骨髓间充质干细胞复合Bio-oss修复兔颅骨缺损的组织学变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.13.012

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (13): 2036-2042.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.13.012

• 干细胞移植 stem cell transplantation • 上一篇下一篇

骨髓间充质干细胞复合Bio-oss修复兔颅骨缺损的组织学变化

邵艳琳^1，2，罗世君³，孙嵩²，孙勇^1，2，钟科^1，2，陈红亮²

¹西南医科大学口腔医学院，四川省泸州市 646000；²解放军成都军区机关医院口腔科，四川省成都市 610031；³西南医科大学附属口腔医院口腔颌面外科，四川省泸州市 646000

修回日期:2017-03-21 出版日期:2017-05-08 发布日期:2017-06-09
通讯作者: 孙勇，教授，主任医师，硕士生导师，解放军成都军区机关医院口腔科，四川省成都市 610031
作者简介:邵艳琳，女，1989年生，四川省资阳市人，汉族，西南医科大学在读硕士，医师，主要从事口腔种植义齿修复的研究。
基金资助:
解放军成都军区“十二五”面上项目(C14050)

Histological changes of bone marrow mesenchymal stem cells combined with Bio-oss in repairing rabbit skull defects

Shao Yan-lin^{1, 2}, Luo Shi-jun³, Sun Song², Sun Yong^{1, 2}, Zhong Ke^{1, 2}, Chen Hong-liang²

¹School of Stomatology, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; ²Department of Stomatology, the Authority Hospital of Chengdu Military Region of PLA, Chengdu 610031, Sichuan Province, China; ³Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Hospital of Stomatology, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China

Revised:2017-03-21 Online:2017-05-08 Published:2017-06-09
Contact: Sun Yong, Professor, Chief physician, Master’s supervisor, School of Stomatology, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; Department of Stomatology, the Authority Hospital of Chengdu Military Region of PLA, Chengdu 610031, Sichuan Province, China
About author:Shao Yan-lin, Studying for master’s degree, Physician, School of Stomatology, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; Department of Stomatology, the Authority Hospital of Chengdu Military Region of PLA, Chengdu 610031, Sichuan Province, China
Supported by:
the “Twelfth Five-Year” Projects of Chengdu Military Region, No. C14050

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
骨髓间充质干细胞：是存在于骨髓中具有高度自我更新能力和多向分化潜能的非造血干细胞且可在特定的环境中定向分化为成骨细胞、血管内皮细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞等，是目前组织工程中最常用的种子细胞之一。
Bio-oss人工骨：是一种从牛骨中提取，经过特殊加工处理，除去蛋白和其他有机成分，高纯度并且保持多孔天然骨无机结构，同人体骨的结构几乎相同的生物移植材料。实验及临床研究证实，Bio-oss具有非常好的生物相容性，能满足骨引导材料的标准。Bio-oss植入体内可以降解吸收并逐渐被新生骨取代。

摘要
背景：目前有一些关于骨髓间充质干细胞复合异体骨、人工合成骨替代材料促进骨缺损修复的研究，但尚未见骨髓间充质干细胞复合Bio-oss用于兔颅骨缺损修复的报道。
目的：观察骨髓间充质干细胞复合Bio-oss修复兔颅骨缺损的效果。
方法：分离培养雄性兔骨髓间充质干细胞，将其作为种子细胞，在雌兔颅骨采用外直径6 mm的环形骨钻制造全层骨缺损3个。将96只雌性兔随机等分为4组，复合物组植入Bio-oss复合骨髓间充质干细胞，Bio-oss组单纯植入Bio-oss，骨髓间充质干细胞组单纯植入骨髓间充质干细胞，空白组不进行植入修复。每个组表面均覆盖引导组织再生膜。
结果与结论：复合物组成骨效果比其他3组更佳，Bio-oss组成骨效果比骨髓间充质干细胞组和空白组更好，骨髓间充质干细胞组与空白组成骨效果接近。说明以骨髓间充质干细胞作为种子细胞，Bio-oss作为支架材料复合植入兔颅骨缺损区有明显的促进成骨作用，为临床治疗骨缺损提供新思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-9902-359X(孙勇)

关键词: 干细胞, 移植, 骨组织工程, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, 颅骨缺损, Bio-oss, 动物模型, 组织学

Abstract:

BACKGROUND: Some studies have focused on bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) combined with allograft bone or artificial bone substitute materials for bone defect repair. But there is no report on BMSCs combined with Bio-oss for repair of rabbit skull defects as yet.
OBJECTIVE: To observe the effect of BMSCs combined with Bio-oss in repairing skull defects in rabbits.
METHODS: BMSCs from male rabbits were isolated, cultured, and used as seed cells. In the skull of the female rabbits, three full-thickness bone defects with the same external diameter of 6 mm were made by a ring bone drill. Ninety-six female rabbits were randomly divided into four groups, and given Bio-oss/BMSCs in combination group, Bio-oss alone in Bio-oss group, BMSCs implantation in BMSCs group, and no intervention in blank group. All the implant surfaces were covered with guided tissue regeneration membrane.
RESULTS AND CONCLUSION: The osteogenic effect in the combination group was better than that in the other three groups, and the Bio-oss group showed better osteogenesis in comparison with BMSCs and blank groups. But there was no significant difference between the BMSCs and blank groups. These findings indicate that the combined use of BMSCs as seed cells and Bio-oss as a scaffold material exerts overt osteogenic effects in rabbit skull defect area, which provides a new idea for the clinical treatment of bone defects.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Tissue Engineering, Models, Animal

