细胞因子及细胞打印技术与骨骼肌损伤修复

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.20.020

摘要/Abstract

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文题释义：
细胞因子：在疾病的病理生理发展过程中起重要作用，所有细胞因子都直接或间接影响炎症反应，它们对血管内皮细胞、白细胞、单核-巨噬细胞等具有广泛的调节和效应，在诱导炎症反应中，具有多效、高效、协同、相互诱生和激发其他炎性介质级联反应的特征。
细胞打印技术：是一种在体外构造具有生物活性的三维多细胞体系的先进技术。细胞打印技术突破二维研究的局限性，在三维尺度上精确控制与人体组织或器官相似的三维构造体方面的研究提供了一种新的思路，其在组织器官构建和骨骼肌损伤修复中的应用备受关注。

摘要
背景：骨骼肌损伤后再生能力有限，细胞因子在骨骼肌修复过程中发挥重要作用，多种细胞和系列调控分子参与了骨骼肌损伤的修复。细胞打印技术是一种在体外构造具有生物活性的三维多细胞体系的先进技术，其在骨骼肌损伤修复中的作用受到广泛关注。
目的：探讨骨骼肌修复过程中促炎细胞因子和细胞生长因子的作用，并简述细胞打印技术在骨骼肌损伤中的优势和应用。
方法：通过计算机检索PubMed数据库和万方数据库2002至2015年有关细胞因子修复骨骼肌损伤，细胞打印技术在骨骼骨损伤中应用的相关报道。通过计算机检索到文献146篇，初筛标题和摘要，排除重复研究及不相关的内容，最终45篇文献进入综述分析，
结果与结论：①如肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6等促炎细胞因子，白细胞介素10、白细胞介素4等抗炎性细胞因子在骨骼肌损伤修复中起到重要作用；②胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子等细胞生长因子能有效促进成肌细胞的增殖及分化形成肌管，对骨骼肌卫星细胞具有良好的促进作用，细胞因子之间相互作用对可能取得骨骼肌修复有重要意义；③细胞打印技术能够快速、精确复制和重建缺损组织/器官的复杂结构，在包括毒理学研究、医疗测试和为基础科学研究提供试验平台等方面有着很重要的应用，细胞打印技术在骨骼肌损伤修复中的作用将是今后的研究重点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID: 0000-0002-2304-2647(王康康)

关键词: 组织构建, 组织工程, 细胞因子, 促炎性细胞因子, 生长因子, 骨骼肌损伤, 协同作用, 细胞打印

Abstract:

BACKGROUND: The regeneration ability of skeletal muscle is limited, and cytokines play an important role in skeletal muscle repair. A variety of cells and regulatory molecules are involved in skeletal muscle repair. Three-dimensional (3D) printing technique is an advanced technology used to construct an in vitro multicellular system with biological activity and has aroused widely attention in skeletal muscle repair.
OBJECTIVE: To investigate the role of proinflammatory cytokines and cell growth factors in skeletal muscle repair, and to summarize the advantages and application of 3D printing technology in skeletal muscle repair.
METHODS: A computer-based retrieval of PubMed and WanFang databases was conducted for the articles addressing the roles of cytokines and application of 3D printing technique in skeletal muscle injury published from 2002 to 2015. Totally 146 articles were searched firstly, and finally 45 eligible articles were enrolled in accordance with the inclusion and exclusion criteria.
RESULTS AND CONCLUSION: Proinflammatory cytokines, such as tumor necrosis factor-α, interleukin-1β, interleukin-6, and anti-inflammatory cytokines, such as interleukin-10, interleukin-4, play a critical role in skeletal muscle repair. Cell growth factors such as insulin-like growth factor, fibroblast growth factor, transforming growth factor can effectively promote the proliferation of myoblasts and cell differentiation into myotubes, further promoting the proliferation of skeleton satellite cells. Additionally, these cytokines act mutually, which is of great significance for skeletal muscle repair. 3D printing technology can quickly and accurately reproduce and reconstruct the complex structure of target tissues or organs, so it has been extensively applied in toxicology research, medical testing and basic experiments. The role of 3D printing technology in skeletal muscle repair will be a hotspot in the future.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Cytokines, Muscle, Skeletal, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

王康康. 细胞因子及细胞打印技术与骨骼肌损伤修复[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(20): 3241-3247.

