肌腱细胞与聚二甲基硅氧烷多孔材料复合培养后的玻璃化低温保存

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.02.014

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (2): 238-243.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.02.014

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肌腱细胞与聚二甲基硅氧烷多孔材料复合培养后的玻璃化低温保存

王治^1，2，谭美云²，卿泉¹，陈曦^1，3，刘成俊^1，4，秦廷武¹

¹四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室，四川省成都市 610041；²西南医科大学附属医院骨与关节外科，四川省泸州市 646000；³德阳市人民医院，四川省德阳市 618000；⁴成都市第一人民医院，四川省成都市 610041

收稿日期:2016-10-29 出版日期:2017-01-18 发布日期:2017-02-27
通讯作者: 秦廷武，教授，四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室，四川省成都市 610041
作者简介:王治，男，1979年生，四川省内江市人，汉族，2007年四川大学华西临床医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事骨骼肌肉系统组织工程，骨肿瘤，关节修复重建研究。
基金资助:
国家自然科学基金(31370988，31271049)

Vitreous cryopreservation of tenocytes co-cultured with porous polydimethylsiloxane scaffolds

Wang Zhi^{1, 2}, Tan Mei-yun², Qing Quan¹, Chen Xi^{1, 3}, Liu Cheng-jun^{1, 4}, Qin Ting-wu¹

¹State Key Laboratory of Biotherapy, West China Hospital of Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China;²Department of Bone and Joint Surgery, the Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; ³Deyang People’s Hospital, Deyang 618000, Sichuan Province, China; ⁴Chengdu First People’s Hospital, Chengdu 610041, Sichuan Province, China

Received:2016-10-29 Online:2017-01-18 Published:2017-02-27
Contact: Qin Ting-wu, Professor, State Key Laboratory of Biotherapy, West China Hospital of Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
About author:Wang Zhi, Master, Attending physician, State Key Laboratory of Biotherapy, West China Hospital of Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China; Department of Bone and Joint Surgery, the Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31370988, 31271049

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
深低温保存：是由常温到低温(5-0 ℃)，再到深低温(-196 ℃)的过程及相反的升温过程，短时间内，5-0 ℃对细胞仅造成轻微损伤。常温下，细胞生理活动在细胞内的脂膜系统区隔下完成。温度变低会引起细胞膜脂相变，进而导致细胞膜完整性破坏，细胞通透性改变。
玻璃化低温保存：是一种新的低温保存方法，玻璃化意指水在降温时因为玻璃化保存剂的存在，阻止了水分子结晶，在冰点以下形成类似玻璃一样的非结晶固态结构，玻璃化低温保存得以实现的前提是冻存剂必须达到较高的浓度，在玻璃化状态下，生物大分子被未结晶的水分子和冻存保护剂分子包围，能长时间保持生物大分子的结构和功能，这是玻璃化低温保存得以实现的物理化学基础。

背景：大量实验已证明，玻璃化低温保存能获得更高的细胞存活率。
目的：观察玻璃化低温保存对肌腱细胞与聚二甲基硅氧烷材料复合物的影响。
方法：取共培养9-14 d的肌腱细胞-聚二甲基硅氧烷复合物，分别以10%二甲亚砜、玻璃化低温保存液VS55、21%二甲亚砜进行低温保存和复苏。复苏培养1 h后，进行死/活双色荧光染色和流式细胞技术分析，观察肌腱细胞存活率，以新鲜培养的肌腱细胞-聚二甲基硅氧烷复合物为对照。
结果与结论：①死/活双色荧光染色：10%二甲亚砜组肌腱细胞从聚二甲基硅氧烷支架材料孔隙表面上剥脱，呈双染的不规则细胞形态；VS55组和21%二甲亚砜组存在单染绿色荧光的梭形和球形细胞，也存在红绿双染的不规则形态细胞，两组细胞观测密度较对照组明显下降；②流式细胞技术分析：对照组细胞大小均匀；10%二甲亚砜组由于细胞量少而不足以进行流式细胞检测；VS55组以较小体积的细胞颗粒为主；21%二甲亚砜组细胞体积大小与新鲜对照组类似，同时存在较小颗粒；③细胞回收率与存活率：VS55组细胞相对存活率低于21%二甲亚砜组(64.9%，76.2%，P < 0.05)；10%二甲亚砜不能获取足够细胞，未能行细胞计数；④结果表明：采用21%二甲亚砜玻璃化低温保存有利于提高细胞的存活率，保持肌腱细胞-支架结合完整。