中图分类号:

R394.2

邵艳琳，罗世君，孙嵩，孙勇，钟科，陈红亮. 骨髓间充质干细胞复合Bio-oss修复兔颅骨缺损的组织学变化[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(13): 2036-2042.

Shao Yan-lin, Luo Shi-jun, Sun Song, Sun Yong, Zhong Ke, Chen Hong-liang. Histological changes of bone marrow mesenchymal stem cells combined with Bio-oss in repairing rabbit skull defects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(13): 2036-2042.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 纳入的96只日本大耳兔均进入结果分析，无脱失。

2.2 大体观察结果 造模后2周，复合物组和Bio-oss组可见Bio-oss颗粒明显，质地中等，表面呈粗糙颗粒状，与自体骨界限清晰。骨髓间充质干细胞组和空白组骨缺损边缘见少量新生组织，表面光滑的，质地软，边界较清晰(图2)。

造模后4周，复合物组和Bio-oss组可见Bio-oss颗粒，与2周时相比新生组织增多，质地中等，与周围边界清晰，表面颗粒状，材料表面可见纤维组织贴附生长。骨髓间充质干细胞组和空白组新生组织面积比2周大，表面光滑，向中央呈圈状融合生长，质地较软，周界较清晰(图2)。

造模后8周，复合物组和Bio-oss组Bio-oss颗粒部分降解，与自体骨边界不清晰，表面较光滑，质地较硬，骨髓间充质干细胞组边缘新生组织向中央呈圈状融合生长，面积与4周时相比增大，中央有少量缺损，新生组织表面光滑稍凹陷，质稍硬，边界不清，空白组缺损由新生组织填充，无明显缺损，质地稍硬，与自体骨边界不清，表面光滑稍凹陷(图2)。

造模后12周，复合物组和Bio-oss组Bio-oss颗粒进一步降解，与8周时相比颗粒更少，质地硬，边界不清，表面较光滑，有结缔组织长入。骨髓间充质干细胞组和空白组无组织缺损，新生组织质地中等，骨髓间充质干细胞组和空白组相比，骨髓间充质干细胞组表面光滑稍凹陷，质稍硬，边界不清(图2)。

引导组织再生膜均无明显移位，2周时引导组织再生膜完整，4周时明显比2周薄，8周时降解明显，仅存留小部分，12周时膜基本完全降解。

2.3 组织学观察结果 造模后2周，复合物组和Bio-oss组骨缺损部位区可见大量Bio-oss颗粒，周围炎性细胞浸润，胶原纤维增生，排列紊乱；骨髓间充质干细胞组和空白组炎性细胞浸润，毛细血管丰富，胶原纤维大量增生(图3)。造模后4周，复合物组和Bio-oss组术区可见部分Bio-oss颗粒被纤维结缔组织分割，Bio-oss边缘见多核细胞和成骨细胞黏附，类骨质生成，少量新生血管，血管直径约为25 μm^[22]，没有成熟骨小梁和矿化骨生成；骨髓间充质干细胞组和空白组见少量新生血管、类骨质和胶原纤维(图3)。造模后8周，复合物组和Bio-oss组Bio-oss颗粒进一步降解，可见增生活跃的成骨细胞，新生骨逐渐成熟、矿化但排列紊乱，新生血管较多，能见骨化中心，有很细小的骨小梁生成；骨髓间充质干细胞组和空白组出现少量成熟骨，多数仍为不成熟骨，有细小骨小梁生成(图3)。造模后12周，复合物组和Bio-oss组Bio-oss颗粒被更多的胶原或骨组织替代，骨小梁生成更多且逐渐加粗，骨质更成熟，较多新生血管，骨化中心增多；骨髓间充质干细胞组和空白组骨小梁增粗增多，类骨质增多，骨化中心开始形成(图3)。造模后2周，4组新生骨面积接近；造模后4周，复合物组和Bio-oss组新生骨面积显著优于骨髓间充质干细胞组和空白组(P < 0.05)；造模后8周，复合物组新生骨面积显著优于骨髓间充质干细胞组和空白组(P < 0.05)；造模后12周，复合物组新生骨面积显著优于其他3组(P < 0.05；表1)。复合物组中造模后4，8，12周时的新生骨面积均显著优于2周(P < 0.05)，且8，12周时的新生骨面积显著多于4周(P < 0.05)；Bio-oss组中造模后4，8，12周时的新生骨面积显著优于2周(P < 0.01)；骨髓间充质干细胞组和空白组中造模后8和12周时的新生骨面积显著优于2和4周(P < 0.01；表1)。

参考文献

[1] Lambrecht JT.口腔外科与种植外科[M].胡开进,译.北京:人民军医出版社,2014.