Wang Kang-kang. Roles of cytokines and three-dimensional printing technology in skeletal muscle repair[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(20): 3241-3247.

图/表（结果） 1

2.1 促炎性细胞因子在骨骼肌损伤修复中的表达 见表1。

2.1.1 白细胞介素类 白细胞介素是一类能在细胞间传递信息、具有免疫调节和效应功能的蛋白质或小分子多肽。同种白细胞介素在不同损伤患者或同一患者不同阶段发挥的作用不同。所有细胞因子都直接或间接影响炎症反应，它们对血管内皮细胞、白细胞、单核-巨噬细胞等具有广泛的调节和效应，在诱导炎症反应中，具有多效、高效、协同、相互诱生和激发其他炎性介质级联反应的特征，对疾病具有双重作用。白细胞介素1是重要的炎性介质之一，也是一种热原质成分，具有致热和介导炎症的作用。它主要在细胞免疫激活中发挥调节作用^[11-13]。谭银玲等^[14]实验研究发现白细胞介素1可以刺激烧伤后大鼠骨骼肌中 26S蛋白酶复合体及 19S调节复合体的活性和蛋白表达水平明显升高。说明白细胞介素1对烧伤后大鼠骨骼肌中 26S蛋白酶复合体系统的激活具有重要作用，从而加强蛋白质的分解代谢，这可能与烧伤后平衡负氮的发生密切相关。白细胞介素1还是一种高度活性的细胞因子。王全震等^[15]研究发现靶肌肉局部注射白细胞介素1β能减轻失神经骨骼肌形态的改变，对失神经骨骼肌和运动终板具有保护作用，能在短时间内有效延缓失神经支配骨骼肌萎缩。

白细胞介素6以单体形式存在，是由不同种类细胞所分泌的一种多效性细胞因子，主要参与糖代谢和脂代谢，白细胞介素6发挥其生物学功能是通过结合白细胞介素6受体的双链系统来完成的。白细胞介素6受体基因的外显子和内含子中均存在单核苷酸多态性，白细胞介素6受体基因的单核苷酸多态性与2型糖尿病、肥胖、雄激素过多症和多囊卵巢综合征等代谢性疾病具有相关性。有关白细胞介素6在骨骼肌损伤中的作用研究显示骨骼肌损伤会产生大量的白细胞介素6，研究认为白细胞介素6可能与骨骼肌微损伤相关，白细胞介素6在骨骼肌中的出现不是偶然的，它能贯穿于肌肉损伤及修复的整个过程，特别是骨骼肌产生的白细胞介素6对于卫星细胞的增殖和融合具有重要作用。丹麦科学家曾认为骨骼肌损伤时血浆中的白细胞介素6增加^[16]。白细胞介素6主要功能为刺激细胞成长、促进细胞分化，对维持机体生理平衡具有重要作用。而在运动过程中，运动对白细胞介素6的生物学功能的影响也十分明显，主要表现在运动训练、运动强度、运动损伤时白细胞介素6的影响等。因此白细胞介素6与运动的关系成为当今运动科学研究的重点话题。陈俊飞^[17]的实验结果证实这一点，发现从事耐力性项目的运动员中白细胞介素6基因- 572C/G位点CC基因型女性人群有利于从事耐力性项目运动，白细胞介素6基因上rs1800796位点可作为耐力性项目运动员选材的候选分子遗传标记。王成艳等^[18]研究结果显示经高强度运动训练后，大鼠骨骼肌细胞及外周血白细胞介素6含量均有所升高，说明高强度运动训练可以诱导大鼠骨骼肌细胞及外周血中白细胞介素6的表达，发挥抗炎作用。

