文章在基因及蛋白水平探讨了胰岛素样生长因子1对退变髓核细胞聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原表达的影响,结果发现,胰岛素样生长因子1能促进退变髓核细胞聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的表达,以100 μg/L的质量浓度作用为佳;作者进而对胰岛素样生长因子1促进聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原表达的作用进行信号转导机制的分析,发现胰岛素样生长因子1能激活PI3K/Akt通路,LY294002(PI3K/Akt通路特异性抑制剂)能抑制胰岛素样生长因子1对PI3K/Akt通路的激活,并且在LY294002将PI3K/Akt通路抑制后,胰岛素样生长因子1促进聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原表达的作用显著降低,从而作者认为胰岛素样生长因子1可通过PI3K/Akt通路促进髓核细胞聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的表达。
聚集蛋白聚糖与Ⅱ型胶原是髓核组织中最重要的两种细胞外基质,它们能维持髓核组织水含量及静水压[28],从而起到分散负荷、维持椎间盘张力的作用。聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原由髓核细胞合成分泌,可被去整合素金属蛋白酶、基质金属蛋白酶等降解酶类降解[29-33],椎间盘退变过程中,髓核细胞数量减少、功能减退,聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的表达明显减少,因此,如何使退变的髓核细胞恢复功能,如何促进聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原表达,成为目前椎间盘退变生物学治疗研究重点。因此,本实验选择聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原作为退变髓核细胞功能修复的检测指标。
胰岛素样生长因子1作为一种活性多肽,具有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、促进蛋白合成的作用[34],有学者认为胰岛素样生长因子1具有促进椎间盘终板软骨细胞Ⅱ型胶原表达的作用,且该作用呈浓度依赖性[35]。本研究采用0-200 μg/L的胰岛素样生长因子1作用于人退变髓核细胞,结果发现,胰岛素样生长因子1能促进退变髓核细胞聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的表达,该作用亦呈剂量依赖性。另外,本实验中Ⅱ型胶原的mRNA与蛋白水平,以及聚集蛋白聚糖蛋白水平表达在0 μg/L与20 μg/L组间差异无显著性意义,考虑原因为所培养的细胞为退变髓核细胞,对胰岛素样生长因子1的反应较正常细胞差所致。
髓核细胞分离方法有多种,目前应用较广的为酶序贯消化法[36],即先采用胰蛋白酶消化,再用Ⅱ型胶原酶消化,可获取较多的髓核细胞,但酶的联合及长时间作用可损伤细胞并增加污染概率。也有学者单纯采用Ⅱ型胶原酶消化来分离髓核细胞[37],该方法相对简单,对细胞损伤轻,但分离的细胞数量较少。本研究采用酶序贯消化法分离髓核细胞,但是作者缩短了酶的作用时间(先采用胰蛋白酶消化10 min,Ⅱ型胶原酶消化2 h),以减轻对细胞的损伤,虽然仍有部分组织块未充分消化,将这些组织块一同接种培养瓶,先添加少量培养液避免组织块悬浮,待组织块与培养瓶底粘贴紧密后再加入足量培养液,本文观察发现,在原代培养约1周时有大量的髓核细胞从组织块中爬出。
胰岛素样生长因子1与细胞膜上的胰岛素样生长因子1受体结合后,可使胰岛素样生长因子1受体自身磷酸化,激活了其内源性酪氨酸激酶的活性,胰岛素样生长因子1受体激活后可通过PI3K/Akt信号通路的传导,最终激活靶基因表达。本研究发现,胰岛素样生长因子1能促进p-PI3K、p-Akt的表达,激活PI3K/Akt通路,而LY294002能阻断胰岛素样生长因子1对PI3K/Akt通路的激活胰岛素样生长因子1能促进聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原蛋白的表达,而阻断PI3K/Akt通路后,聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的表达降低,说明胰岛素样生长因子1可通过PI3K/Akt通路促进髓核细胞聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的表达。
本研究采用LY294002作为PI3K/Akt通路抑制剂,LY294002可以通过细胞膜,其吗啉基团与PI3K γ链上的1882位点缬氨酸形成氢键,从而抑制PI3K的活性。目前研究采用的LY294002浓度多为30-50 μmol/L,该浓度可特异性阻断PI3K/Akt通路[38],但浓度超过100 μmol/L时,其磷酸化抑制作用将不是特异性的。因此,本实验采用的LY294002浓度为50 μmol/L。
细胞信号通路是一个复杂的网络,可能还有其他的通路参与胰岛素样生长因子1对髓核细胞聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原表达的调控。胰岛素样生长因子1与胰岛素样生长因子1受体结合后还可激活与细胞增殖相关的细胞外信号调节激酶通路[39],Zhang等[35]认为细胞外信号调节激酶通路激活能抑制软骨细胞Ⅱ型胶原的表达,而抑制ERK通路能促进Ⅱ型胶原的表达。Yin等[40]也认为PI3K/Akt及ERK这两条通路对软骨细胞基质的合成有相反的作用,而Risbud等[41]则有相反的结论,后续实验将进一步探讨ERK通路在髓核细胞增殖及基质合成等方面的作用。
本研究为细胞体外实验,体外培养条件相对稳定、可控,而髓核细胞所在的体内环境为低氧、低糖、低pH、高渗条件,胰岛素样生长因子1注入人或动物退变椎间盘内,能否有效促进聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的表达,从而修复退变的椎间盘,以及胰岛素样生长因子1在体内的最佳作用浓度及作用时效等问题尚需进一步研究。
综上所述,胰岛素样生长因子1能促进退变髓核细胞聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的表达,且该作用为剂量依赖性;胰岛素样生长因子1能激活PI3K/Akt通路,而PI3K/Akt通路的阻断可明显抑制胰岛素样生长因子1促进聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原表达的作用,表明胰岛素样生长因子1可通过PI3K/Akt通路促进退变髓核细胞聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达,初步阐述了胰岛素样生长因子1修复退变椎间盘的信号转导机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点:组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程