[2] Moroni L, Schotel R, Sohier J, et al. Polymer hollow fiber three-dimensional matrices with controllable cavity and shell thickness. Biomaterials. 2006;27(35):5918-5926.

[3] Liu X, Liao X, Luo E, et al. Mesenchymal stem cells systemically injected into femoral marrow of dogs home to mandibular defects to enhance new bone formation. Tissue Eng Part A. 2014;20(3-4):883-892.

[4] Henkel J, Woodruff MA, Epari DR, et al. Bone Regeneration Based on Tissue Engineering Conceptions - A 21st Century Perspective. Bone Res. 2013;1(3):216-248.

[5] 张俊标,何志旭,叶川,等.3-羟基丁酸-4-羟基丁酸共聚酯负载人骨髓间充质干细胞在骨组织工程中的应用[J].中国组织工程研究,2016,20(21):3057-3064.

[6] Jayasuriya AC, Shah C, Ebraheim NA, et al. Acceleration of biomimetic mineralization to apply in bone regeneration. Biomed Mater. 2008;3(1):015003.

[7] 黄江鸿,杨雷,廖福朋,等.低氧诱导因子-1α诱导分化的骨髓间充质干细胞复合纳米人工骨修复兔桡骨缺损[J].骨科,2016,7(3): 201-206,212.

[8] Löfgren H, Engquist M, Hoffmann P, et al. Clinical and radiological evaluation of Trabecular Metal and the Smith-Robinson technique in anterior cervical fusion for degenerative disease: a prospective, randomized, controlled study with 2-year follow-up. Eur Spine J. 2010;19(3):464-473.

[9] Jaiswal N, Haynesworth SE, Caplan AI, et al. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem. 1997;64(2): 295-312.

[10] Vitale-Brovarone C, Ciapetti G, Leonardi E, et al. Resorbable glass-ceramic phosphate-based scaffolds for bone tissue engineering: synthesis, properties, and in vitro effects on human marrow stromal cells. J Biomater Appl. 2011;26(4): 465-489.

[11] 张彬,湛梅圣,赵玉玺,等.BMSCs-BMP2-煅烧牛骨复合物的制作及其在兔尺骨骨缺损修复中的应用[J].山东医药,2015,55(12): 17-20,111.

[12] Liu X, Liao X, Luo E, et al. Mesenchymal stem cells systemically injected into femoral marrow of dogs home to mandibular defects to enhance new bone formation. Tissue Eng Part A. 2014;20(3-4):883-892.

[13] Zhou Q, Yu BH, Liu WC, et al. BM-MSCs and Bio-Oss complexes enhanced new bone formation during maxillary sinus floor augmentation by promoting differentiation of BM-MSCs. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2016;52(7):757-771.

[14] Yang C, Liu Y, Li C, et al. Repair of mandibular defects by bone marrow stromal cells expressing the basic fibroblast growth factor transgene combined with multi-pore mineralized Bio-Oss. Mol Med Rep. 2013;7(1):99-104.

[15] 赵健,黄远亮,刘阿贵,等.以Bio-oss胶原为支架材料的组织工程化骨修复种植体周围骨缺损的初步实验研究[J].口腔医学,2013, 33(2):95-99.

[16] 谭丽思,林晓萍,刘尧,等.组织工程化骨修复犬牙槽骨缺损的组织学观察[J].解剖科学进展,2010,16(6):492-495.

[17] 谭丽思,林晓萍,刘尧,等.组织工程骨促进犬牙槽骨再生的体内研究[J].口腔医学研究,2010,26(2):183-186.

[18] 李京旭,李龙和,玄云泽.Bio-oss/PRF复合支架结合骨髓基质细胞构建组织工程骨实验研究[J].延边大学医学学报,2014, 37(4): 235-238.

[19] 赵健,黄远亮,蒋欣泉,等.Bio-Oss胶原结合骨髓基质细胞构建组织工程骨的实验研究[J].中国口腔颌面外科杂志,2006,4(3):215-219.

[20] 谭志军,陈艳,张翠萍,等.微小RNA调控骨髓间充质干细胞分化的研究进展[J].中华实验外科杂志,2014,31(6):1389-1390.

[21] 罗世君,吴倩倩,孙勇,等.兔骨髓间充质干细胞的分离培养及成骨分化的实验研究[J].西南国防医药,2016,26(6):590-593.

[22] Song G, Habibovic P, Bao C, et al. The homing of bone marrow MSCs to non-osseous sites for ectopic bone formation induced by osteoinductive calcium phosphate. Biomaterials. 2013;34(9):2167-2176.

[23] Lyons FG, Gleeson JP, Partap S, et al. Novel microhydroxyapatite particles in a collagen scaffold: a bioactive bone void filler? Clin Orthop Relat Res. 2014;472(4):1318-1328.