2.1.2 肿瘤坏死因子 肿瘤坏死因子是一种具有多种生物学效应的多功能细胞因子，其生物学效应包括促进细胞生长、分化、凋亡及验证诱发等。研究表明，单核巨噬细胞、淋巴细胞均能产生肿瘤坏死因子^[19-21]，根据其来源和结构分为2种，即肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β，而由自然杀伤细胞产生的肿瘤坏死因子定名为肿瘤坏死因子γ，三者的氨基酸组成及细胞来源有差别，但基因结构、染色体定位和生物活性极为相似。肿瘤坏死因子其生物学效应包括促进细胞生长、分化、凋亡及炎症诱发等。肿瘤坏死因子的生物学效应都是通过细胞表面的两种肿瘤坏死因子受体引发的。肿瘤坏死因子的信号传导通路主要包括细胞凋亡及转录因子核因子κB和JNK蛋白激酶的激活。这3条信号传导通路之间及各通路内部含有各种调节机制，使肿瘤坏死因子的各种生物学功能协调发挥出来^[22-24]。肿瘤坏死因子分子在细胞因子免疫调节网络中位于中枢环节，是重要的炎症介质，过量的肿瘤坏死因子导致炎症的发生。肿瘤坏死因子是机体炎症反应与免疫功能的重要调节因子，具有多种生物活性与临床意义，近年来有关肿瘤坏死因子的基因研究和临床应用日益受到重视。越来越多的的研究表明肿瘤坏死因子通过多种方式参与破骨细胞的分化及生物学活性的调控。郁永辉等^[25]研究发现肿瘤坏死因子α是骨骼肌高分解代谢的重要调控因子，骨骼肌细胞凋亡可能是骨骼肌蛋白高分解代谢的重要机制之一，而肿瘤坏死因子α又可诱导骨骼肌细胞凋亡。

2.2 细胞生长因子与骨骼肌损伤修复 由于骨骼肌损伤后的修复主要是通过肌卫星细胞的分裂增殖来实现的。骨骼肌卫星细胞平时处于静止状态，被激活后可增殖分化。骨骼肌卫星细胞的增殖与分化是由细胞连接、细胞与细胞外间质的相互作用及生长因子决定的。肌卫星细胞作为生肌干细胞，参与司控生后骨骼肌的生长、修复和维持等重要过程。肌卫星细胞作为生肌干细胞，参与司控生后骨骼肌的生长、修复和维持等重要过程。卫星细胞的活性受多种因素影响。生长因子被认为是一种潜在的成肌细胞分裂素，包括胰岛素样生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子、神经生长因子、血小板源生长因子、表皮生长因子等(图1)。这些细胞因子在骨骼肌损伤中所起作用比较重要的，其中胰岛素样生长因子最大限度的刺激星状细胞，在骨骼肌的生长中起关键作用。胰岛素样生长因子与胰岛素有明显的同源性，有两种类型，胰岛素样生长因子Ⅰ和胰岛素样生长因子Ⅱ。胰岛素样生长因子Ⅰ对血管内皮细胞有趋化作用，促进血管的形成^[26-27]。虽然许多组织都能表达胰岛素样生长因子，但它们各自的功能不同。骨骼肌是胰岛素样生长因子的靶器官，同时也分泌胰岛素样生长因子。骨骼肌组织表达的胰岛素样生长因子对骨骼肌损伤后的再生、修复非常重要，也是通过适当干预保持肌肉质量的重要调节因素，见表1。

