音猬因子修饰纳米晶胶原基骨复合骨髓间充质干细胞修复股骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.14.008

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
音猬因子：作为一种Hedgehog信号蛋白，具有促使骨组织发育、生长及重构等生理功能。
纳米晶胶原基骨支架：具有优秀的生物融合性及分解性，能有效传导骨组织，并由纳米级晶体组成；其无机物分子和胶原结合构成和天然骨相似，并具有类天然三维孔洞松质骨网，且单孔大小约100 μm，便于有机营养物的传输。

背景：音猬因子作为一种Hedgehog信号蛋白，具有促使骨组织发育、生长及重构等生理功能。
目的：观察音猬因子修饰的纳米晶胶原基骨复合骨髓间质干细胞修复大鼠股骨缺损的效果。
方法：将48只SD大鼠随机分为4组，均建立股骨缺损模型，造模成功后14 d，实验组于骨缺损处植入音猬因子修饰的纳米晶胶原基骨-骨髓间充质干细胞复合物，支架组于骨缺损处植入纳米晶胶原基骨，细胞支架组植入纳米晶胶原基骨-骨髓间充质干细胞复合物，空白对照组不植入任何材料。修复后3，6，9，12周，进行骨缺损区X射线检查、骨密度及骨组织病理切片观察。
结果与结论：①X射线检查：实验组修复后不同时间点的Lane-Sandhu X射线评分、骨密度值均高于其余3组(P < 0.05)；②苏木精-伊红染色：修复后12周，支架组有少量骨组织形成，无骨髓形成；细胞支架组有少量骨组织形成，无骨髓形成，可见残留支架；实验组植入物完全吸收，成熟骨组织和髓腔形成，腔内有骨髓形成；③扫描电镜观察：修复后12周，支架组有不规则排列的骨纤维和大量骨陷下窝；细胞支架组可见大量成骨细胞，但骨纤维仍然不规则；实验组有大量排列规则的骨小梁，可见哈佛系统；④结果表明：音猬因子修饰的纳米晶胶原基骨复合骨髓间质干细胞可促进骨缺损的修复。

ORCID: 0000-0001-8363-2908(唐宇星)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 纳米晶胶原基骨, 骨缺损模型, 骨髓间充质干细胞, 音猬因子, 股骨

Abstract:

BACKGROUND: SSh as a Hedgehog signal protein can promote bone development, growth and remodeling.
OBJECTIVE: To investigate the effect of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) combined with Shh modified nano-hydroxyapatite/collagen (nHAC) in the repair of femoral defects in rats.
METHODS: Forty-eight Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups, and the model of femoral defects was established in these rats. At 14 days after modeling, experimental group was implanted with the BMSCs/Shh modified nHAC, scaffold group was implanted with simple nHAC, cell scaffold group was implanted with BMSCs/nHAC, and blank control group was without any implantation. At 3, 6, 9, 12 weeks after repair, X-ray examination, bone density measurement and bone biopsy in bone defect area were performed.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) X-ray examination: The Lane-Sandhu X-ray score and bone mineral density value in the experimental group at different time points after operation were significantly higher than those in the other three groups (P < 0.05). (2) Hematoxylin-eosin staining: 12 weeks after repair, a small amount of bone tissues but no bone marrow formed in the scaffold group; a small amount of bone tissues with absence of bone marrow formed in the cell scaffold group, and the residual scaffold was visible; in the experimental group, the scaffold was completely absorbed, and mature bone and medullary cavity formed with presence of bone marrow. (3) Scanning electron microscope observation: 12 weeks after repair, irregular arrangement of bone fibers and a large number of bone fossae were observed in the scaffold group; the cell scaffold group showed a large number of osteoblasts, but bone fibers still arranged irregularly; in the presence of the Haversian system, a large number of regularly arranged bone trabeculae were detective in the experimental group. These results elucidate that the Shh modified nHAC/BMSCs complex can promote the repair of bone defects.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Bone Transplantation, Stem Cells, Femur, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

唐宇星，赵庆，杨中萌，叶永恒，胡仁安. 音猬因子修饰纳米晶胶原基骨复合骨髓间充质干细胞修复股骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(14): 2180-2185.

Tang Yu-xing, Zhao Qing, Yang Zhong-meng, Ye Yong-heng, Hu Ren-an . Effect of bone marrow mesenchymal stem cells combined with Shh modified nano-hydroxyapatite/collagen for femoral defect repair[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(14): 2180-2185.