[24] 吴凯.BMP-2和BMSCs结合n-HA/n-LDIG复合材料修复兔桡骨缺损的实验研究[D].长沙:中南大学,2013.

[25] Zhu H, Jiang XX, Wu Y, et al. Identification of mesenchymal stem cells derived from rheumatoid arthritis synovial fluid and their regulatory effect on osteoblast formation. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 2009;17(4):977-980.

[26] Reinshagen H, Auw-Haedrich C, Sorg RV, et al. Corneal surface reconstruction using adult mesenchymal stem cells in experimental limbal stem cell deficiency in rabbits. Acta Ophthalmol. 2011;89(8):741-748.

[27] Huang L, Li R, Liu W, et al. Dynamic culture of a thermosensitive collagen hydrogel as an extracellular matrix improves the construction of tissue-engineered peripheral nerve. Neural Regen Res. 2014;9(14):1371-1378.

[28] 韩操,马宁,李忠义,等.自体骨髓间充质干细胞载体复合物修复骨缺损的组织学观察[J].中国组织工程研究,2015,19(6):891-897.

[29] 董红宾,张琴,何惠宇,等.三种异种骨材料修复牙周骨缺损的比较[J].中国组织工程研究,2015,19(8):1170-1176.

[30] Duda M, Pajak J. The issue of bioresorption of the Bio-Oss xenogeneic bone substitute in bone defects. Ann Univ Mariae Curie Sklodowska Med. 2004;59(1):269-277.

[31] Du C, Yao C, Li N, et al. Cell sheet-engineered bones used for the reconstruction of mandibular defects in an animal model. Exp Ther Med. 2015;10(6):2216-2220.

[32] Kim HC, Song JM, Kim CJ, et al. Combined effect of bisphosphonate and recombinant human bone morphogenetic protein 2 on bone healing of rat calvarial defects. Maxillofac Plast Reconstr Surg. 2015;37(1):16.

[33] Arvidson K, Abdallah BM, Applegate LA, et al. Bone regeneration and stem cells. J Cell Mol Med. 2011;15(4): 718-746.

[34] Chatterjea A, van der Stok J, Danoux CB, et al. Inflammatory response and bone healing capacity of two porous calcium phosphate ceramics in critical size cortical bone defects. J Biomed Mater Res A. 2014;102(5):1399-1407.

[35] Kang SH, Chung YG, Oh IH, et al. Bone regeneration potential of allogeneic or autogeneic mesenchymal stem cells loaded onto cancellous bone granules in a rabbit radial defect model. Cell Tissue Res. 2014;355(1):81-88.

[36] Liu T, Wu G, Wismeijer D, et al. Deproteinized bovine bone functionalized with the slow delivery of BMP-2 for the repair of critical-sized bone defects in sheep. Bone. 2013;56(1): 110-118.

[37] Wehrhan F, Amann K, Molenberg A, et al. Critical size defect regeneration using PEG-mediated BMP-2 gene delivery and the use of cell occlusive barrier membranes - the osteopromotive principle revisited. Clin Oral Implants Res. 2013;24(8):910-920.

[38] Choi S, Liu IL, Yamamoto K, et al. Implantation of tetrapod-shaped granular artificial bones or β-tricalcium phosphate granules in a canine large bone-defect model. J Vet Med Sci. 2014;76(2):229-235.

[39] Seeherman HJ, Li XJ, Smith E, et al. rhBMP-2/calcium phosphate matrix induces bone formation while limiting transient bone resorption in a nonhuman primate core defect model. J Bone Joint Surg Am. 2012;94(19):1765-1776.

[40] Schlegel KA, Lang FJ, Donath K, et al. The monocortical critical size bone defect as an alternative experimental model in testing bone substitute materials. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2006;102(1):7-13.

[41] Schmitz JP, Hollinger JO. The critical size defect as an experimental model for craniomandibulofacial nonunions. Clin Orthop Relat Res. 1986;(205):299-308.

[42] Gosain AK, Song L, Yu P, et al. Osteogenesis in cranial defects: reassessment of the concept of critical size and the expression of TGF-beta isoforms. Plast Reconstr Surg. 2000; 106(2):360-371; discussion 372.

[43] Jiang ZQ, Liu HY, Zhang LP, et al. Repair of calvarial defects in rabbits with platelet-rich plasma as the scaffold for carrying bone marrow stromal cells. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol. 2012;113(3):327-333.

[44] 傅涛.不同粒径GP/CPC人工骨修复新西兰兔颅骨缺损效果的对比研究[D].杭州:浙江大学,2014.

[45] 陈畅行,宋晓陵,达静姝,等.两种脱细胞真皮基质材料在兔颅骨缺损引导骨再生术中的成骨效果评估[J].牙体牙髓牙周病学杂志, 2014,24(5):274-277.

[46] 李耘.明胶微粒粒径与配比对GP/CPC复合人工骨材料修复骨缺损的影响[D].杭州:浙江大学,2015.

