的研究与探讨。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程