图/表（结果） 6

2.1 各组大鼠一般情况和大体标本检查结果各组大鼠均在术后3 h后清醒，正常进食，活动欠佳，伤口无炎症反应和感染，1周后伤口愈合，肿胀消失，均未见移植物排除。

修复后3周，支架组、细胞支架组、实验组移植物和缺损处界限清楚；修复后6周，各组移植物和缺损处界限模糊，支架组有少量骨组织形成，细胞支架组和实验组骨痂明显增多；修复后9周，支架组支架降解，细胞支架组、实验组有骨髓腔形成；修复后12周，支架组有少数假关节形成(图1A)，细胞支架组无假关节异常活动(图1B)，实验组全部愈合，移植物和大鼠骨完全融合(图1C)。空白对照组修复后3，6，9周均出现骨缺损部位由纤维组织填充形成股不连并与骨硬化现象。

2.2 各组骨缺损区X射线评分比较支架组和实验组修复后各时间点的X射线评分均高于支架组和空白对照组(P < 0.05)，实验组修复后各时间点的X射线评分均高于支架组(P < 0.05)，见表1。

修复后3周，支架组、细胞支架组、实验组均出现骨缺损处边界模糊；修复后6周，支架组依然见骨缺损处边界模糊，细胞支架组见云雾状的新生骨痴，实验组缺损区明显可见新生骨痴；修复后9周，支架组出现少量云雾状新生骨痴，细胞支架组见骨痴增多，实验组整个缺损区均可见新生骨痴并形成桥接；修复后12周，支架组骨痴增多并有骨质硬化，细胞支架组缺损区可见大量骨痴，实验组整个缺损区见大量新生骨组织填充，见图2。

2.3 各组大鼠修复后不同时间点骨密度测定值的比较细胞支架组和实验组修复后各时间点的骨密度测定值均高于支架组和空白对照组(P < 0.05)；实验组修复后各时间点的骨密度测定值均高于细胞支架组(P <0.05)，见表2。

2.4 各组骨组织苏木精-伊红染色结果支架组可见少量骨组织形成，但无骨髓形成；细胞支架组可见少量骨组织形成，但无骨髓形成，仍然可见残留支架；实验组可见植入物完全吸收，成熟骨组织和髓腔形成，腔内有骨髓形成，见图3。

2.5 各组骨组织电镜扫描观察结果支架组可见不规则排列的骨纤维和大量骨陷下窝；细胞支架组可见大量成骨细胞，但骨纤维仍然不规则；实验组可见大量排列规则的骨小梁，可见哈佛系统，见图4。

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引言

材料方法

1.1 设计前瞻性动物对比观察实验。

1.2 时间及地点实验于2015年3至9月在中山大学动物实验中心完成。

1.3 材料

实验动物：6周龄健康SPF级雌性SD大鼠50只，由中山大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(粤) 2009-0049，体质量145-160 g，取48只建立骨缺损模型，造模后随机分为4组，每组12只：空白对照组不移植任何材料；支架组单纯移植nHAC；细胞支架组移植骨髓间充质干细胞复合nHAC；实验组移植骨髓间充质干细胞复合音猬因子修饰的nHAC；另2只用于骨髓间充质干细胞的分离培养。

主要支架、试剂及仪器：音猬因子(PeproTech公司)；nHAC(中山大学材料系提供)；戊巴比妥纳(国药准字H31021724，上海新亚药业有限公司)；胎牛血清(郑州九龙生物制品有限公司)；L-DMEM培养液(上海慧颖生物科技有限公司)；倒置显微镜(奥影精密仪器(上海)有限公司)；法国 MEDILINK 骨密度仪(北京谷山丰生物医学技术有限公司)；苏木精-伊红染色试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司)；MultiSEM 506扫描电子显微镜观察(德国卡尔蔡森公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的分离培养颈椎脱臼处死2只SD大鼠，无菌条件获得其股骨，用含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM培养液冲洗骨髓腔直至获得骨髓，将其置入淋巴细胞分离液中，吸取分离得到白雾状有核细胞层滴入干净试管内，PBS洗涤3次，5 min/次，3 200 r/min离心 5 min，弃上清液，滴入含体积分数10%胎牛血清培养液后，调整细胞浓度为2×10⁹ L^-1，后将接种于明胶处理后培养瓶内，放入25 ℃、体积分数5%CO₂培养箱孵3 d，取出更换培养液，清除不贴壁细胞，3 d换1次液，倒置显微镜观察细胞贴壁和生长情况，待细胞长覆盖整个瓶底85%-95%后，滴入2.0 g/L胰蛋白酶反应，50%传代培养，获取胰蛋白酶反应生长良好骨髓间充质干细胞进行分离培养，获得第3代细胞，以1×10¹⁰ L^-1的细胞浓度接种于培养皿内，待其融合85%，滴入含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM诱导、丢弃，滴入诱导液备用。