[47] 王媛,王稚英,王明.同种异体牙源性骨移植材料修复兔颅骨缺损的实验研究[J].中国医科大学学报,2016,45(12):1082-1085.

[48] Naito Y, Terukina T, Galli S, et al. The effect of simvastatin-loaded polymeric microspheres in a critical size bone defect in the rabbit calvaria. Int J Pharm. 2014;461(1-2): 157-162.

[49] Li G, Wang X, Cao J, et al. Coculture of peripheral blood CD34+ cell and mesenchymal stem cell sheets increase the formation of bone in calvarial critical-size defects in rabbits. Br J Oral Maxillofac Surg. 2014;52(2):134-139.

引言

口腔内牙列缺损不仅影响美观，还影响发音、咀嚼等功能。随着生活水平的提高，种植义齿受到越来越多的人的欢迎。种植前必须先测量种植区垂直与水平方向的骨厚度。一般来说垂直向至少10 mm，水平向至少5 mm的骨量才可以满足种植体的植入需求^[1]。但是在临床工作中，常常由于外伤、囊肿及感染等引起的病理性吸收、生理性吸收等导致术区骨缺损。骨增量是一种重建缺失骨组织的修复前外科技术，其特点是让缺损区骨组织代偿性再生并且尽量避免瘢痕组织形成^[1]。而要让骨量增加，除了牵张成骨外，常常需要移植骨材料。目前，移植骨材料可分为4类，分别是自体骨、同种异体骨、异种骨和合成骨。自体骨具有与拟修复部位相同的成分、组织相容性好、成骨迅速等诸多优点，一直被认为是骨移植的金标准，但也存在来源有限、增加创伤、手术时间延长、供骨区出血、疼痛、容易感染与感觉麻木等缺点^[2-4]。移植同种异体骨、异种骨和合成骨则存在感染、传播疾病、不易被吸收的风险，且价格昂贵。骨组织工程的出现为避免这些问题提供了新思路。骨组织工程学是以种子细胞、支架材料和其他生物活性成分为核心框架，模拟骨组织的自然发生过程，从组织学水平恢复骨组织的形态、结构和功能的完整性^[5]。骨组织工程已被认为是修复骨缺损最有希望的方法而成为研究的热点^[6]。骨髓间充质干细胞以及各种支架材料也都成为研究热点。

有研究表明骨髓间充质干细胞可作为较理想的种子细胞^[7-8]，体外培养的骨髓间充质干细胞在特定的诱导条件下可定向分化为具有典型表型特征的成骨细胞，诱导后的骨髓间充质干细胞可与合适的载体复合^[9-12]，促进新骨生长。

目前国内外相关的实验研究中，有探讨骨髓间充质干细胞复合Bio-oss在兔上颌窦底提升中促进新骨形成的机制^[13]；有探讨Bio-oss复合被碱性成纤维细胞生长因子基因转染的骨髓间充质干细胞对兔下颌骨牵张过程中骨再生的影响^[14]；有用骨髓间充质干细胞与Bio-oss胶原复合物修复小型猪种植体周围骨缺损的研究^[15]；有进行骨髓间充质干细胞与Bio-oss骨胶原结合修复犬牙槽骨缺损的实验研究^[16-17]；有将Bio-oss与骨髓间充质干细胞复合物植入裸鼠背部皮下观察成骨的研究^[18-19]。但这些研究中，有的观察周期较短，有的没有空白对照组，并且未见将骨髓间充质干细胞复合Bio-oss用于修复兔颅骨缺损的实验研究。因此，作者拟采用骨髓间充质干细胞复合Bio-oss植入兔颅骨缺损处观察促进骨生长的效果，为临床治疗骨缺损提供实验依据和理论基础。

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年9月至2016年1月在成都达硕实验动物中心完成。

1.3 材料

实验动物：①清洁级雌性健康日本大耳兔96只，兔龄3个月，体质量(2 000±500) g，用于动物分组实验；②清洁级雄性健康日本大耳兔12只，兔龄3个月，体质量(2 500± 500) g，用于制备骨髓间充质干细胞。动物兔由成都达硕实验动物中心提供并统一进行管理及饲养，实验动物设施使用许可证号：SYXK(川)2014-189。实验遵循动物福利原则, 符合《关于善待动物的指导性意见》。实验动物术前在标准环境下分笼饲养10 d[自然昼夜光照条件下，单笼、全价颗粒饲料喂养，室温控制在(23±2) ℃；保持兔舍内60%-70%的空气湿度]。

主要仪器及试剂：DMEM培养基和0.25%胰酶购自美国Hyclone公司；成骨诱导培养基购自广州赛业生物科技有限公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；Bio-oss(颗粒大小0.25-1.00 mm，孔隙率45%-80%)购自Geistlich瑞士Pharma公司；引导组织再生膜[规格20 mm×25 mm，厚度(0.5±0.2) mm]购自博特生物科技有限公司；恒温培养箱购自日本三洋电机；台式离心机购自江苏科析仪器有限公司；洁净工作台购自苏州安泰空气技术有限公司；倒置显微镜和数码三目摄像显微镜购自麦克奥迪实业集团有限公司；种植机(Surgic XT Plus)及种植手机(Ti-SG20L)购自日本NSK公司。