2.2.1 胰岛素样生长因子Ⅰ 胰岛素样生长因子Ⅰ是胰岛素类激素家族中的成员之一，是一种在分子结构上与胰岛素类似的多肽蛋白物质。胰岛素样生长因子Ⅰ在人体及动物体内具有极其重要并且丰富的生物学功能，如促生长、促分化、参与糖代谢、蛋白质代谢和脂肪代谢等，并对消化系统、泌乳及生殖有一定的影响。胰岛素样生长因子Ⅰ基因包含6个外显子。长期以来人们普遍关注由外显子3和4编码的循环型胰岛素样生长因子Ⅰ在生长发育中的作用。最近对肌肉组织自分泌/旁分泌的局部型胰岛素样生长因子Ⅰ研究发现，选择性剪接产生的胰岛素样生长因子Ⅰ变体具有外显子5和6编码的延伸肽，并表现出特殊的生物学功能，如胰岛素样生长因子ⅠEa、胰岛素样生长因子ⅠEb及其E肽在骨骼肌组织中表现出促进生长和损伤修复的功能，这些特殊功能可能通过细胞表面的一种特殊E肽受体介导。这种多功能细胞调控因子，它的结构特征为其促生长和物质代谢功能提供依据。大量基础和临床研究证明，胰岛素样生长因子Ⅰ是骨形成和骨重建过程中的关键蛋白^[28-29]。同时也有相关研究已证明胰岛素样生长因子Ⅰ能够促进骨骼肌细胞的分裂和增殖，并可能成为治疗骨骼肌损伤的潜在药物，但局部直接注射胰岛素样生长因子Ⅰ效应往往短暂，给药困难等问题，效果并不理想。因此可以尝试基因治疗，也可以把康复训练和基因治疗结合在一起来探讨其对骨骼肌修复的影响^[30-31]。

2.2.2 碱性成纤维细胞生长因子 碱性成纤维细胞生长因子是成纤维细胞生长因子家族的成员之一，由于它能刺激3T3成纤维细胞分裂增殖而得名。碱性成纤维细胞生长因子是第一个被分离的血管形成促进因子，在体内分布极为广泛，脑、心、肝、骨、眼、肾上腺、胎盘等处均有存在。人碱性成纤维细胞生长因子的基因位于染色体4q26-27。由于碱性成纤维细胞生长因子mRNA翻译起始点和剪接点的不同，单拷贝的碱性成纤维细胞生长因子基因能够编码产生相对分子质量18 000- 34 000多种形式的碱性成纤维细胞生长因子^[32-34]。碱性成纤维细胞生长因子通过与细胞膜表面的特异性配体结合，进而引发细胞内的一系列级联反应，从而产生各种生物学效应。碱性成纤维细胞生长因子是细胞生长和分化的重要调节因子，张蔚然等^[35]结果显示添加了碱性成纤维细胞生长因子培养基的细胞生长状态较对照组良好，细胞增殖速度快，细胞增殖率显著高于对照组，说明碱性成纤维细胞生长因子对牛骨骼肌卫星细胞在生长培养基和分化培养基中增殖都具有良好的促进作用。向峥等^[36]研究碱性成纤维细胞生长因的mRNA在运动致骨骼肌损伤过程中不同阶段量的变化。结果表明，SD大鼠骨骼肌运动损伤过程中有内源性碱性成纤维细胞生长因子mRNA的表达。冯鑫等^[37]研究也证实外源性碱性成纤维生长因子可以降低损伤肌肉组织中波形蛋白的特异性表达，降低肌组织纤维化程度，从而促进肌肉损伤后结构及功能的修复。

2.2.3 转化生长因子β 促纤维化发展的转化生长因子β参与该了骨骼肌损伤的修复，转化生长因子β是作为组织损伤后促使其再生的一种蛋白，是一种内源性的生长因子，在肌肉损伤后通过重新编码肌肉细胞基因，抑制生肌细胞基因的表达。于新凯等^[38]通过观察大鼠骨骼肌损伤修复过程中转化生长因子β1基因的表达，研究转化生长因子β1在运动性骨骼肌损伤修复过程不同时刻的变化特征，结果说明运动性骨骼肌损伤修复过程中转化生长因子β1的表达受到抑制。且已发现转化生长因子β可以促进细胞外基质的形成，使多种胶原蛋白在损伤组织中沉积，导致瘢痕形成。转化生长因子β的生物学效应也受到其他生长因子的拮抗或协同作^[39-42]。实验研究发现骨骼肌急性钝挫伤后，转化生长因子β逐渐分泌表达，其表达时间有一定的规律性和相似性，若早期施加运动干预，会促进转化生长因子β的高表达^[43]，提示骨骼肌损伤后早期运动会使瘢痕增生相关细胞因子过度表达，导致瘢痕组织过度增生，影响骨骼肌愈合质量。神经生长因子促进中枢及外周神经系统神经元细胞存活、分化、轴突再生等重要作用已得到临床的广泛证实。研究表明损伤神经远端局部注射神经生长因子对于神经再生与再分布有一定促进作用，目前临床上主要以局部或肌肉注射神经生长因子蛋白的方式修复骨骼肌损伤。碱性成纤维细胞生长因子和神经生长因子可以促进成肌细胞的增殖和融合。

