骨桥蛋白可促进骨关节炎软骨细胞增殖

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.24.001

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (24): 3773-3777.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.24.001

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骨桥蛋白可促进骨关节炎软骨细胞增殖

姜未¹，林博文¹，张轩¹，王华¹，高曙光²，张方杰²

¹深圳市人民医院骨关节科，暨南大学第二临床医学院，广东省深圳市 518020；²中南大学湘雅医院骨科，湖南省长沙市 410006

修回日期:2017-05-03 出版日期:2017-08-28 发布日期:2017-08-30
通讯作者: 姜未，博士，主治医师，深圳市人民医院骨关节科，暨南大学第二临床医学院，广东省深圳市 518020
作者简介:姜未，男，1986年生，湖南省常德市人，汉族， 2013年湘雅医院毕业，博士，主治医师，主要从事骨关节退行性疾病的病因及防治研究。
基金资助:
深圳市科技创新项目(JCYJ20150403101028191)

Osteopontin promotes chondrocyte proliferation in osteoarthritis

Jiang Wei¹, Lin Bo-wen¹, Zhang Xuan¹, Wang Hua¹, Gao Shu-guang², Zhang Fang-jie²

¹Department of Bone and Joint Surgery, Shenzhen People’s Hospital, Second Clinical Medical College of Jinan University, Shenzhen 518020, Guangdong Province, China; ²Department of Orthopedics, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410006, Hunan Province, China

Revised:2017-05-03 Online:2017-08-28 Published:2017-08-30
Contact: Jiang Wei, Department of Bone and Joint Surgery, Shenzhen People’s Hospital, Second Clinical Medical College of Jinan University, Shenzhen 518020, Guangdong Province, China
About author:Jiang Wei, M.D., Attending physician, Department of Bone and Joint Surgery, Shenzhen People’s Hospital, Second Clinical Medical College of Jinan University, Shenzhen 518020, Guangdong Province, China
Supported by:
the Science and Technology Innovation Foundation of Shenzhen, No. JCYJ20150403101028191

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
骨桥蛋白：是一种带负电荷的分泌型糖基化磷蛋白，存在于体内多种细胞和组织，参与骨矿化作用、肿瘤细胞迁移、慢性感染性疾病等病理过程。
细胞增殖：细胞增殖是生物细胞重要生理功能之一，是生物生长、发育、繁殖以及遗传的基础，其主要以分裂的方式进行增殖。

摘要
背景：骨桥蛋白是一种细胞外多功能基质糖蛋白，已被证实参与调控骨关节炎软骨细胞外基质成分的合成分解代谢，但对于骨关节炎软骨细胞本身增殖能力的影响，报道较少。
目的：观察骨桥蛋白对人膝骨关节炎软骨细胞增殖能力的影响。
方法：所有软骨标本均取自湘雅医院于2012年1至6月因骨关节炎行膝关节置换患者，分离培养骨关节炎软骨细胞，分别予以骨桥蛋白干预、骨桥蛋白shRNA慢病毒转染、空白对照及Con-shRNA转染等处理，利用MTT及BrdU法检测细胞的增殖能力变化。
结果与结论：①骨桥蛋白shRNA慢病毒对骨关节炎软骨细胞转染率为80%；②与对照组相比，骨桥蛋白干预可明显上调骨关节炎软骨细胞吸光度值(P < 0.05)，而骨桥蛋白shRNA慢病毒干扰组吸光度值则显著下降(P < 0.05)；③骨桥蛋白shRNA转染后，骨桥蛋白的表达水平显著下降(P < 0.05)；④结果表明骨桥蛋白可促进骨关节炎软骨细胞增殖，有望成为治疗骨关节炎的新靶点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-1141-6207(姜未)

关键词: 组织构建, 软骨细胞, 骨桥蛋白, 骨关节炎, 细胞增殖, RNA干扰, 慢病毒转染, MTT, BrdU

Abstract:

BACKGROUND: Osteopontin, a kind of extracellular matrix glycoprotein, has been found to participate in synthesis and catabolism of osteoarthritic chondrocyte extracellular matrix. However, the effect of osteopontin on the proliferation ability of osteoarthritic chondrocytes is little reported.

OBJECTIVE: To investigate the effect of osteopontin on the chondrocyte proliferation in human knee osteoarthritis.