1.4 方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定 取雄性实验兔，以3%戊巴比妥钠(1 mL/kg)麻醉，16#骨髓穿刺针从股骨髁上结节穿刺至有落空感，接20 mL一次性注射器(注射器内留有肝素0.5 mL)，抽取骨髓液约2 mL，相同方法抽取对侧。取4 mL 1.073 g/mL percoll液于离心管，把骨髓液轻轻滴加到 percoll液面上，2 000 r/min离心20 min。离心后抽取云雾状单核细胞层^[20]，PBS漂洗2次(800 r/min，5 min)，收集细胞，加入DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素)，接种细胞在25 cm²培养瓶里。培养箱内为37 ℃恒温，体积分数5% CO₂，饱和湿度。48 h后全量换液，以后每两三天全量换液。细胞基本单层铺满瓶底时，使用胰蛋白酶(0.25%)消化进行传代培养。取第3代细胞使用成骨诱导培养基(L-抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、包含地塞米松)进行成骨诱导，隔2 d换液。采用CD44及CD45抗原的免疫反应鉴定获得的细胞为骨髓间充质干细胞^[21]。

1.4.2 骨髓间充质干细胞与Bio-oss复合 取6个含有DMEM培养基的培养皿，分别加入6盒包装完好的Bio-oss(0.5 g/盒)，Bio-oss颗粒完全没入培养基中，恒温箱中放置24 h后取出，移液管吸取多余培养液，再用无菌纱布沿培养皿边缘吸走多余液体，剩余润湿的Bio-oss颗粒，将Bio-oss颗粒均匀地铺为一层，取成骨诱导后的骨髓间充质干细胞消化，消化后缓慢均匀滴加到Bio-oss颗粒中(1 g Bio-oss复合5×10⁷个细胞)，于37 ℃，体积分数5% CO₂培养箱中静置5 h，静置后细胞可充分黏附于材料表面，再缓慢滴加培养液，隔2-4 d换液，共培养1周后观察细胞状态，融合为单层后开始使用。

1.4.3 制备兔颅骨缺损模型 取雌性实验兔称体质量，用3%戊巴比妥钠按1 mL/kg注入耳缘静脉进行麻醉，将兔俯卧固定于手术台，头部去毛，常规消毒铺巾。沿颅顶正中做一纵行切口，长约4 cm，逐层切开，深达骨面，充分剥离，显露颅骨，使用种植拉钩让术区暴露，以颅正中缝为解剖标志，于颅顶正中缝沿顺时针作右前、右后、左后3个直径6 mm的全层骨缺损(图1A)，取骨钻定位，术中以灭菌生理盐水冲洗，间断钻取，待阻力变小后稍向下0.5-1.0 mm，残留薄层骨松质时轻轻去除骨块，制备3个洞穿形骨缺损。

1.4.4 动物分组及干预 将模型兔随机分4组，分别植入不同材料。复合物组骨粉充填器轻轻加压植入Bio-oss (0.125 g/只)复合骨髓间充质干细胞，稍高于骨面(图1B)；Bio-oss组以同样的方法植入Bio-oss(0.125 g/只)(图1C)；骨髓间充质干细胞组骨缺损处植入1.25 μL骨髓间充质干细胞悬液(图1D)，具体方法是将骨髓间充质干细胞预先胰酶消化，将15×10⁷单位的骨髓间充质干细胞制成30 μL细胞悬液，分别用1 μL移液管滴入24只兔骨缺损处；空白组不植入任何材料。4组骨缺损表面均覆盖引导组织再生膜，边缘超过骨缺损边界约2 mm(图1E)。分层缝合术区。术后肌注青霉素钠(100 000 U/kg)，连续3 d，防止感染。

1.4.5 取材 造模后2，4，8，12周每组各取6只兔，称体质量，3%戊巴比妥钠(1 mL/kg)耳缘静脉注射麻醉，空气栓塞处死。取兔颅骨手术部位(截取部位至少超出孔边缘2 cm)。

1.4.6 大体观察 观察动物一般情况；伤口愈合情况，包括红肿程度、局部炎症反应、感染及创口上皮生长情况等；骨缺损处愈合情况。

1.4.7 组织学观察 用40 g/L多聚甲醛将标本固定24 h，乙酸脱钙2周，脱钙后石蜡包埋切片。脱蜡切片；苏木精染色10-20 min；自来水洗；1%盐酸分色20-40 s，自来水洗；50 ℃的温水或弱碱性水溶液反蓝，自来水洗；显微镜下观察染色效果，伊红染液染色1 min，自来水洗；梯度乙醇脱水；二甲苯透明；中性树胶封固，贴标签。采用数码三目摄像显微系统在100倍光镜下进行图像采集。观察骨缺损区新生骨情况、Bio-oss降解情况、炎症情况，借鉴Lane-Sandhu组织学结合影像学评分标准对新生骨面积评分[无新骨再生(0分)，新骨再生率< 25%(1分)，新骨再生率25%-50%(2分)，新骨再生率50%-75%(3分)，新骨再生率>75%(4分)]，并进行统计分析。每个标本随机抽取3个骨缺损处切片各1张，记分后取平均值。