orcid.org/0000-0001-9871-4375ORCID: 0000-0001-9871-4375(王治)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 组织工程肌腱, 玻璃化低温保存, 二甲亚砜, 聚二甲基硅氧烷, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Accumulative evidence supports that vitreous cryopreservation can improve the cell survival rate.
OBJECTIVE: To investigate the effect of vitreous cryopreservation on the tenocytes co-cultured with the porous polydimethylsiloxane (PDMS) scaffold.
METHODS: Tenocytes were co-cultured with the porous PDMS scaffold for 9-14 days, and then preserved and resuscitated in the 10% dimethyl sulfoxide (DMSO), 21% DMSO and VS55, respectively. One hour later, the survival rate of post-resuscitated tenocytes versus pre-resusciated tenocytes was analyzed by live/dead double color fluorescent staining and flow cytometry.
RESULTS AND CONCLUSION: Live/dead double color fluorescent staining revealed that tenocytes in the 10% DMSO group appeared to be irregular and double stained, and a large number of cells shedding from the scaffold. The VS55 and 21% DMSO groups showed some spindle and hemispherical cells single stained for green fluorescence and few double stained irregular cells. Additionally, the cell density in the two groups was significantly lower than that in the control group. Flow cytometry results found that there were homogenous cells in the control group; the number of cells in the 10% DMSO group was too low to undergo flow cytometry; small cell particles were visible in the VS55 group; in the 21% DMSO group, the cell volume was similar with the control group, and small particles also existed. The survival rate in the VS55 group (64.9%) was significantly lower than that in the 21% DMSO group (76.2%; P < 0.05). Conversely, the survived cells were rare in the 10% DMSO group. To conclude, 21% DMSO vitreous cryopreservation improves the cell survival rate and is beneficial for tenocyte adherence to the scaffold.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Cryopreservation, Dimethyl Sulfoxide, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

王治，谭美云，卿泉，陈曦，刘成俊，秦廷武. 肌腱细胞与聚二甲基硅氧烷多孔材料复合培养后的玻璃化低温保存[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(2): 238-243.

Wang Zhi, Tan Mei-yun, Qing Quan, Chen Xi, Liu Cheng-jun, Qin Ting-wu. Vitreous cryopreservation of tenocytes co-cultured with porous polydimethylsiloxane scaffolds[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(2): 238-243.

图/表（结果） 7

2.1 原位荧光观察结果三维多孔二甲基硅氧烷支架加大了供细胞生长黏附的表面积，复合培养9 d后，肌腱细胞呈融合状覆盖二甲基硅氧烷材料的孔隙表面(图1)。冻存前二甲基硅氧烷材料上黏附的肌腱细胞全部存活，细胞结构形态完整清晰。

10%二甲亚砜组经过升温，保存液洗脱，肌腱细胞从二甲基硅氧烷支架材料孔隙表面上剥脱，呈双染的不规则细胞形态，提示细胞死亡并伴有细胞结构破坏(图2A)；VS55组和21%二甲亚砜组存在单染绿色荧光的梭形和球形细胞，也存在红绿双染的不规则形态细胞，两组细胞观测密度较对照组明显下降(图2B，C)。

2.2 双色荧光染色流式细胞检测结果冻存复苏后的肌腱细胞与多孔二甲基硅氧烷复合物，经过恢复培养1 h后，TNE消化离心，行流式细胞检测。对照组显示细胞大小均匀，细胞主要是Calcein AM绿色荧光单染，97.5%分布于Q4象限(图3)。10%二甲亚砜组由于细胞量少而不足以进行流式细胞检测，可能是因为低温保存流程过程对细胞的黏附和存活有较大的损伤。VS55组低温保存复苏后的结果见图4，以较小体积的细胞颗粒为主，提示较大体积的细胞在经历降温、保存、复苏、消化过程后，会受到较大损伤，细胞碎片较多。21%二甲亚砜组冻存复苏后肌腱细胞，经过TNE消化后，细胞体积大小与对照组类似，同时存在较小颗粒，见图5。

2.3 玻璃化低温冻存复苏后的细胞回收率与存活率对照组、VS55组、21%二甲亚砜组恢复培养后消化收集细胞，经荧光染色流式细胞细胞检测，多次实验结果行方差分析，所得结果见图6，结果显示，VS55组相对平均存活率为64.9%，21%二甲亚砜组相对平均存活率为76.2%。