METHODS: Cartilage samples were obtained from the patients with knee osteoarthritis undergoing knee arthroplasty at the Xiangya Hospital from January 2012 to June 2012. The chondrocytes were isolated and cultured, and then divided into four groups: blank control, osteopontin, Con-shRNA and osteopontin-shRNA groups. The cell proliferation was detected by MTT and BrdU assays.
RESULTS AND CONCLUSION: After transfection of osteopontin-shRNA lentivirus, the infection rate was up to 80%. Compared with the blank control group, osteopontin group showed a significant increase in the absorbance value of osteoarthritic chondrocytes, while after osteopontin-shRNA lentivirus transfection, the absorbance value was significantly decreased (both P < 0.05). Additionally, after osteopontin-shRNA transfection, the expression level of osteopontin was significantly downregulated (P < 0.05). To conclude, osteopontin can promote the proliferation of osteoarthritic chondrocytes, which is considered as a new treatment target for osteoarthritis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Osteopontin, Osteoarthritis, Chondrocytes, Cell Proliferation, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

姜未，林博文，张轩，王华，高曙光，张方杰. 骨桥蛋白可促进骨关节炎软骨细胞增殖[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(24): 3773-3777.

Jiang Wei, Lin Bo-wen, Zhang Xuan, Wang Hua, Gao Shu-guang, Zhang Fang-jie. Osteopontin promotes chondrocyte proliferation in osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(24): 3773-3777.

图/表（结果） 1

参考文献

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引言

材料方法

1.1 设计 体外细胞学实验

1.2 时间及地点 实验于2012年12月20日在湘雅医院完成。

1.3 材料

主要试剂：重组人骨桥蛋白/SPP1蛋白(sinobiological China)；骨桥蛋白抗体(Abgent USA)；Ⅱ型胶原酶(Abcam USA)；0.05%胰蛋白酶-EDTA(GIBICO USA)；DMEM (GIBICO USA)；TRIzol试剂(Invitrogen USA)；反转录试剂盒(Fermentans USA)；MTT试剂盒(sigma USA)；慢病毒工具载体GV115、包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0、293细胞、限制性内切酶AgeⅠ和EcoRⅠ、DH5a感受态细胞(上海吉凯)。

主要仪器：荧光显微镜(奥林帕斯)、CO₂培养箱(日本三洋)、Real-time PCR仪器(Takara)、SDS-PAGE蛋白电泳仪(上海天能)。

实验标本来源：所有人膝骨关节炎软骨标本均取自湘雅医院于2012年1至6月因骨关节炎行膝关节置换的患者，标本取材于关节面软骨外露区边缘的软骨退变区^[16]。所有骨关节炎患者均符合中华医学会骨科学分会制定的《骨关节炎诊治指南(2007版)》中膝骨关节炎诊断标准。根据病史、术前X射线、术中大体形态观察，排除软骨退变、肿瘤、感染、类风湿改变及骨质疏松等。共14例，16膝，其中男4例，女10例，年龄48-73岁，平均(64.1±5.8)岁。本研究已取得湘雅医院伦理委员会批准及患者的知情同意。

1.4 实验方法

1.4.1 人膝骨关节炎软骨细胞的分离、培养及鉴定 截骨块予以简单清洗后切成1 mm×1 mm×1 mm左右的软骨组织块，置于15 mL离心管，并加入0.15%Ⅱ型胶原酶4.0-5.0 mL，置于37 ℃体积分数5%CO₂培养箱消化，直至软骨块消失，转入离心管，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入5 mL完全培养基(DMEM/F-12+20%FBS)，获得软骨细胞悬液。按1×10⁵ L^-1细胞浓度将软骨细胞接种于25 cm²培养瓶内，然后将培养瓶置于37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱中培养，1∶3比例传代，依据细胞生长情况更换培养液，一般情况下，每3 d更换1次。

1.4.2 骨桥蛋白shRNA构建、包装、转染及验证 设计骨桥蛋白shRNA序列，并交由上海吉玛生物合成，序列信息如下：骨桥蛋白shRNA-F：CCG GGT ACA AGA TCA CTG ACT CTT TCA AGA GAA GAG TCA GTG ATC TTG TAC TTT TTG，骨桥蛋白shRNA-R：AAT TCA AAA AAG TAC AAG ATC ACT GAC TCT TCT CTT GAA AGA GTC AGT GAT CTT GTA C。构建到慢病毒工具载体GV115上，转染293T工具细胞包装慢病毒。感染骨关节炎软骨细胞，各孔依次加入稀释慢病毒液及对照液，感染48 h后，观察绿色荧光蛋白的表达情况，取高表达绿色荧光蛋白细胞孔行Real time PCR和WB测试，验证骨桥蛋白shRNA干扰效率。