1.5 主要观察指标 植入材料后兔颅骨的大体形态和组织学形态变化情况。

1.6 统计学分析 用SPSS 23.0软件对数据进行正态性检验，实验总样本量为96 > 50，采用矩法检验，以P < 0.1为差异有显著性意义；再进行单因素方差分析，首先进行方差齐性检验，若方差齐，采用LSD法行组间两两比较，若方差不齐，采用Dunnett法进行组间两两比较。以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨组织工程的研究主要包括种子细胞、支架材料、细胞因子和组织工程骨的构建等研究^[23]。其中最基本的问题是种子细胞，目前一致认为较理想的种子细胞必须具备以下几个特点^[24]：①取材方便容易并且数量级多，对供体造成的影响较小；②体外实验中应具有良好的增殖性和兼容的生物活性；③能较好地黏附于支架材料上增殖，具有一定的成骨效用；④种植后能与机体各种生理条件相适应，具有成骨作用^[25]。目前用于骨缺损后修复的种子细胞主要有胚胎干细胞、脐血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞等^[26]，其中骨髓间充质干细胞作为种子细胞不仅能适应临床应用的需要，它还有很多优点：取材简单、来源方便、增殖分化能力强、生物学活性好、可基因修饰、冷冻保存后不易改变其生物学特征、同种异体骨髓内干细胞移植不发生或只发生程度很轻微的免疫排斥反应^[27-28]。因此骨髓间充质干细胞，不仅具有广阔的临床应用前景，而且也是目前应用最为广泛，最为理想的种子细胞。

骨组织工程中，支架材料也有着非常重要的作用。骨移植材料作为支架材料的目的是为细胞及生长因子提供必需的空间和生存的基础，应满足以下条件^[29]：①具有良好的生物兼容性和细胞兼容性；②具有可降解性及适宜的降解速率；③有符合组织器官要求的生物力学性能；④有良好的细胞接口关系，可相互作用以保存和促进细胞功能；⑤能形成良好的三维多孔且内部贯通的孔网络结构；⑥适当的表面化学性能适于细胞的附着、增殖和分化。

Bio-oss骨是牛松质骨经过特殊处理，除去蛋白和其他有机成分，高纯度并保持多孔天然骨无机结构，以及与人体牙槽骨相似的物理化学结构和抗压强度的异种骨^[30]，并且Bio-oss具有非常好的生物相容性，能满足骨引导材料的标准。Bio-oss植入体内可以降解吸收并逐渐被新生骨取代。

实验中，12周时，复合物组成骨面积显著高于Bio-oss组，骨髓间充质干细胞组与空白组成骨面积接近。分析其原因，可能是骨髓间充质干细胞促进骨再生的一个重要机制是分泌多种生长因子。多种因子都有良好的骨诱导性，如转化生长因子β超家族的骨形态发生蛋白2，4，5，6，7等^[31-32]。骨髓间充质干细胞在分化为前成骨细胞的过程中高表达血小板衍生因子、转化生长因子β、成纤维细胞生长因子、Runx2，前成骨细胞在形成成骨细胞的过程中高表达胰岛素增长因子、整合素11、整合素7、成纤维细胞生长因子2、血管内皮生长因子A等^[33]。骨髓间充质干细胞的成骨作用需要支架材料作为载体才能更好的、长久的维持。直接在骨缺损处注射容易被自身体液、血液冲洗而流失，从而使骨髓间充质干细胞有效浓度降低而不能很好的发挥其成骨作用。

实验中，复合物组成骨面积与骨髓间充质干细胞组相比显著增加，Bio-oss组成骨面积与空白组相比，仅在4周时差异有显著性意义。这可能是Bio-oss骨单独使用时因为它的无机特性，而严重缺乏骨诱导性和成骨作用。

根据最近几年来国内外相关文献显示，用于研究骨缺损的动物模型主要为：鼠、兔等小型动物，以及羊、猪、犬、猴等大型动物^[34-39]。实验之所以选择兔作为实验动物模型，主要是因为鼠颅骨面积较小，不能满足实验所需，羊、猪、犬、猴饲养困难，价格昂贵，而兔来源广泛，饲养方便，价格适宜。

兔的实验部位有颅骨、下颌骨和股骨，选择颅骨作为评价颅颌面部骨缺损修复材料性能的实验部位主要有以下优点：第一，首先，从胚胎发生方面来讲，颅骨和颌骨均为单一的膜性骨(蝶骨大翼和下颌骨除外)，从解剖上来讲，颅骨由内外两层皮质骨和中间的松质骨构成，和下颌骨相似。第二，与其他骨相比，颅骨骨髓少、血供差和骨再生能力较弱，适合研究较小范围的骨缺损修复^[40]。第三，与其他手术部位相比，手术视野清晰、操作简便、手术范围便于掌控、可重复性好、可比性强，植入材料受外力影响小，不影响饮食，便于建模后维护等优点。