通过与对照组，得到VS55组、21%二甲亚砜组的细胞回收率，两组间细胞回收率比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。10%二甲亚砜组不能获取足够细胞，未能行细胞计数。

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引言

从Langer和Vacanti^[1]开创组织工程研究工作到现在已过去20多年，组织工程构建已从形态构建发展到功能构建^[2]。细胞-支架结构完整性是发挥人工组织功能的必然要求。从实验室到手术室，组织工程构建物的应用受到时空的限制。如果急诊手术能用到构建好的含活细胞的组织修复材料，则医学能为人类带来更大的福祉。为了满足非预定的活性组织修复材料需求，必须形成预先构建好的活性组织修复材料库存，形成库存则必须有恰当的保存方法，组织工程产业发展形成产品必须面对长期保存问题^[3]。

当细胞处于低温条件时，细胞内生化代谢会下降，这有利于延长保存时间^[4]。在浅低温(0 ℃以上)下，虽然细胞代谢下降，但仍存在代谢，需要持续供给培养液，这样会出现细胞老化、成本增加和污染概率增加等问题^[5]。自从1949年Ploge等^[6]发现甘油对精子细胞具有深低温保存特性，将细胞置入某种低温保存剂中冻结保存已成为传统的常规保存方法。但传统低温冻存中存在细胞内外冰晶形成、细胞内液浓缩、细胞渗透性体积改变等因素，会导致细胞结构破坏，细胞存活率低^[7]。

玻璃化低温保存是一种新的低温保存方法，玻璃化意指水在降温时因为玻璃化保存剂的存在，阻止了水分子结晶，在冰点以下形成类似玻璃一样的非结晶固态结构。在玻璃化状态下，生物大分子被未结晶的水分子和冻存保护剂分子包围，能长时间保持生物大分子的结构和功能，这是玻璃化低温保存得以实现的物理化学基础^[8]。通过玻璃化低温保存哺乳动物细胞，细胞内外无冰晶形成，避免了冰晶形成对细胞内细胞器和细胞膜结构的破坏^[9]，玻璃化低温保存已被成功应用于精子和卵子等单细胞结构的保存^[10]。

肌腱组织工程构建物是肌腱细胞和支架材料的结合物，在低温保存时，要求保存方法不能破坏肌腱细胞与支架之间的结合，而多项研究结果提示传统深低温容易破坏细胞-支架结构，细胞存活率低^[11]。为了提高肌腱细胞-支架复合物深低温保存后的细胞存活率，需要寻找更有效的深低温保存剂组配。

研究将二甲基硅氧烷制备的多孔支架与肌腱细胞共培养，利用二甲基硅氧烷良好的生物相容性、无荧光及可塑性等优点^[12]，旨在探索一种简单快速的玻璃化低温保存有效性检查方法，并研究一种新保存液对肌腱细胞-二甲基硅氧烷多孔支架培养复合物进行玻璃化低温保存。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照细胞观察实验。

1.2 时间及地点于2006年3月至2007年3月四川大学华西临床医学院完成。

1.3 材料 SD大鼠幼鼠(四川省医学科学院实验动物研究所)。二甲基硅氧烷材料(Sylgard 184 Dow Corning)；丙二醇、二甲亚砜、DMEM、F-12 Nutrient Mixture(Ham)、甲酰胺(Sigma)；LIVE/DEADKit for mammalian cells L-3224(Invitrogen)；小牛血清(Hyclone)；超低温冰箱、生物液氮罐、程控降温盒、流式细胞仪由四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室提供。

1.4 实验方法

1.4.1 配制低温保存液在各种玻璃化低温保存液中，VS55已被广泛使用于人体软骨^[13]、构建血管和人工胰腺的低温保存^[14-15]。

VS55配制方法：无菌条件下将还原型谷胱甘肽、Hepes加入2倍浓度的Eurocollins液中，过滤后在4 ℃预冷，再将丙二醇和甲酰胺、二甲亚砜加入。混合并用锡箔纸包裹避光，-20 ℃密封存储备用。

21%二甲亚砜保存液的配制：将2.69 mol/L二甲亚砜、200 mL胎牛血清、600 mL DMEM-F12混合培养基、 0.001 5 mol/L还原型谷胱甘肽混合，使二甲亚砜的最终质量浓度为21.0 g/L，还原型谷胱甘肽的最终质量浓度为 0.46 g/L。