1.4.2 音猬因子修饰的nHAC复合骨髓间质干细胞复合物的制备将nHAC材料修剪成10 mm×10 mm×10 mm小块，置于含音猬因子的L-DMEM培养液内4 ℃修饰培养 24 h；吸取25%胰酶消化液诱导得到的100 μL骨髓间充质干细胞悬液(细胞浓度为2×10⁶ L^-1)滴入nHAC材料表面，再滴入含音猬因子的L-DMEM培养液，后置于37 ℃、体积分数5%CO₂、100%饱和湿度下静置2.0-3.0 h后，滴入25%胰酶消化液5 μL，置于常温培养3 d备用。同理制备骨髓间充质干细胞复合nHAC材料。

1.4.3 模型制作及分组干预

模型制作：将48只大鼠称体质量后，腹腔注射0.3%戊巴比妥纳30 mg/kg麻醉，取俯卧位，术野处清除毛发裸露表皮消毒，于一侧下肢后外侧取5 cm切口暴露股骨，手术剪断、取出股骨中段骨形成骨缺损，缝合切口，术后精细喂养，肌注青霉素8×10⁴ U/d，连注3 d，均无内外固定。建模后14 d，X射线检查若股骨有明显缺损，大鼠生长良好，则表明建模成功^[6]。

分组干预：建模后14 d，X射线检查表明建模成功后，按照建模相同方式麻醉、手术入路，实验组于股骨缺损处植入修剪后符合缺损大小的音猬因子修饰的nHAC复合骨髓间质干细胞复合物，空白对照组大鼠不移植任何材料，支架组植入nHAC，细胞支架组大鼠移植骨髓间充质干细胞复合nHAC材料，逐层缝合切口，送回笼内精心喂养，肌注青霉素5×10⁴ U/d，连注7 d，大鼠均无内外固定。

1.5 主要观察指标

骨缺损区X射线评分：修复后3，6，9，12周，X射线检查股骨正位片，观察骨缺损，按照Lane-Sandhu法对X射线摄片作放射学评估，并做多因素方程评估。

骨密度检测：修复后3，6，9，12周，选择法国 MEDILINK骨密度仪测量骨相同位置及面积大小缺损区的骨密度。

大体观察：术后观察各组大鼠进食、活动及手术切口愈合等情况，并做记录。修复后3，6，9，12周，各组随机处死大鼠3只，取术侧股骨标本，进行编号清除其附着软组织，观察骨缺损修复、确定有无新骨生成、生长程度和新骨与断端连接程度、塑形状态。

骨组织苏木精-伊红染色：修复后12周，取术侧股骨切片，2 mm厚，体积分数10%甲醛固定，常规脱钙、水洗、梯度乙醇脱水、透明及包蜡，切片机连续切片，2 μm/片，苏木精-伊红染色，显微镜观察染色骨组织形态及结构。

骨组织电镜扫描：修复后12周，取术侧骨骼标本，PBS冲洗、超声震荡及双蒸水清洗，滴入多聚甲醛与戊二醛溶液固定(前者和后者比例为10∶1)，双蒸水洗5 min，室内环境晾干，选择MultiSEM 506扫描电子显微镜观察。

1.6 统计学分析数据分析用SPSS 16.0软件，正态数据用x(_)±s表示，用重复测量方差分析进行多组比较，并用SNK-q法进行组间比较，P < 0.05表示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

随着生物材料的发展，人工合成骨被应用于股骨或其他骨骼缺损修复中^[7]，其可通过人工手段合成，来源广泛^[8]，

其材料生物学特性较优，能够和受体骨骼有效融合^[9]，但人工复合骨无法形成骨细胞及促骨生成因子，只具有骨传导性，不存在骨诱导性，因此其成骨能力较弱，因此笔者认为有必须选择相关促骨生成细胞及因子结合人工复合骨对股骨缺损进行综合治疗。随着组织工程技术的发展，可采取组织工程骨修复骨缺损，其治疗原理基于采取生物性优秀材料制作具有三维空间支架^[10]，将具有促骨生成的细胞及因子植入其中使其具有生理功能，从而修复及代替损伤或病变骨骼。组织工程骨包括骨生成种子细胞、支架制作材料及促骨细胞生成因子。