Schmitz等^[41]研究发现，骨缺损有一个不能自行愈合的临界值，缺损长度小于该值可以自然愈合，大于该值后无法自然愈合，于1986年将临界骨缺损定义为动物体内造成的骨缺损，在自然状态下终生不能自行达到骨愈合的临界点。但是在实验研究中，由于时间受限常常无法观察到动物的整个生命周期。因此有学者将临界骨缺损定义为在实验期间不能自行愈合的骨缺损称为临界骨缺损^[42]，即小于临界骨缺损尺寸的骨缺损具有骨自行愈合的能力，此时将所研究的成骨材料应用于此骨缺损将失去研究意义，而只有将成骨材料应用于临界骨缺损及以上尺寸的骨缺损时才能评价成骨材料的成骨性能。国内外学者在研究兔颅骨成骨方面采用的临界骨缺损值各不相同，没有统一的标准。Jiang等^[43]关于富血小板血浆蛋白复合骨髓基质干细胞修复骨缺损的兔实验研究中，选用临界骨缺损为直径为5 mm。傅涛^[44-48]采用的兔颅骨缺损值为8 mm，Li等^[49]实验研究中采用的颅骨骨缺损的直径为 15 mm。实验依据此结论，并综合考虑到需要在兔颅骨上做3个骨缺损，因此选择6 mm骨缺损。

综上所述，结果证实骨髓间充质干细胞复合Bio-oss比单独植入Bio-oss、单独植入骨髓间充质干细胞、空白组具有更好的成骨效果。说明以骨髓间充质干细胞作为种子细胞，Bio-Oss作为支架材料，能起到促进兔颅骨缺损成骨的作用，为临床上骨缺损修复提供新的思路及实验依据。

骨髓间充质干细胞复合Bio-oss修复兔颅骨缺损的组织学变化

Histological changes of bone marrow mesenchymal stem cells combined with Bio-oss in repairing rabbit skull defects

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 2

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	谭新访, 郭艳幸, 秦晓飞, 张斌清, 赵东亮, 潘琨琨, 李瑜卓, 陈皓宇. 顺轴疲劳运动对兔髌股关节软骨损伤的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(在线): 1-6.
[2]	姚晓玲, 彭建城, 许岳荣, 杨志东, 张顺聪. 可变角度零切迹前路椎间融合内固定系统治疗脊髓型颈椎病：30个月随访[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1377-1382.
[3]	王宝娟, 郑曙光, 张琪, 李田洋. 苗药熏蒸治疗膝骨关节炎模型兔可延缓细胞外基质的破坏[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1180-1186.
[4]	吕依妍, 李寒冰, 马晓庆, 张晗, 张宇航, 李根林. 采用复合因素建立内热消渴小鼠模型的特点分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1187-1193.
[5]	项鑫健, 柳芳, 吴亮亮, 贾大平, 陶越, 赵政男, 赵宇. 高剂量维生素C促进大鼠自体脂肪移植成活[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1242-1246.
[6]	王景, 熊山, 曹金, 冯林伟, 王信. 白细胞介素3在骨代谢中的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1260-1265.
[7]	肖豪, 刘静, 周君. 脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1266-1271.
[8]	朱婵, 韩栩珂, 姚承佼, 张强, 刘静, 邵明. 针刺治疗帕金森病：动物实验显示的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1272-1277.
[9]	惠小珊, 白京, 周思远, 王阶, 张金生, 何庆勇, 孟培培. 中医药调控干细胞诱导分化的理论机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1125-1129.
[10]	安维政, 何萧, 任帅, 刘建宇. 肌源干细胞在周围神经再生中的潜力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1130-1136.
[11]	范一鸣, 刘方煜, 张洪宇, 李帅, 王岩松. 脊髓损伤后室管膜区内源性神经干细胞反应的系列问题[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1137-1142.
[12]	轩娟娟, 白鸿太, 张继翔, 王耀权, 陈国勇, 魏思东. 调节性T细胞亚群在肝移植中的作用及临床应用进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1143-1148.
[13]	田川, 朱向情, 杨再玲, 鄢东海, 李晔, 王严影, 杨育坤, 何洁, 吕冠柯, 蔡学敏, 舒丽萍, 何志旭, 潘兴华. 骨髓间充质干细胞调控猕猴卵巢的衰老[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 985-991.
[14]	胡伟, 谢兴奇, 屠冠军. 骨髓间充质干细胞来源外泌体改善脊髓损伤后血脊髓屏障的完整性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 992-998.
[15]	侯婧瑛, 郭天柱, 于萌蕾, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理通过激活MALAT1靶向抑制miR-195促进骨髓间充质干细胞的生存和血管形成[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1005-1011.