1.4.3 实验分组 ①首先取体外培养第1代人膝骨关节炎软骨细胞进行骨桥蛋白shRNA慢病毒转染验证实验，分3组：空白对照组、骨桥蛋白shRNA组、Con-shRNA对照组；②其次进行干预实验，分为4组：空白对照组、骨桥蛋白干预组、骨桥蛋白shRNA组、Con-shRNA组。其中空白对照组不做任何处理；骨桥蛋白组给予1 μg/L骨桥蛋白；骨桥蛋白shRNA组用构建的骨桥蛋白shRNA慢病毒转染；Con-shRNA用构建的Con-shRNA慢病毒转染。细胞经处理48 h后，进行后续的实验。

1.4.4 Real-time PCR 按照TRIzol试剂盒(Invitrogen USA)说明进行提取总RNA，利用核酸定量分析仪及凝胶电泳实验鉴定获取RNA纯度、完整性。随后将总RNA反转录为cDNA，根据Genebank中骨桥蛋白序列设计对应探针，合成cDNA，并将1 μL cDNA 模板添加至 PCR 扩增反应体系，95 ℃变性、60 ℃退火、72 ℃延伸，以上循环40次，其中GAPDH为内参。

1.4.5 Western Blot检测 取处于对数生长期的关节炎软骨细胞(细胞浓度1×10⁸L^-1)于EP管内，分为3组，分别予以空白、骨桥蛋白shRNA及Con-shRNA干预，成功转染后的细胞，加入细胞裂解液充分裂解后，离心，获取总蛋白，随后通过考马斯亮蓝法制作标准曲线，检测样品中蛋白含量，进行SDS-PAGE实验，灌胶、上样，每孔注射50 ng蛋白，溴酚蓝跑至距离底端约1 cm时，终止电泳，转膜、添加一抗(1∶500骨桥蛋白抗体Abgent USA)、添加二抗(1∶2 000羊抗兔IgG)，进行化学发光反应，显影、定影，Image J软件分析蛋白条带灰度值。

1.4.6 MTT检测 取对数生长期软骨细胞细胞，分为4组，分别予以空白对照、骨桥蛋白干预、骨桥蛋白shRNA干预、con-shRNA干预，处理48 h后，经胰酶消化终止后，制成1×10⁵ L^-1细胞悬液，接种于96孔培养板中，每组设3-5个复孔，每孔依次加入0.5%MTT溶液10 μL培养4 h后，弃去上清，加入二甲基亚砜100 μL，低速振荡待其充分溶解，在酶联免疫检测仪上于490 nm波长下测试各孔吸光值(24，48，72，96及120 h)。

1.4.7 BrdU检测 实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法，取对数生长期软骨细胞，分为4组，分别予以空白对照、骨桥蛋白干预、骨桥蛋白shRNA干预、con-shRNA干预，细胞处理48 h后，以相同细胞浓度1×10⁸ L^-1接种于抗人BrdU单抗包被的酶标板上，每孔约100 μL，设3-5个复孔，将反应板充分混匀后置37 ℃120 min，洗涤液洗板4-6次后，每孔依次加入第一抗体工作液(生物素化的抗人BrdU)100 μL，洗涤液洗涤，加入酶标抗体(辣根过氧化物酶标记的streptavidin)工作液100 μL，洗涤后，加入底物工作液100 μL，置37 ℃暗处反应15 min，每孔加入100 μL终止液硫酸混匀，30 min内在酶标仪上于490 nm处测各孔吸光值(24，48 h)。

1.5 主要观察指标 ①绿色荧光蛋白表达；②骨桥蛋白 mRNA和蛋白的表达；③骨关节炎软骨细胞增殖能力。

1.6 统计学分析 SPSS 19.0进行统计学分析，采用独立样本t 检验和单样本t 检验分析分别进行两组间比较，P < 0.05表示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