10%二甲亚砜保存液的配置：将21%二甲亚砜保存液中的二甲亚砜减量到10 g/L。

1.4.2 肌腱细胞的培养与接种采用SD大鼠幼鼠尾腱培养分离出原代肌腱细胞^[16]。将细胞浓度为0.5×10¹⁰ L^-1的肌腱细胞悬液接种于条状多孔二甲基硅氧烷材料上培养9-14 d，备用。

1.4.3 低温保存流程将细胞-支架复合物分3组保存

VS55组：使用0 ℃的Euro-collins液中预先冷却 10 min(冰水混合物控温，在8根培养物/孔的六孔板内，每孔添加3 mL Euro-collins液)^[17]。玻璃化保存液在4 ℃冰箱内调温后滴加入孔板内(沿孔壁)，滴加速度1 mL/30 s并平衡1.5 min，同时在滴加点的对侧抽取保存液，以保持整个六孔板内液体量不变。在30 min内将玻璃化保存液的浓度调整到接近100%，然后将肌腱细胞-二甲基硅氧烷复合物放入冻存管，在冻存管内预先存留全浓度保存液。冻存管在投入-196 ℃液氮保存前，先在在4 ℃平衡10 min。所有样本冻存24 h以上。复温方法：冻存管自液氮中取出后，直接37 ℃水浴复温。变透明后立即用4 ℃的10%甘露醇Euro-collins稀释玻璃化保存液，DMEM-F12混合培养液稀释10%甘露醇Euro-collins液，整个流程在30 min内完成。最后用体积分数10%胎牛血清+DMEM-F12混合培养基恢复培养培养1 h。

21%二甲亚砜、10%二甲亚砜组：保存液添加方法和保存液洗脱方法与VS55组基本相同，但导入和洗脱时间控制在20 min完成，恢复培养方法同VS55组。21%二甲亚砜、10%二甲亚砜组的降温方法：冻存管存放入降温盒内在 -80 ℃ 低温冰箱内缓慢降温80 min，然后投入-196 ℃液氮。3组复温方法相同。

1.5 主要观察指标

荧光形态分析和玻璃化保存存活率分析：将复苏后恢复培养1 h的细胞-二甲基硅氧烷支架复合物用D-PBS洗涤1次。参照LIVE/DEAD^® Kit试剂盒使用方法对标本荧光染色^[18]。形态分析标本用生物荧光显微镜以蓝、绿激发光观察细胞。image-pro plus 5.02软件合成双色荧光图像。细胞存活率分析标本用TNE消化获取细胞悬液，以对照组为参照设门，进行双色荧光流式细胞检查。以未经历保存和复苏的新鲜肌腱细胞-二甲基硅氧烷支架复合物消化离心，制成细胞悬液 (1 mL)，设对照组回收细胞量为基数，显微镜下计数板计数。

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件录入数据和分析。数据以x(_)±s表示，采用方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

深低温保存是由常温到低温(5-0℃)，再到深低温(-196 ℃)的过程及相反的升温过程，短时间内，5-0 ℃对细胞仅造成轻微损伤。常温下，细胞生理活动在细胞内的脂膜系统区隔下完成。温度变低会引起细胞膜脂相变，进而导致细胞膜完整性破坏，细胞通透性改变。原本被区隔的离子自由穿透膜系统，导致细胞水肿、酸中毒、自由基损伤，最严重的会导致细胞骨架破坏^[19]。因为糖类不易透过细胞膜，将较高浓度的糖类Collins加入磷酸缓冲液中，得到了Euro-Collins液，这种液体能抑制细胞肿胀和低温损伤^[20]。在Euro-Collins液的基础性上添加多种冻存保护剂，得到VS55玻璃化保存液。研究用Euro-Collins液作为梯度添加玻璃化冻存剂量过程中的保护液，并在Euro-Collins液中加入10%甘露醇，作为复苏后的冻存剂洗脱液^[21]。

玻璃化低温保存得以实现的前提是冻存剂必须达到较高的浓度，“单纯的二甲亚砜水溶液在15 ℃/min的降温速率要求达到45%(w/v)才能实现玻璃化”^[22]。VS55玻璃化保存液的质量百分比更是达到55%，在接近室温时，玻璃化保存液对细胞的毒性很大，并且毒性与暴露时间、暴露温度呈正相关^[23]。降低玻璃化保存液对细胞的毒性，要求导入过程在0 ℃进行。