通过参阅资料可知，理想骨生成种子细胞具有特点包括^[11]：①结构简单且属于未分化的原始细胞；②来源广泛且获取后不会对供体机体造成损伤；②体外分离、培养和扩增容易；④诱导下分化为成骨细胞，且稳定性较优，并可连续传代、植入缺损处成骨效果明显；⑤诱导生成的骨组织和受体骨组织无需配型，而彼此间无免疫排斥性。基于以上特点，笔者选择骨髓间充质干细胞作为实验骨生成种子细胞，这是因为该细胞可从脂肪、肌肉及外周血中获取，来源广泛，并具有干细胞特性，便于进行分离培养及传代扩增，不会引起免疫排斥反应。在实验中笔者从大鼠骨髓组织获取骨髓间充质干细胞，因骨髓中其数量较多，取材简单，对机体损伤程度低。

支架制作材料主要指的是能和骨缺损受体组织进行有效融合的植入骨支架材料，其是人工合成骨的最基本结构，应具有促使细胞代谢、增殖及分化等生物学特性^[12]。笔者将其作为实验研究的重点，选取nHAC作为复合骨支架制作材料，这是因为该材料属于仿生人工骨材料，有优秀的生物融合性及分解性，能有效传导骨组织，并由纳米级晶体组成；其无机物分子和胶原结合构成和天然骨相似，并具有类天然三维孔洞松质骨网，且单孔大小约100 μm，便于有机营养物的传输。

促骨细胞生成因子的主要功能是刺激骨细胞增殖、分化，加快新骨生成及生长，而在人工复合骨中其能够促进植骨和受体骨组织快速融合，修复骨组织缺损。笔者在实验中选择音猬因子，这是因为其属于信号蛋白家族成员，能够促使各器官及组织发育；其信号途径在机体发育及生长过程处于高度保守状态，并由音猬因子和2个跨膜受体复合组成^[13-29]，可刺激蛋白酶A活性上升及激活下游Gli系蛋白分子转录。音猬因子信号传导时，其能和Ptc跨膜受体结合，促使Smo跨膜受体进入骨细胞或其他组织细胞，激活其增殖机制，调控骨髓间充质干细胞等细胞增殖，并以上皮信号形式调控骨细胞生长、分化。

在实验中，笔者为了进一步增强nHAC复合骨的生物相容性，选择骨髓间充质干细胞复合音猬因子对nHAC进行修饰，在植入到股骨缺损大鼠的患骨处，实验结果显示，实验组全部愈合，移植物和大鼠骨完全融合；空白对照组术后骨缺损部位由纤维组织填充形成股不连并与骨硬化现象，这证明是nHAC适宜的骨填充材料，而骨髓间充质干细胞复合音猬因子对骨再生具有显著促进作用，三者结合可加快骨缺损的愈合。研究中，细胞支架组和实验组在术后各时间点的X射线评分、骨密度测定值均高于支架组和空白对照组(P <0.05)，这表明骨髓间充质干细胞复合nHAC和骨髓间充质干细胞/音猬因子修饰的nHAC复合物不仅可显著促进骨缺损愈合速度，且骨愈合效果良好，提高了骨再生的质量和速率。通过苏木精-伊红染色，笔者也发现实验组大鼠术后植入骨和其正常骨组织融合优秀，形成成熟骨组织，且腔内有骨髓；而电镜扫描结果显示大量排列规则的骨小梁。这些结果均证明骨髓间充质干细胞复合音猬因子修饰后nHAC人工植入骨对大鼠股骨缺损修复效果最佳，证实骨髓间充质干细胞和音猬因子分别作为优秀的骨生成种子细胞和促骨细胞生成因子，能够有效弥补传统人工复合材料缺乏骨诱导性的缺点，使得人工植入骨可以和天然骨进行完美融合且无排斥反应。

经过研究，笔者及其研究团队还认为骨髓间充质干细胞分离对于整个实验成功具有关键性作用，实验选择全骨髓法对所用细胞进行培养，其能够有效保存骨髓间充质干细胞增殖及生长必需的骨髓黏附分子及相关促生长因子，结果显示获得第3代细胞可对nHAC进行理想修饰。研究中细胞支架组大鼠骨缺损修复效果优秀，仅次于实验组大鼠，也证明笔者团队培养的骨髓间充质干细胞符合实验要求。

综上所述，骨髓间充质干细胞复合音猬因子修饰的nHAC修复大鼠股骨缺损效果优秀，值得下一步进行临床实验，但此次研究未对其他如骨形态生成蛋白2的修饰nHAC的效果进行研究，存在不足，应完善。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程