软骨组织主要由软骨细胞及细胞外基质组成，两者相互依赖，相互维持，软骨细胞主要通过合成黏多糖、Ⅱ型胶原、蛋白多糖以及诸多的分解代谢酶，动态调节细胞外基质稳态，而的细胞外基质的完整性对于维持软骨细胞正常增殖十分重要^[17-19]。与正常软骨细胞不同，骨关节炎软骨细胞形态更加细长，更重要的是其合成黏多糖、Ⅱ型胶原、蛋白多糖的能力明显减弱，而DNA含量却相对增多。对于此种现象，Dorotka等^[20]认为骨关节炎软骨细胞属于衰老细胞，细胞本身活力及其合成代谢能力较正常软骨细胞明显减弱，为满足机体需要，其在一定程度上代偿性增殖，且增殖程度与骨关节炎退变、软骨细胞衰老成正相关。Legendre等^[21]研究认为大黄酸对骨关节炎有一定的治疗效果，其具体的作用机制主要是两方面：一方面通过抑制信号通路(ERK和JNK-AP-1)的活化，减少基质金属蛋白酶以及金属肽酶含血小板反应蛋白的分解代谢作用；另一方面则是抑制骨关节炎软骨细胞和滑膜细胞的增殖。除此以外，Tetlow等^[22]研究发现组胺在骨关节炎软骨组织中过高表达，且可上调骨关节炎软骨细胞基质金属蛋白酶13、基质金属蛋白酶3、前列腺素E2等细胞因子的表达，由此认为组胺可加速骨关节炎的进程，是骨关节炎损伤因子之一。同时，研究观察组胺对软骨细胞增殖的影响时，发现组胺干预可以促进骨关节炎软骨细胞的增殖及丛集(骨关节炎典型病例改变之一)。由此可见，骨关节炎软骨细胞增殖是骨关节炎进程的重要表现，抑制其增殖可作为治疗骨关节炎的一个途径。

骨桥蛋白生物学功能广泛，可与骨组织矿化、肿瘤细胞转移、炎症及免疫反应等病理过程有关^[23-25]。骨桥蛋白广泛参与炎症反应，在骨关节炎中的表达也被大量文献证实，高曙光等^[26]发现骨桥蛋白在人膝骨关节炎软骨及滑夜组织中高表达，且表达程度与软骨蜕变程度成正相关，由此认为骨桥蛋白是骨关节炎发病的重要调节因子之一。另有学者同样发现发现骨关节炎患者血浆中骨桥蛋白以及凝血酶裂解后的骨桥蛋白-N表达显著升高，且与骨关节炎病程密切相关，而相较于全长骨桥蛋白，骨桥蛋白-N的生物活性更强，认为其可能是骨桥蛋白作用的主要表现^[27-28]。课题组前期研究骨桥蛋白对骨关节炎软骨细胞外基质稳态的调节作用发现骨桥蛋白可激活NF-κB通路，进而上调基质金属蛋白酶13、金属肽酶含血小板反应蛋白5的表达，从而加速细胞外基质主要构成成分(Ⅱ型胶原及前列环素)的水解，破坏细胞外基质的完整性，加速软骨组织的退变^[29-30]。然而，骨桥蛋白对于软骨细胞本身增殖或凋亡的影响，鲜有文献报道。由此，本研究建立骨关节炎软骨细胞系，对其分别予以空白对照、骨桥蛋白干预、骨桥蛋白shRNA慢病毒转染、Con-shRNA转染等处理，利用MTT及BrdU法检测骨关节炎软骨细胞的增殖能力变化，以此阐述骨桥蛋白对骨关节炎软骨细胞本身的调控作用，进一步丰富骨桥蛋白在骨关节炎病因中的可能机制，为骨桥蛋白靶向治疗骨关节炎提供一定的理论依据。

实验证实了骨桥蛋白shRNA慢病毒干扰可明显抑制骨桥蛋白基因及蛋白的表达，完成沉默效应。骨桥蛋白干预则具有加速骨关节炎软骨细胞增殖的能力，而骨桥蛋白被沉默后，软骨细胞生长则明显受限，由此得出骨桥蛋白促进骨关节炎软骨细胞生长，加速骨关节炎病程进展，在细胞功能学上验证了前期关于骨桥蛋白加速软骨退变的机制研究的可靠性。综上所述，研究初步探讨了骨桥蛋白、骨桥蛋白shRNA干预对骨关节炎软骨细胞生物学功能的影响，认为骨桥蛋白作为骨关节炎的重要调控因子之一。结合前期研究，分析骨桥蛋白在骨关节炎中可能是通过软骨细胞增殖及细胞外基质完整性两方面进行调控，这为骨桥蛋白靶向治疗骨关节炎提供了强有力的证据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

骨桥蛋白可促进骨关节炎软骨细胞增殖

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