2.3 细胞打印技术构建骨骼肌损伤模型的优势 细胞打印技术是一种在体外构造具有生物活性的三维多细胞体系的先进技术。近年来，有关细胞打印技术的研究引起广泛的关注，其原因在于该领域具有明显的学科交叉与渗透融合的特点，它处于生命科学与快速成型技术、生物制造技术、生物科学和材料科学的交汇点。器官或组织的血管化结构要求细胞打印技术能够高精度、高通量、高速度地将细胞、生物材料定位到预设的结构中，这对多样化的细胞打印技术提出了挑战。相对于其他成型方法，细胞打印技术依靠计算机辅助成像，以广泛使用的生物材料为打印介质，能够快速、精确的复制和重建缺损组织/器官的复杂结构，因此在组织工程领域的应用获得广泛关注。

曹庆雷等^[44]采用文献资料法对现有急性骨骼肌损伤实验模型进行分析，认为目前使用的损伤模型存在一些不足，不能很好的满足实验研究的需要；细胞打印可常规应用于复杂的组织再生如骨、软骨、肌肉、血管和颅颌面复杂的神经和复杂的三维微结构复杂的器官如肝、淋巴器官。同样岳相辉等^[45]初步建立一个细胞打印系统，进行细胞无损伤打印的可行性探讨，实验证实细胞无损伤打印是可行的，为进一步的组织、器官打印研究提供依据。近年来，随着细胞打印技术的不断发展与成熟，其在医学领域的应用大有增长的趋势，国内外不少专家、学者正在进行大量尝试，试图充分应用该技术服务人类的医疗行业。目前可用作医疗领域的细胞打印技术有熔融层积成型、立体平版印刷、选区激光烧结等。细胞打印的产品大小与结构符合人体正常结构的解剖模型，为医生制定疑难病例的手术术前计划提供了有力的帮助，手术操作步骤的减少和手术准确度的提高在精致的导板工具中得到了益处。然而该技术仍有很多问题需要解决，比如原材料的问题、不同细胞打印技术的不足问题及细胞打印机器的改进问题等。

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引言

骨骼肌损伤是一种高频度的运动损伤，比较常见的有撕裂性、顿挫性、牵拉性等多是由周期性耐力运动项目所致。研究发现骨骼肌损伤是肌细胞的微细损伤，其超微结构在损伤后有明显的变化。由于骨骼肌愈合的时间比较长，反复再次损伤的可能性比较大，如何快速有效地修复骨骼肌损伤，并提高伤后的愈合质量是目前的一个研究重点。骨骼肌损伤愈合过程包括炎症、增殖和修复。近年来，关于细胞因子在骨骼肌损伤修复的影响因素越来越受到重视，根据不同细胞因子在软组织损伤发生发展中所起到的不同作用，根据细胞因子的种类与功能可大致分为促炎性细胞因子、抗炎性细胞因子、生长因子等，促炎性细胞因子主要有肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、白细胞介素2、白细胞介素6、白细胞介素17及白细胞介素23等，抗炎性细胞因子主要包括白细胞介素4、白细胞介素10、白细胞介素13、转化生长因子β等^[1-4]。

白细胞介素是一类由多种细胞产生，具有调节细胞活性、参与机体炎性反应的相对分子质量低的蛋白质。白细胞介素家族成员众多，其中主要以抗炎症方式起作用的白介素类细胞因子主要有白细胞介素10。白细胞介素10是抗炎因子，可抑制激活的中性粒细胞参与的炎性反应，具有一定的免疫调节作用。这些因子的表达直接或间接的对骨骼肌损伤愈合起着重要的作用，其中以白细胞介素1和肿瘤坏死因子等与炎症关系最为密切。干扰素是一种体内重要的多效能细胞因子，能够通过调控免疫相关基因的转录协调机体的免疫反应^[5-6]。干扰素是一类重要的细胞功能调节物质，它不仅有广谱的抗病毒活性，而且还有明显的抗肿瘤能力。肿瘤坏死因子、干扰素、顺铂和表阿霉素联合应用，在低浓度时对正常骨骼肌细胞的生长具有促进、增殖作用，高浓度时可抑制正常骨骼肌细胞的生长作用^[7]。