冻存保护剂从细胞外迁移进入内时间的长短可用渗透性来评价，某种冻存保护剂的渗透性低，会导致细胞膜内外较大的渗透压差，进而导致细胞皱缩、体积变小。较低渗透性要求较长的渗透平衡时间，细胞暴露在常温冻存剂中的时间延长，导致冻存剂的细胞毒性。因此优化冻存剂浓度-温度-暴露时间是寻找成功的细胞冻存流程的重要内容。细胞皱缩现象在黏附细胞和悬浮细胞暴露于高浓度的CPA溶液时都被观察到。在冻存剂洗脱过程中，细胞外冻存剂浓度变快会导致细胞膨胀，进而导致细胞破坏。多梯度导入和洗脱冻存剂能有效减轻细胞体积变化^[24]。研究采用慢速连续的方式导入和洗脱冻存剂，有效避免了细胞体积过度变化。细胞在玻璃化低温保存过程中的体积改变，可能会在细胞-支架界面产生张力，进而导致细胞结构破坏。从各组荧光染色流式细胞分析都检测到大量低荧光颗粒，代表细胞结构破坏产生的细胞碎片。

大量实验已证明，玻璃化低温保存能获得更高的细胞存活率^[25]。玻璃化低温保存主要是避免了水在降温过程中形成冰晶^[26]。传统冻存条件下，过快降温会导致细胞内液冻结，过慢降温会因细胞外液冻结浓缩导致细胞脱水、细胞内液浓缩，损伤细胞器结构。只有合适的降温速度才能得到较高的细胞存活。实验中，传统低温冻存组(10%二甲亚砜)不是玻璃化保存，由于冻存过程对细胞黏附和结构的破坏，未能获得足量细胞进行细胞计数和流式细胞检测。VS55组肌腱细胞-二甲基硅氧烷支架复物经历降温复温，玻璃化冻存济添加和洗脱，获得了较高的的活细胞细胞回收率和存活率。通过提高二甲亚砜的浓度，21%二甲亚砜可在降温时得到玻璃化形态^[27]。21%二甲亚砜组获得了更高的细胞回收率和细胞存活率，可能基于用了连续滴注导入和洗脱保存液，并采用了两步梯度降温，相较VS55有更低的浓度，导入和洗脱时间较短，结果是细胞毒性较低，渗透损伤和体积变化较小。

组织工程构建物是细胞和材料形成的整体，细胞通过表面受体与材料表面结合，材料的空间拓扑形态对细胞粘附形态存在调控作用。不同细胞形态具有不同的细胞表面积、细胞尺度和黏附面积，细胞材料复合物经历玻璃化冻存后，影响细胞存活的因素，除了冻存保护剂种类和操作流程外，细胞黏附形态也是其中非常重要的影响因素^[28]。肌腱细胞黏附于支架表面，呈现多种黏附形态，主要有椭球形、梭状和铺展的片状，每种黏附形态在面对低温保存全流程时，表现出不同的耐受能力^[29]。铺展的片状拥有最大的细胞表面积和与支架最大的黏附接触面积，细胞变形能力差；椭球形细胞有最小的表面积，具有最大的变形能力，能够耐受低温保存流程中的细胞膨胀收缩。VS55玻璃化保存肌腱细胞-二甲基硅氧烷支架复合物经历恢复培养 1 h的荧光染色显示，肌腱细胞呈现椭球形、梭形及铺展片状形态，细胞单独与材料表面黏附，无细胞间相互影响，经过完全相同操作流程后，细胞出现不同的结局，铺展的死亡细胞，梭形细胞保存存活。

相较传统的冻存法，肌腱细胞-二甲基硅氧烷支架复合物通过玻璃化低温保存能获得更高的细胞回收率和存活率。研究采用21%二甲亚砜玻璃化冻存剂配方，配合简单地程控降温和梯度导入导出，表现出比VS55玻璃化保存液更优的保存效果。细胞在材料表面的黏附形态可能影响保存结果，需要进一步深入研究。组织工程肌腱的构建如培养时间、生物材料类型、表面分子修饰、应力培养等因素可作为控制肌腱细胞形态和肌腱结构的方法，并最终影响低温保存结果。

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