细胞生长因子包括有胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、转化生长因子以及血管内皮细胞生长因子等，细胞因子的动态变化决定炎症的发展及结局。细胞生长因子是与细胞膜受体相结合的小骨骼肌在人体内分布广泛，胰岛素样生长因子从发现到现在已经有40多年了，其中的胰岛素样生长因子Ⅰ最早曾被称为硫化因子，后来又称之为生长介素。已知的胰岛素样生长因子Ⅰ是人体内肝细胞、肾细胞、脾细胞等十几种细胞自分泌和旁分泌的产物。胰岛素样生长因子Ⅰ是一种多功能肽，可以调节细胞生长、细胞分化以及细胞外基质中多种蛋白表达。已有的研究表明，胰岛素样生长因子对细胞的增值和分化及蛋白质的合成等均有促进作用，从而有助于骨骼肌损伤后的修复与再生^[8-10]。

细胞打印是一层层堆叠，但它用的材料是含有细胞的胶体及可生物降解的塑料一样的材料。然后打印出的整个结构会被加上一层临时的聚合物外壳，确保移植中结构的稳定。打印过程也经过精心调整，保证细胞能活到手术时刻。一旦移植完成，塑料材料会逐渐降解。同时，细胞会分泌出一种支持性的基质，维护植入物的形状，最终，细胞会自行重组，不再需要支持性材料。因此，细胞打印相关的研究带来的前景确实很诱人，比如可以更方便地测试器官对药物的反应，复制患者缺失的组织等，因此细胞打印技术在骨骼肌损伤修复中的应用备受关注。文章将对骨骼肌损伤愈合过程中各种促炎性细胞因子和细胞生长因子对肌卫星细胞增殖、迁移的作用及利用细胞打印技术构建骨骼肌损伤的优势做一初步探讨。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

讨论

骨骼肌是人体内最大的器官，运动引起的骨骼肌超微结构损伤在运动损伤中较常见，尤其是在高水平竞技运动员运动后损伤尤为严重。骨骼肌损伤修复是细胞和分子水平上复合性、程序化过程。骨骼肌损伤修复过程中促进许多细胞因子的释放，这些细胞因子之间的相互协同作用在骨骼肌损伤修复中的作用越来越受到重视。促炎细胞因子如白细胞介素1、白细胞介素6等白细胞介素家族细胞因子在骨骼肌损伤修复中起到重要作用。还有肿瘤坏死因子α在诱导诱导骨骼肌细胞凋亡，调节机体炎症反应与免疫功能中重要意义。细胞生长因子如胰岛素样生长因子Ⅰ是骨形成和骨重建过程中的关键蛋白，能有效促进成肌细胞的增殖及分化形成肌管，碱性成纤维细胞生长因子对骨骼肌卫星细胞具有良好的促进作用，对骨骼肌损伤后的再生、修复非常重要。转化生长因子β可以促进细胞外基质及胶原形成，细胞因子之间相互作用对可能取得骨骼肌修复有重要意义。细胞因子在调控骨骼肌再生和纤维化之间的平衡发挥重要作用，近年来，大量研究已经证实，许多细胞因子作为药物可以加速组织的修复和逆转不良修复状态愈合，更加值得关注的是细胞打印技术为组织工程学突破二维研究的局限性，在三维尺度上精确控制与人体组织或器官相似的三维构造体方面的研究提供了一种新的思路。因此有关多种生长因子在促进损伤修复中可能的协同作用机制、细胞因子微环境的调节以及细胞打印技术在骨骼肌损伤的作用等将是今后骨骼肌损伤的研究重点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程